Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

La modélisation de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) en laboratoire est rendue particulièrement difficile en raison de la nature extrêmement sporadique de plus de 80 % des ^cas1, associée au grand nombre de mutations génétiques connues pour être à l’origine de la ^maladie2. Malgré cela, tous les cas de SLA partagent la caractéristique unificatrice qu’avant la dégénérescence neuronale pure et simple, il existe une communication dysfonctionnelle entre les motoneurones présynaptiques et les cellules musculaires postsynaptiques3,4. Cliniquement, à mesure que les patients perdent la connectivité des motoneurones supérieurs et inférieurs restants, ils présentent des caractéristiques d’hyper- et d’hypoexcitabilité neuronale tout au long de la ^{maladie5,6,7,8,9}, reflétant des changements moléculaires sous-jacents complexes à ces synapses, que nous, en tant que chercheurs sur la SLA, cherchons à comprendre.

Plusieurs modèles transgéniques ont montré que la détérioration et la désorganisation de la jonction neuromusculaire se produisent avec l’expression de mutations génétiques responsables de la SLA, y compris ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 et TDP4317,18,19 par des évaluations morphologiques, y compris l’évaluation des boutons synaptiques, des densités de la colonne vertébrale et de l’organisation pré/postsynaptique. Mécaniquement, depuis les articles historiques de Cole, Hodgkin et Huxley dans les années 1930, il a également été possible d’évaluer les réponses synaptiques grâce à des techniques électrophysiologiques dans des cultures cellulaires in vitro ou des préparations de tranches de ^tissu20. Grâce à ces stratégies, de nombreux modèles de SLA ont démontré des déficits de transmission synaptique. Par exemple, une variante mutante de TDP43 améliore la fréquence de tir et diminue le seuil de potentiel d’action dans les cellules de type moteur-neurone NSC-34 (moelle épinière x neuroblastome hybride lignée 34)²¹. Cette même variante provoque également une transmission synaptique dysfonctionnelle à la jonction neuromusculaire (NMJ) avant l’apparition de déficits moteurs comportementaux chez un modèle ^murin22. Il a déjà été démontré que l’expression mutante de FUS entraîne une réduction de la transmission synaptique au NMJ dans un modèle de drosophile de FUS-ALS avant les défauts locomoteurs11. Un rapport récent utilisant des cellules souches pluripotentes induites dérivées de porteurs d’expansion C9orf72 a révélé une réduction du pool facilement libérable de vésicules ^{synaptiques23}. Dans l’ensemble, ces études et d’autres soulignent l’importance d’acquérir une compréhension plus complète des mécanismes sous-jacents à la signalisation synaptique dans les modèles de SLA pertinents pour la maladie. Cela sera essentiel pour comprendre la pathobiologie de la SLA et développer des cibles thérapeutiques potentielles pour les patients.

Les méthodes de serrage du courant et de la tension ont été inestimables pour déterminer les propriétés de la membrane telles que la conductance, le potentiel de la membrane au repos et le contenu quantifial des synapses ^{individuelles20,24}. Cependant, l’une des limites importantes de l’électrophysiologie est qu’elle est techniquement difficile et ne fournit des informations qu’à partir d’un seul neurone à la fois. La microscopie confocale à cellules vivantes, associée à des sondes fluorescentes spécifiques, offre la possibilité d’étudier la transmission synaptique des neurones de manière spatio-temporelle25,26,27. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une mesure directe de l’excitabilité neuronale, cette approche de fluorescence peut fournir une mesure relative de deux corrélations moléculaires de la fonction synaptique: la libération de vésicules synaptiques et les transitoires calciques aux terminaux synaptiques.

Lorsqu’un potentiel d’action atteint la région terminale présynaptique des neurones, des transitoires calciques sont déclenchés, facilitant la transition d’un signal électrique au processus de libération de ^{neurotransmetteurs28}. Les canaux calciques voltage-dépendants localisés dans ces zones régulent étroitement la signalisation du calcium pour moduler la cinétique de libération de neurotransmetteurs29. Les premiers enregistrements basés sur la fluorescence des transitoires de calcium ont été effectués à l’aide de l’indicateur à double longueur d’onde Fura-2 AM ou du colorant à longueur d’onde unique Fluo-3 AM30,31,32. Bien que ces colorants aient offert de nouvelles perspectives à l’époque, ils souffrent de plusieurs limitations telles que le compartimentage non spécifique au sein des cellules, la perte de colorant actif ou passif des cellules marquées, le photoblanchiment et la toxicité s’ils sont imagés sur de longues périodes de ^temps33. Au cours de la dernière décennie, les indicateurs de calcium génétiquement codés sont devenus les chevaux de bataille pour l’imagerie de diverses formes d’activité neuronale. Ces indicateurs combinent une protéine fluorescente modifiée avec une protéine chélateur de calcium qui change rapidement d’intensité de fluorescence après la liaison des ions ^Ca2+34. L’application de ces nouveaux indicateurs est vaste, permettant une visualisation beaucoup plus facile des transitoires de calcium intracellulaires à la fois in vitro et in vivo. Une famille de ces rapporteurs génétiquement codés, connue sous le nom de GCaMP, est maintenant largement utilisée. Ces indicateurs contiennent un domaine de calmoduline C-terminal, suivi d’une protéine fluorescente verte (GFP), et sont coiffés d’une région de liaison à la calmoduline ^{N-terminale35,36}. La liaison du calcium au domaine de la calmoduline déclenche une interaction avec la région de liaison à la calmoduline, entraînant un changement conformationnel de la structure protéique globale et une augmentation substantielle de la fluorescence de la fraction ^GFP35,36. Au fil des ans, cette famille de rapporteurs a subi plusieurs évolutions pour permettre des lectures distinctes pour des transitoires de calcium particuliers avec une cinétique spécifique (lente, moyenne et rapide), chacune avec des propriétés légèrement ^{différentes37,38}. Ici, l’utilisation du rapporteur GcaMP6 a été mise en évidence, qui a déjà été montré pour détecter les potentiels d’action unique et les transitoires de calcium dendritique dans les neurones à la fois in vivo et in ^vitro37.

Les transitoires calciques dans la région présynaptique déclenchent des événements de fusion des vésicules synaptiques, provoquant la libération de neurotransmetteurs dans la synapse et l’initiation d’événements de signalisation dans la cellule postsynaptique28,39. Les vésicules synaptiques sont à la fois rapidement libérées et recyclées, car la cellule maintient homéostatiquement une surface de membrane cellulaire stable et un pool facilement libérable de vésicules membranaires capables de ^fusion40. Le colorant styryl utilisé ici a une affinité pour les membranes lipidiques et modifie spécifiquement ses propriétés d’émission en fonction de l’ordre de l’environnement lipidique ^{environnant41,42}. C’est donc un outil idéal pour marquer les vésicules synaptiques de recyclage et le suivi ultérieur de ces vésicules telles qu’elles sont libérées plus tard après une stimulation ^{neuronale41,42}. Le protocole qui a été généré et optimisé est une adaptation des concepts décrits initialement par Gaffield et ses collègues, ce qui nous permet de visualiser en continu les puncta de vésicules synaptiques marquées par un colorant styryl au fil du ^temps41.

Ici, deux méthodologies connexes basées sur la fluorescence sont décrites, rapportant de manière fiable des événements cellulaires spécifiques impliqués dans la transmission synaptique. Des protocoles ont été définis pour sonder la dynamique de l’afflux de calcium terminal présynaptique médié par la dépolarisation et de l’exocytose des vésicules synaptiques dans les neurones en culture. Ici, les méthodes et les résultats représentatifs sont axés sur l’utilisation de corticaux ou de motoneurones primaires de rongeurs comme système de modèle in vitro, car il existe des études publiées utilisant ces types de ^{cellules43,44}. Cependant, ces méthodes sont également applicables aux neurones corticaux ⁱ³ humains ^{différenciés45}, car nous avons également eu du succès avec les deux protocoles dans l’expérimentation actuellement en cours dans notre laboratoire. Le protocole général est décrit dans un format linéaire par étapes, illustré à la figure 1. En bref, pour étudier la dynamique du calcium dans les neurites, les neurones matures sont transfectés avec de l’ADN plasmidique pour exprimer le rapporteur fluorescent GCaMP6m sous un promoteur de cytomégalovirus (CMV)^37,46. Les cellules transfectées ont un faible niveau de fluorescence vert basal, ce qui augmente en présence de calcium. Les régions d’intérêt sont spécifiées pour surveiller les changements de fluorescence tout au long de notre manipulation. Cela permet de mesurer des fluctuations de calcium très localisées dans l’espace et dans le ^temps37,46. Pour évaluer la fusion et la libération des vésicules synaptiques, les neurones matures sont chargés de colorant styryl incorporé dans les membranes des vésicules synaptiques au fur et à mesure qu’ils sont recyclés, reformés et rechargés en neurotransmetteurs dans les cellules présynaptiques41,42,43,47,48. Les colorants actuels utilisés à cette fin marquent les vésicules synaptiques le long des neurites et sont utilisés comme proxy pour ces régions dans des expériences d’imagerie en direct, comme l’ont montré la co-coloration du colorant styryl et de la synaptotagmine par Kraszewski et ses ^collègues49. Sont incluses ici des images représentatives de taches similaires qui ont également été effectuées (Figure 2A). Des chercheurs antérieurs ont largement utilisé ces colorants pour rapporter la dynamique des vésicules synaptiques à la jonction neuromusculaire et aux neurones de l’hippocampe48,49,50,51,52,53,54,55,56 . En sélectionnant les régions ponctuées des vésicules chargées de colorant et en surveillant les diminutions de l’intensité de fluorescence après la libération des vésicules, la capacité de transmission synaptique fonctionnelle et la dynamique temporelle de libération peuvent être étudiées après ^{stimulation43}. Pour les deux méthodes, un milieu contenant une forte concentration de chlorure de potassium est utilisé pour dépolariser les cellules afin d’imiter l’activité neuronale. Les paramètres d’imagerie sont spécifiés pour capturer des intervalles inférieurs à la seconde couvrant une normalisation de base suivie de notre période de capture de stimulation. Les mesures de fluorescence à chaque point temporel sont déterminées, normalisées à l’arrière-plan et quantifiées au cours de la période expérimentale. L’augmentation de la fluorescence GCaMP6m médiée par l’afflux de calcium ou la diminution efficace de l’exocytose de la vésicule synaptique par la libération de colorant styryl peut être détectée grâce à cette stratégie. La configuration méthodologique détaillée et les paramètres de ces deux protocoles ainsi qu’une discussion sur leurs avantages et leurs limites sont décrits ci-dessous.

Figure 1 : Rendu visuel de l’ensemble du processus général du protocole. (1) Isoler et cultiver les neurones primaires des rongeurs in vitro jusqu’au point de temps de maturation choisi. (2) Introduire l’ADN GCaMP ou le colorant styryl comme rapporteurs de l’activité synaptique. (3) Configurer le paradigme de l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal équipé d’imagerie en direct et du logiciel associé. Commencez la période d’enregistrement de référence. (4) Pendant que les cellules subissent encore une capture d’images en direct, stimulez les neurones via une perfusion de bain KCl élevée. (5) Évaluer les mesures d’intensité de fluorescence au fil du temps pour mesurer les transitoires calciques ou la fusion des vésicules synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Toutes les procédures animales effectuées dans le cadre de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Jefferson.

1. Culture primaire de neurones du cortex embryonnaire du rat

REMARQUE: Les neurones corticaux primaires sont isolés à partir d’embryons de rats E17.5 comme décrit ^{précédemment57,58}. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

1. Euthanasier les femelles gravides par inhalation de _CO2 suivie d’une confirmation secondaire par luxation cervicale.
2. Récoltez des embryons et isolez les cerveaux dans une solution saline équilibrée (HBSS) de Hank tamponnée hePES glacée de 20 mM. De la coquille externe du cortex, séparez puis jetez le striatum et l’hippocampe. Collectez les cortices.
3. Utilisez des pinces fines pour enlever les méninges des cortex. Pour ce faire, maintenez le cortex en place avec une paire de pinces fermées en utilisant une légère pression.
   REMARQUE: Avec la deuxième paire de pinces dans la trotteuse, pincez les méninges. Pelez les méninges en utilisant un mouvement de roulement avec une paire pincée. Repositionnez avec les pinces fermées et répétez si nécessaire jusqu’à ce que les méninges soient entièrement enlevées.
4. Incuber des cortices avec 10 μg/mL de papaïne dans hbSS pendant 4 min à 37 °C.
5. Laver trois fois dans HBSS, puis triturer doucement 5 à 10 fois avec une pipette Pasteur en verre poli au feu pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
   REMARQUE: Évitez les bulles; maintenir la pipette dans la suspension de la cellule.
6. Neurones de plaque sur des boîtes de 100 μg/mL recouvertes de poly-D-lysine à fond de verre de 35 mm à une densité de 75 000 cellules/plat en milieu neurobasal avec supplément de B27 (2%) et pénicilline-streptomycine.

2. Culture primaire de motoneurones de la moelle épinière embryonnaire de rat

REMARQUE: Les motoneurones primaires sont préparés à partir d’embryons de rats E13.5 comme décrit précédemment, avec peu de ^{modifications59,60}. Aucun biais de souche ne semble exister avec le succès de ce protocole de culture. Cette méthode est décrite brièvement ci-dessous. Les articles précédents indiqués doivent être référencés pour plus de détails.

1. Euthanasier les rates femelles gravides comme à l’étape 1.1.
2. Disséquez 10 à 20 moelles épinières d’embryons et divisez en petits fragments mécaniquement à l’aide de deux paires de pinces pour pincer et tirer, respectivement.
3. Incuber dans 0,025% de trypsine pendant 8 min, suivi de l’ajout de DNase à 1 mg / mL.
4. Centrifuger à travers un coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans rupture.
5. Centrifuger les cellules granulées pendant 55 min à 830 x g à 4 °C sans frein à travers un coussin de gradient de densité de 10,4 % (v/v) (voir Tableau des matériaux). Portez la bande de motoneurones vers l’avant à l’interface visuelle.
   REMARQUE: Pour assurer la capture de toutes les cellules, utilisez des milieux sans phénol pour l’étape de gradient de densité et des milieux contenant du phénol pour toutes les autres étapes. L’interface du gradient de densité et du support de dissociation est facilement identifiable en fonction de la différence de couleur.
6. Faites tourner les bandes collectées à travers un autre coussin BSA de 4 % p/v à 470 x g pendant 5 min à 4 °C sans pause.
7. Remettre en suspension les motoneurones purifiés en milieu neurobasal complet avec un supplément de B27 (2%), de la glutamine (0,25%), du 2-mercaptoéthanol (0,1%), du sérum de cheval (2%) et de la pénicilline-streptomycine.
8. Neurones de plaque sur 100 μg/mL de poly-lysine et 3 μg/mL de couvercles recouverts de laminine à une densité de 50 000 cellules/plat à fond de verre de 35 mm.

3. Transfections neuronales

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour les neurones qui subiront une imagerie calcique GCaMP et / ou les neurones dans lesquels un plasmide d’ADN exogène ou un ARN d’intérêt est introduit avant l’évaluation synaptique. En revanche, le colorant styryl est chargé juste avant la séance d’imagerie et est traité à la section 6. Le résumé ci-dessous est le protocole de transfection utilisé pour les neurones primaires des rongeurs dans les exemples présentés, mais il peut facilement être adapté et optimisé aux besoins de l’utilisateur.

1. Les transfections des neurones corticaux primaires en culture se produisent au jour 12 in vitro (DIV 12), tandis que les motoneurones sont transfectés au jour 7 in vitro (DIV 7).
   REMARQUE: Toutes les étapes suivantes se produisent dans une armoire de biosécurité aseptique.
2. Transfect 500 ng de GCaMP6m en utilisant un réactif de transfection à un rapport de 1:2 en volume. Pour les co-transfections, ajoutez un total de 1,25 μg d’ADN total / plat, en maintenant ce rapport ADN / réactif.
   NOTE: Dans les exemples expérimentaux montrés, 750 ng de plasmide d’intérêt lié à la SLA / FTD ont été transfectés pour exprimer des dipeptides liés à la SLA C9orf72, une protéine FUS mutante, etc. Assurez-vous que l’étiquette fluorescente du plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal FITC de l’imagerie GCaMP. De même, si vous effectuez une imagerie de colorant styryl, assurez-vous que le plasmide co-transfecté n’entrera pas en conflit avec le canal d’imagerie TRITC. L’utilisation de la synaptophysine-GCaMP3 est tout aussi efficace dans ce protocole. Par conséquent, transfectez la même quantité de ce plasmide et suivez toutes les étapes comme d’habitude dans la section 7.
3. Incuber le complexe de réactif de transfection ADN à température ambiante pendant 10 min.
4. Ajoutez doucement le complexe incubé aux neurones goutte à goutte avec tourbillon. Remettre le plat dans l’incubateur à _CO2 à 37 °C pendant 45-60 min.
5. Retirer tout le milieu de culture contenant le complexe de réactif de transfection ADN et le remplacer par une préparation de 50 à 50 par volume de milieux neuronaux préconditionnés et frais. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur à _CO2 pendant 48 h jusqu’à l’imagerie.

4. Préparation de solutions tampons et de solution mère de colorant styryl

1. Préparer des solutions de CSF faible et élevée fraîches avant l’imagerie à l’aide des ingrédients énumérés dans le tableau 1. Filtrez les deux solutions tampons avant utilisation.
   REMARQUE: _CaCl2 dihydraté peut former Ca(OH)₂ lors du stockage. Pour une efficacité maximale, utilisez toujours un récipient récemment ouvert. Si cela n’est pas possible, pour éliminer le Ca(OH)₂ de la surface externe et assurer une solubilité maximale, les solutions peuvent être gazéifiées avec du _CO2 gazeux pendant 5 min avant l’ajout de _CaCl2 . Si cette étape est franchie, ajustez le pH de la solution résultante pour maintenir une valeur de pH de 7,4, car une carbonatation excessive entraînera la formation de Ca(_HCO3)₂ .

Tableau 1 : Composition des tampons du liquide céphalo-rachidien artificiel (CSPa). Ce tableau comprend les ingrédients pour préparer des tampons de liquide céphalorachidien artificiel faible et élevé en KCl utilisés lors de l’imagerie et de la stimulation des neurones. Voir rubrique 4 pour les instructions de préparation.

2. Préparer une solution mère de colorant styryl en prenant un flacon de 100 μg de colorant et en le reconstituant à une concentration de 10 mM avec de l’eau distillée ou un milieu neurobasal.

5. Configuration du microscope et du système de perfusion

REMARQUE: Pour l’imagerie des boîtes de Petri à fond de verre, un microscope à fluorescence confocale inversée est préféré en raison de la flexibilité de la perfusion et de l’utilisation d’un objectif d’immersion dans l’huile à grande ouverture numérique. Reportez-vous à la Table des matériaux pour le microscope confocal, la caméra et les objectifs utilisés pour l’imagerie d’exemples détaillés dans la section Résultats représentatifs .

1. Effectuez toutes les expériences à 37 °C avec des niveaux constants de _CO2 de 5 % à l’aide d’un support d’étage couplé à un système d’incubateur.
2. Contrôlez l’acquisition d’images à l’aide d’un logiciel confocal. Optimisez les paramètres d’acquisition au début de la séance d’imagerie pour choisir la puissance d’excitation et le gain afin d’assurer une visualisation optimale des signaux sans photoblanchiment.
   1. Maintenez la puissance d’excitation, le temps d’exposition, le gain du détecteur et la fréquence d’images constants sur tous les échantillons. Effectuez une imagerie time-lapse en utilisant un rapport d’aspect de 512 x 512 et une fréquence d’images de 2 images / s pour minimiser le blanchiment de la teinture.
      REMARQUE: Bien que les ponctuations doivent être clairement visibles, l’intensité du laser doit être réglée au minimum possible pour éviter le blanchiment et la phototoxicité. Réglez l’ouverture confocale sur le réglage le plus étroit pour obtenir une résolution optimale des puncta fluorescents dans les neurites. Le temps d’exposition est réglé sur 200 ms ou moins, ce qui est cohérent entre les échantillons. La vitesse d’imagerie maximale de la caméra utilisée était de 2 images/s. Si vous utilisez un appareil photo plus rapide, plus d’images peuvent être prises. Les paramètres d’imagerie temporelle doivent être choisis si possible.
3. Sélectionnez les combinaisons de filtres d’excitation/dichroïque/émission de fluorescence suivantes pour l’imagerie à l’aide d’un logiciel confocal : Gcamp6m/Gcamp3 avec FITC et colorant styryl avec TRITC, respectivement.
4. Utilisez la fonction de mise au point parfaite du logiciel d’acquisition d’imagerie confocale pendant l’imagerie accélérée pour éviter la dérive z.
   REMARQUE: En raison de la vitesse rapide de l’imagerie, un seul plan est imagé. Il est très important de s’assurer de l’absence de dérive z pendant l’expérience.
5. Sélectionnez l’onglet Heure dans le panneau d’acquisition d’image pour définir les périodes et les intervalles d’enregistrement.
   1. Réglez la phase #1 sur Intervalle 500 ms, Durée 3 - 5 min.
   2. Réglez la phase #2 sur Intervalle 500 ms, Durée 5 min.
      REMARQUE: La phase #1 correspond à l’enregistrement de base, la phase #2 à la période de stimulation, respectivement.
6. Assemblez un appareil de perfusion par gravité pour aCSF à l’aide d’un système de commande de vanne et d’un collecteur de canaux.
   1. Chargez un KCl élevé (voir tableau 1) dans une seringue de 50 mL située au sommet de l’appareil, avec des tubes traversant le système. Réglez le débit sur 1 mL/min.
7. Chargez une boîte en verre de 35 mm contenant des neurones sur l’étage d’imagerie confocale, avec l’extrémité du tube de perfusion placée au bord de la boîte. Choisissez le champ d’imagerie.

6. Imagerie par colorant styryl de la libération des vésicules synaptiques

1. Incuber des cellules dans un CSAf à faible KCl (voir tableau 1) pendant 10 min à 37 °C, 48 h après la transfection.
2. Chargez les neurones corticaux ou moteurs primaires sur des boîtes de Petri à fond de verre avec un colorant styryl.
   1. Éliminer le KCl aCSF faible par aspiration.
   2. Utilisez une pipette pour charger les neurones dans l’obscurité avec 10 μM de colorant styryl dans un CSF contenant 50 mM de KCl pendant 5 min.
   3. Retirer la solution de charge et les neurones de bain dans un faible KCl aCSF pendant 10 minutes pour éliminer la charge de colorant non spécifique.
3. Placez la parabole à fond de verre de 35 mm sur la scène d’imagerie, puis observez soit sous un objectif d’air 20x, soit sous un objectif d’immersion dans l’huile 40x d’un microscope confocal inversé.
   REMARQUE: Utilisez la fluorescence GFP pour localiser les cellules transfectées dans le cas de cellules co-transfectées avec un plasmide marqué GFP.
4. Excitez le colorant styryl à l’aide d’un laser de 546 nm, collectez les émissions à l’aide d’un filtre passe-bande de 630-730 nm (TRITC).
5. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, triTC et marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
6. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement basal pendant 3 à 5 minutes pour exclure les variations d’intensité du colorant, le cas échéant (phase #1).
   REMARQUE: Il est essentiel de s’assurer que toute diminution de l’intensité du colorant est due à la libération de vésicules synaptiques et non à la diffusion passive du colorant ou au photoblanchiment. Cette période de pré-stimulation de 3 à 5 minutes devrait se traduire par un niveau d’intensité de colorant stable et maintenu. Les 30 dernières secondes de cet enregistrement seront utilisées pour déterminer une valeur de fluorescence de référence moyenne pour chaque retour sur investissement. Avant d’évaluer les conditions expérimentales, une condition supplémentaire de non-stimulation d’environ 10 minutes d’enregistrement continu à l’aide des paramètres d’acquisition prévus peut également être effectuée pour assurer des valeurs de fluorescence stables en utilisant les paramètres laser pendant une période prolongée.
7. Au passage à la phase #2, déclenchez le bouton du système de perfusion. Ensuite, perfuser constamment 50 mM KCl aux neurones pour faciliter le déchargement des colorants (Phase #2).
   1. Effectuer des enregistrements pendant 300 s après l’ajout de KCl. Après cela, l’acquisition s’arrête; déclencher l’interrupteur Off du système de perfusion.
8. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous.
   REMARQUE: L’expérience peut être arrêtée à ce stade et l’analyse peut être effectuée ultérieurement. Dans le cas où les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression de protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lorsque l’on cherche à examiner la fonctionnalité du déchargement synaptique. Après un test des cellules témoins pour assurer un déchargement synaptique approprié, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

7. Imagerie par fluorescence des transitoires calciques Gcamp6m

1. Transfecter les neurones corticaux primaires des rongeurs cultivés sur des boîtes à fond de verre de 35 mm avec 500 ng de Gcamp6m comme indiqué à la section 3.
   REMARQUE: Si vous le souhaitez, co-transfectez les neurones avec un plasmide d’intérêt contenant une étiquette fluorescente dans la gamme rouge ou rouge lointain.
2. Incuber les neurones avec un faible KCl aCSF pendant 15 min 48 h après la transfection, puis monter la parabole sur la plate-forme d’imagerie.
3. Visualisez la fluorescence GCaMP6m à l’aide d’un filtre FITC (488 nm) et d’un objectif 20x ou 40x.
4. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de champ lumineux, de FITC et de marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
5. Lancez Exécuter maintenant dans le logiciel d’acquisition. Effectuez l’enregistrement de base pendant 5 minutes, puis perfusez avec un CSF contenant 50 mM de KCL de la même manière que celle décrite à la section 6 pour les expériences de colorant styryl.
   NOTE: Le but de cette imagerie est de mesurer les transitoires de calcium évoqués. Si un neurone a une activité de déclenchement basale et des flux de calcium pendant la période de pré-stimulation, il n’est pas utilisé dans l’analyse des données. Au lieu de cela, seules les cellules avec une fluorescence de fond stable sont utilisées. Les périodes post-stimulation peuvent également être prolongées jusqu’à 60 minutes pour les transitoires de calcium, avec ou sans perfusion continue supplémentaire de KCl élevé.
6. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal comme décrit dans la section 8 ci-dessous. L’expérience peut être arrêtée à ce stade, et l’analyse peut être effectuée plus tard.
   REMARQUE: Si les cellules ne nécessitent pas de transfection pour l’expression des protéines d’intérêt, ce protocole peut être effectué à tout moment in vitro lors de l’examen des transitoires calciques. Après un test des cellules témoins pour assurer la mesure des transitoires de calcium, l’expérimentateur doit être aveuglé par les conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque plat testé afin de minimiser les biais.

8. Analyse d’images

1. Ouvrez des images time-lapse avec un logiciel confocal.
2. Aligner les images en série time-lapse par la série de commandes : Image | | de traitement Aligner le document actif. Sélectionnez Aligner sur la première image.
3. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection du retour sur investissement, une icône en forme de haricot à droite du cadre de l’image (Figure 3B). Marquez également un retour sur investissement représentant l’intensité de fluorescence de fond.
   REMARQUE: Les ROI sont sélectionnés en choisissant des zones de ponctuation distinctement séparées le long des pistes neuronales indiquées par l’image fixe en champ lumineux. Au moins cinq ROI par neurone sont choisis pour l’analyse. Le retour sur investissement d’arrière-plan est choisi dans une région du champ de vision qui ne contient pas de neurites.
4. Mesurez la fluorescence brute au fil du temps pour les rois sélectionnés à l’aide des séries de commandes suivantes : Mesurer | Mesure du temps.
   1. Lancez la fonction Mesure dans la partie supérieure du panneau Mesure du temps . Une représentation graphique de la fluorescence brute au fil du temps (Figure 3C) et des données quantitatives sont toutes deux générées.
      REMARQUE : Chaque point de données représente la fluorescence brute de ce retour sur investissement pour la trame associée à ce point de temps mesuré spécifique.
5. Exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur.
6. Analysez chaque retour sur investissement indépendamment. Tout d’abord, normalisez les données en soustrayant l’intensité du retour sur investissement de fond du retour sur investissement de l’intensité des intérêts à chaque point temporel.
   1. Prenez la valeur de fluorescence brute du retour sur investissement de fond à chaque point temporel spécifique et soustrayez-la de la valeur d’intensité brute du retour sur investissement d’intérêt à ce point temporel.
      REMARQUE: Ceci est fait pour toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
7. Déterminez le retour sur investissement moyen de l’intensité des intérêts pour les 30 dernières années de référence.
   1. Moyenne des valeurs basales brutes normalisées générées à l’étape 8,6 à partir des 30 dernières s de la période d’enregistrement basal de 3 à 5 minutes.
      REMARQUE: Toute la période d’enregistrement basal pourrait être utilisée pour générer cette valeur. Cependant, à mesure que cette valeur se stabilise et est maintenue, les 60 points temporels des 30 dernières s sont d’une taille d’échantillonnage suffisante pour représenter l’ensemble.
8. Comparez cette valeur de référence à la valeur d’intensité normalisée à chaque point temporel, générant un changement de la valeur de fluorescence (ΔF).
   1. Prenez la valeur de l’étape 8.7 et soustrayez la valeur fluorescente de base moyenne. Effectuez cette étape et les étapes suivantes pendant toute la période d’enregistrement, à la fois les phases basales et de stimulation.
9. Calculer ce changement concernant la valeur de fluorescence de base, générant un changement de fluorescence/fluorescence de base (ΔF/F). Pour ce faire, prenez la valeur de l’étape 8.8 et divisez-la par la valeur fluorescente de base moyenne.
10. Enfin, définissez la valeur du point de départ sur 1 afin que les augmentations ou les diminutions puissent être facilement visualisées graphiquement au fil du temps.
    1. Prenez la valeur générée à l’étape 8.9 et ajoutez 1.
       REMARQUE : Lorsque cela est fait correctement, les 30 s de valeurs de la période de référence doivent se situer près de la valeur de 1. Dans les cellules libérant efficacement du contenu synaptique, cette valeur devrait varier de 1 à 0 après le début de la stimulation. Un exemple des étapes 6 à 9 est présenté à la figure 3E.

9. Analyse des données

REMARQUE : L’expérimentateur peut être insensible aux conditions expérimentales pour regrouper les données à des fins d’analyse appropriées. Utilisez une taille d’échantillon d’au moins 10 neurones par condition de chacune des trois expériences indépendantes. Ne considérez les neurones pour l’inclusion que si au moins cinq régions de retour sur investissement peuvent être désignées. Ce niveau de réplication expérimentale était suffisant dans les études publiées pour démontrer une perte profonde de déchargement synaptique dans les cellules contenant des poly-GA liées à la SLA par rapport aux témoins GFP (voir Résultats représentatifs). Toutefois, si un phénotype plus subtil est observé, le nombre de répliques biologiques et/ou techniques peut nécessiter une optimisation de la part de l’utilisateur.

1. En utilisant toutes les valeurs ΔF/F calculées au fil du temps à partir des ROI d’une condition expérimentale donnée, déterminez une valeur moyenne ΔF/F pour chaque point temporel avec un MEB.
2. Tracez les données à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques au format xy, où x est le temps écoulé et y est la valeur ΔF/F calculée à l’étape 9.1. Présentez toutes les valeurs sous forme de moyenne ± SEM.
3. Pour déterminer la signification statistique, utilisez le test t de Student pour comparer deux groupes et l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivi de l’analyse posthoc de Tukey pour comparer trois groupes ou plus.

Après la mise en œuvre réussie du protocole ci-dessus, des résultats représentatifs sont présentés pour une expérience typique de libération de vésicules synaptiques de colorant styryl. Les neurones corticaux primaires de rats cultivés ont été chargés de colorant à l’aide de la méthode décrite à la rubrique 6. La spécificité de la charge en colorant a été déterminée par co-marquage avec la synaptophysine, marqueur de vésicule synaptique. La majorité des colorants de styryl positifs sont co-positifs pour ce marqueur (Figure 2A). Pour déterminer si les paramètres utilisés pour l’imagerie des colorants styryl provoquent un photoblanchiment, généralement, un puits non traité est chargé de colorant et imagé pendant une période prolongée de 10 minutes sans stimulation pour s’assurer que les valeurs de fluorescence restent constantes.

De plus, les résultats sont à nouveau présentés à l’aide du co-marquage de la synaptophysine et du colorant styryl comme dans la figure 2A. Ces fluorophores ont été co-imagés en utilisant le paradigme indiqué à la section 6 pour l’imagerie des colorants styryl triTC, plus une double capture de la fluorescence de la synaptophysine en utilisant une puissance laser de haute intensité sur le canal DAPI pour visualiser la mTurquoise-synaptophysine. On y voit des images représentatives des régions synaptiques avant et après la stimulation (figure 2B). Bien que cette méthode soit une inférence indirecte pour l’absence de photoblanchiment, l’analyse des valeurs d’intensité brute sur toute la période d’imagerie révèle que l’intensité de la synaptophysine reste constante, tandis que l’intensité du colorant styryl diminue après la stimulation (Figure 2C). Ainsi, en prenant cette expérience et nos autres contrôles de fluorescence stable avant la stimulation et sur de longues périodes dans des puits non stimulants, nous avons établi que les diminutions de la fluorescence du styryl peuvent être attribuées au déchargement synaptique par dépolarisation KCl plutôt qu’à des effets de photoblanchiment.

Figure 2 : Évaluation de la spécificité et des paramètres d’imagerie de l’étiquetage des colorants styryl. (A) Une image représentative 40x d’un neurone cortical de rat marqué par un colorant styryl (rouge), qui a été transfecté 24 heures auparavant avec un plasmide pour exprimer mTurquoise2-synaptophysine61 chassé du promoteur de synapsine (vert). La colocalisation de ces deux fluorophores indique qu’une grande majorité des puncta positifs au colorant styryl sont co-colorés avec la synaptophysine marqueur de la vésicule synaptique. La barre d’échelle indique 5 μm. (B) Les neurones corticaux ont été transfectés et le colorant styryl chargé comme dans (A) et imagé selon le paradigme du colorant styryl avec la double capture de fluorescence de la mTurquoise-synaptophysine sur le canal DAPI. Des images représentatives montrent les régions de synaptophysine et de colorant styryl puncta avant et après la stimulation. La barre d’échelle indique 5 μm. (C) La fluorescence a été surveillée au fil du temps pour la synaptophysine (canal DAPI supérieur) et le colorant styryl (canal FITC inférieur). L’intensité de la synaptophysine a été maintenue à une fluorescence constante pendant la période d’imagerie et de stimulation, tandis que la fluorescence du colorant styryl a diminué à mesure que le colorant était déchargé lors de la stimulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des images représentatives montrent le chargement du colorant styryl pendant l’imagerie, avec la sélection des ROI (Figure 3A-B). L’intensité de fluorescence brute des ROI sélectionnés et un retour sur investissement de fond sont tracés à l’aide du logiciel confocal (Figure 3C). Les neurones montrés ici ont également été transfectés avec des plasmides pour étudier les effets des protéines dipeptides produites dans le contexte de C9ORF72-ALS, à savoir FLAG-eGFP et FLAG-GA50-eGFP chassés du promoteur T7. La libération réussie des vésicules synaptiques entraîne une perte frappante de fluorescence du colorant lors d’une dépolarisation élevée du KCl (Figure 3D, deux panneaux supérieurs) pour un neurone témoin transfecté par GFP. Une vidéo représentative incluse ici montre comment cela apparaît pendant l’imagerie. De plus, un neurone décharge sélectivement le colorant styryl dans une région de neurite après stimulation (vidéo 1).

D’autre part, l’altération de la transmission synaptique est représentée par la fluorescence de colorant retenue même après une dépolarisation élevée de KCl dans les neurones transfectés avec une construction de répétition de dipeptide liée à C9ORF72 (GA50) (Figure 3D, deux panneaux inférieurs)43. Après l’analyse quantitative des données (figure 3E), les données sont représentées sous forme d’intensité du colorant tout au long de l’imagerie pour les groupes témoin (GFP) et ALS/FTD (GA50) (Figure 3F)43. Cette méthode peut également analyser les effets intermédiaires et n’est pas simplement une mesure binaire « tout ou rien ». Dans des expériences conçues pour sauver les déficits synaptiques médiés par GA50, la protéine 2 associée aux vésicules synaptiques exogènes (SV2) a été introduite par transduction lentivirale à l’aide du plasmide rSV2a-eGFP-pRRL chassé du promoteur PGK humain. Après l’imagerie et l’analyse décrites ci-dessus, le déclenchement synaptique a été sauvé dans les neurones co-exprimant GA50 et SV2 (Figure 3G).

Figure 3 : Évaluation de la libération de vésicules synaptiques par marquage de colorant styryl. (A) Image représentative 40x d’un neurone marqué par un colorant styryl dans un milieu à faible KCl aCSF au début d’une expérience d’imagerie. La barre d’échelle indique 20 μm. (B) Représentation de la génération de retour sur investissement sur l’image à partir de (A). Des régions de ponctuation spécifiques le long des neurites (#1-4) sont choisies à l’aide de l’outil ROI, le bouton en forme de haricot mis en évidence à droite. Un retour sur investissement final (#5) est sélectionné dans une région vide pour capturer l’intensité du signal d’arrière-plan. Les zones avec des points lumineux non spécifiques et non neuronaux sont évitées. La barre d’échelle indique 20 μm. (C) Représentation des intensités de signal pour les ROI #1-5 de (B) au fil du temps sous forme de graphique/représentée par un logiciel confocal. (D) Représentations visuelles des régions ROI pré/post-stimulation pour un neurone qui subit efficacement une transmission synaptique (deux panneaux supérieurs). Les deux panneaux inférieurs sont des images agrandies avec un seuil impartial appliqué pour isoler puncta de l’arrière-plan afin de montrer visuellement des régions distinctes. Les neurones contenant du GFP subissent efficacement une libération synaptique, tandis que l’expression du peptide GA50 lié à la SLA C9ORF2 empêche cet effet. Les barres d’échelle indiquent 10 μm-Réimprimé de Jensen et al. 202043. (E) Exemple d’un fichier de quantification utilisant un tableur, montrant la normalisation des valeurs par rapport à la ligne de base et la génération de valeurs ΔF/F au fil du temps. Les données sont d’abord normalisées à la valeur d’intensité du retour sur investissement en arrière-plan à chaque point temporel. Cette valeur est ensuite comparée à la valeur de référence moyenne du roi d’intérêt pour les 30 dernières s pré-stimulation (présentée ici sous forme d’intervalles de 10 s en 1 s pour plus de simplicité) (ΔF). Ce changement est ensuite calculé comme une fraction de la fluorescence de base (ΔF/F). Enfin, la valeur du point de départ est définie sur 1 afin que les augmentations ou les diminutions puissent être facilement visualisées graphiquement au fil du temps. Au moins cinq régions de puncta par neurone et au moins dix neurones par condition expérimentale sont collectés, avec des données comme celle-ci combinées pour générer des mesures moyennes à chaque point temporel. (F) Les données d’un fichier de feuille de calcul tel que le point (E) sont déplacées dans un logiciel de graphiques et de statistiques. Pour le graphique présenté ici, la valeur ΔF/F à chaque point temporel moyennée sur toutes les régions puncta d’une condition expérimentale est tracée, ainsi que son erreur-type de la moyenne. Le graphique ici est constitué de données provenant des expériences GFP par rapport à GA50 indiquées en (D), où les 10 dernières s de la ligne de base et les 10 premières s de la période de stimulation sont montrées-réimprimées à partir de Jensen et al. 202043. (G) Ce test peut produire des courbes pour la libération synaptique intermédiaire et n’est pas simplement une réponse « tout ou rien ». GA50 a été co-exprimé avec la protéine synaptique exogène SV2 (protéine 2 associée aux vésicules synaptiques), et l’imagerie et l’analyse du colorant styryl ont été effectuées comme indiqué dans les étapes précédentes. Comme dans la figure 3F, le graphique présenté ici représente la valeur ΔF/F à chaque point temporel moyenné sur toutes les régions puncta d’une condition expérimentale, ainsi que son erreur type de la moyenne. Le graphique montre la dernière minute de la ligne de base et la première minute de la période de stimulation de Jensen et al. 202043. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Vidéo représentative de l’expérience d’imagerie du colorant styryl. Une vidéo représentative d’un neurone cortical chargé de colorant styryl est montrée. La vidéo montre la période commençant au moment de la perfusion du bain de KCl aCSF élevé. La région en boîte met en évidence les neurites, avec une perte observable de fluorescence puncta au fil du temps. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Selon la méthode décrite à la rubrique 7, on voit des images de fluorescence représentatives de neurones corticaux transfectés avec GcaMP6m avant et après la dépolarisation de KCl (Figure 4A). Les graphiques d’intensité brute montrent des valeurs de fluorescence accrues qui fluctuent, indiquant l’entrée du calcium dans les neurites après la dépolarisation induite par KCl (figure 4B). Cette deuxième vidéo représentative montre des neurones exprimant GcaMP6m avec une faible fluorescence à la fin de la période d’enregistrement de référence pour démontrer cet effet. Au début de la stimulation, les neurones affichent une augmentation spectaculaire de la fluorescence (Vidéo 2). Cette approche a été utilisée avec succès pour démontrer les altérations de l’entrée dans le calcium dans un modèle FUS-ALS mutant. Les astrocytes de ce modèle ont été transduis avec un adénovirus contenant des plasmides eGFP-FUS pilotés par le promoteur du CMV. Lorsque le milieu conditionné à partir d’astrocytes mutants exprimant fus a été placé sur les motoneurones, une augmentation de l’afflux de calcium a été observée par rapport aux conditions FUS non mutantes à la suite d’une stimulation de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) + cyclothiazide (Figure 4C)44. La sensibilité de ce test a été testée en effectuant des expériences avec et sans calcium inclus dans le milieu de perfusion. Dans le cadre de la GFP par rapport à l’AG50 mentionné ci-dessus, une augmentation des transitoires de calcium de pointe a été observée dans les motoneurones contenant du GA50 . Notamment, cela dépendait de l’entrée de calcium dans la cellule et non de la libération de réserves internes de calcium. Lorsque le calcium a été retiré du milieu stimulant du CSCa, aucune réponse transitoire du calcium n’a été observée dans l’une ou l’autre des conditions expérimentales (figure 4D)43.

Figure 4 : Observation des transitoires calciques en temps réel à l’aide de rapporteurs GCaMP. (A) Image 40x d’un neurone exprimant GCaMP6m, pseudo-coloré pour montrer l’intensité de la fluorescence GFP (faible en bleu à élevé en rouge). Les panneaux de gauche montrent l’ensemble du champ de vision 40x avant et après la stimulation. La barre d’échelle indique 20 μm. Les images à droite sont des versions agrandies des zones encadrées révélées. Grâce à ces images, il est évident à l’œil nu qu’il y a une forte augmentation des niveaux de calcium neuritique focal après la stimulation. La barre d’échelle indique 12 μm. (B) La sélection du retour sur investissement et la surveillance de l’intensité de fluorescence tout au long de l’expérience sont effectuées comme dans la figure 3. Les 30 dernières s de stimulation de base et 1 min pour deux ROI sélectionnés d’un neurone subissant une surveillance de fluorescence GCaMP6m sont montrées ici. Contrairement à l’imagerie par colorant styryl, l’intensité de fluorescence augmente après une stimulation neuronale. De plus, comme il est noté ici, les transitoires de calcium fluctuent dans les neurites au fil du temps; par conséquent, les résultats sont généralement représentés comme la valeur moyenne de changement de fluorescence normalisée de crête pour chaque région de retour sur investissement. (C) La quantification représentative d’une telle expérience est montrée, comme cela a été publié dans Kia-McAvoy et al. 201844, où les motoneurones primaires qui ont reçu un surnageant dérivé d’astrocytes FUS-ALS mutants ont montré un afflux significativement accru de calcium après la stimulation des récepteurs AMPA, par rapport aux neurones recevant un surnageant de type sauvage FUS exprimant des astrocytes. (D) Quantification représentative de l’imagerie transitoire du calcium où le calcium n’était pas inclus dans le CSA stimulant. Les conditions de mCherry par rapport à GA50-mCherry stimulées avec un ACSF KCl élevé avec ou sans calcium sont montrées, telles que publiées dans Jensen et al. 202043. Les neurones contenant du GA50 ont montré un afflux de calcium maximal accru par rapport aux cellules contenant du mCherry. Il n’y avait pas d’élévation des niveaux internes de calcium dans l’une ou l’autre condition expérimentale lorsque le calcium a été retiré de la stimulation d’un KCL aCSF élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 2 : Vidéo représentative de l’expérience GCaMP sur le transitoire de calcium. Une vidéo représentative d’un champ de neurones corticaux transfectés avec GCaMP6m est montrée. Après une période de référence, un afflux important de calcium est noté à la marque de 6 s lorsque le KCl aCSF élevé a été appliqué. L’entrée de calcium peut être mesurée soit pour la cellule entière, soit dans des régions de neurites spécifiques comme décrit. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau 2 : Problèmes possibles et dépannage pour les expériences sur les colorants styryl. Scénarios typiques pour les problèmes et le dépannage général pour les expériences de déchargement synaptique.

Tableau 3 : Problèmes possibles et dépannage pour l’imagerie des transitoires de calcium dans les neurites. Scénarios typiques pour les problèmes et le dépannage général pour les expériences de transitoire de calcium GCaMP.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.