Method Article

Logiciel d’acquisition de données convivial, à haut débit et entièrement automatisé pour la cryo-microscopie électronique à particule unique

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cryo-microscopie électronique à particule unique exige un progiciel approprié et un pipeline convivial pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Nous présentons ici l’application d’un logiciel d’acquisition d’images entièrement automatisé, Latitude-S, et un pipeline pratique pour la collecte de données de biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des dernières années, les progrès technologiques et méthodologiques de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) ont ouvert une nouvelle voie pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques. Malgré les progrès remarquables de la cryo-EM, il est encore possible d’améliorer divers aspects du flux de travail d’analyse d’une seule particule. L’analyse monoparticule exige un progiciel approprié pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Plusieurs progiciels d’acquisition automatique de données ont été développés pour l’imagerie automatique pour la cryo-EM monoparticule au cours des huit dernières années. Cet article présente une application d’un pipeline d’acquisition d’images entièrement automatisé pour les biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.

Il présente un progiciel capable de collecter des données cryo-EM de manière complète, automatique et précise. De plus, divers paramètres microscopiques sont facilement contrôlés par ce progiciel. Ce protocole démontre le potentiel de ce progiciel dans l’imagerie automatisée de la protéine de pointe du syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) avec un cryomicroscope électronique de 200 keV équipé d’un détecteur d’électrons direct (DED). Environ 3 000 images de films cryo-EM ont été acquises en une seule session (48 h) de collecte de données, ce qui a donné une structure de résolution atomique de la protéine de pointe du SARS-CoV-2. De plus, cette étude structurale indique que la protéine de pointe adopte deux conformations majeures, 1-RBD (domaine de liaison aux récepteurs) ouverte et toutes les conformations RBD fermées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cryo-EM monoparticule est devenue une technique de biologie structurale courante pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques1. La reconstruction d’une seule particule dépend de l’acquisition d’un grand nombre de micrographies d’échantillons vitrifiés pour extraire des images de particules bidimensionnelles (2D), qui sont ensuite utilisées pour reconstruire une structure tridimensionnelle (3D) d’une macromolécule biologique2,3. Avant le développement des DED, la résolution obtenue à partir de la reconstruction d’une seule particule variait entre 4 et 30 Å4,5. Récemment, la résolution réalisable de la cryo-EM à particule unique a dépassé 1,8 Å6. Le DED et les logiciels automatisés d’acquisition de données ont largement contribué à cette révolution de résolution7, où l’intervention humaine pour la collecte de données est minime. En règle générale, l’imagerie cryo-EM est réalisée à de faibles débits de dose d’électrons (20-100 e/Å2) pour minimiser les dommages causés par le rayonnement induit par le faisceau d’électrons des échantillons biologiques, ce qui contribue au faible rapport signal/bruit (SNR) de l’image. Ce faible SNR empêche la caractérisation des structures à haute résolution des macromolécules biologiques à l’aide d’une analyse monoparticulaire.

Les détecteurs d’électrons de nouvelle génération sont des détecteurs à base de CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor), qui peuvent surmonter ces obstacles à faible SNR. Ces caméras CMOS à détection directe permettent une lecture rapide du signal, grâce à laquelle la caméra contribue à une meilleure fonction d’étalement de points, à un SNR approprié et à une excellente efficacité quantique de détection (DQE) pour les macromolécules biologiques. Les caméras à détection directe offrent un SNR8 élevé et un faible bruit dans les images enregistrées, ce qui entraîne une augmentation quantitative de l’efficacité quantique du détective (DQE), une mesure de la quantité de bruit qu’un détecteur ajoute à une image. Ces caméras enregistrent également des films à la vitesse de centaines d’images par seconde, ce qui permet une acquisition rapide des données9,10. Toutes ces caractéristiques rendent les caméras à détection directe rapide adaptées aux applications à faible dose.

Les images de pile corrigées du mouvement sont utilisées pour le traitement des données afin de calculer la classification 2D et de reconstruire une carte de densité 3D de macromolécules à l’aide de divers logiciels tels que RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 et EMAN215. Cependant, pour l’analyse d’une seule particule, un énorme ensemble de données est nécessaire pour obtenir une structure à haute résolution. Par conséquent, les péages d’acquisition automatique de données sont très essentiels pour la collecte de données. Pour enregistrer de grands ensembles de données cryo-EM, plusieurs progiciels ont été utilisés au cours de la dernière décennie. Des progiciels dédiés, tels que AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS et EPU, ont été développés pour l’acquisition automatisée de données.

Ces progiciels utilisent des tâches de routine pour trouver automatiquement les positions des trous en corrélant les images à faible grossissement aux images à fort grossissement, ce qui aide à identifier les trous avec de la glace vitreuse d’épaisseur de glace appropriée pour l’acquisition d’images dans des conditions à faible dose. Ces progiciels ont permis de réduire le nombre de tâches répétitives et d’augmenter le débit de la collecte de données cryo-EM en acquérant une grande quantité de données de bonne qualité pendant plusieurs jours en continu, sans aucune interruption et sans la présence physique de l’opérateur. Latitude-S est un progiciel similaire, utilisé pour l’acquisition automatique de données pour l’analyse d’une seule particule. Cependant, ce progiciel ne convient qu’aux DED K2/K3 et est fourni avec ces détecteurs.

Ce protocole démontre le potentiel de Latitude-S dans l’acquisition automatisée d’images de la protéine de pointe SARS-CoV-2 avec un détecteur d’électrons direct équipé d’un cryo-EM de 200 keV (voir le Tableau des matériaux). À l’aide de cet outil de collecte de données, 3 000 fichiers vidéo de la protéine de pointe du SARS-CoV-2 sont automatiquement acquis et un traitement ultérieur des données est effectué pour obtenir une structure protéique de pointe de résolution 3,9-4,4 Å.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE: Trois étapes importantes sont nécessaires pour la collecte de données cryo-EM: 1. préparation de la grille cryo-EM, 2. étalonnage et alignement du microscope, 3. collecte automatique de données (Figure 1). En outre, la collecte automatisée de données est subdivisée en a. sélection de zone appropriée, b. optimisation de Latitude-S, c. démarrage automatique de la sélection automatique des trous et d. démarrage automatique de l’acquisition automatique des données (Figure 1).

1. Préparation de la grille Cryo-EM et chargement des échantillons pour l’acquisition automatique de données

  1. Nettoyez les grilles à l’aide d’un déchargeur de lueur et faites varier les paramètres de décharge de lueur en fonction des exigences expérimentales (ici, 60 s à 20 mA).
  2. Ajouter un échantillon de protéines fraîchement préparé (3 μL) à la grille luminescente et incuber pendant 10 s.
  3. Épongez les grilles pendant 3 à 5 s à 100% d’humidité et plongez-les rapidement dans de l’éthane liquide à l’aide d’un cryo-piston.
  4. Serrez manuellement les grilles dans un anneau de clip pour former la cartouche à l’aide d’un anneau flexible C-clip.
  5. Chargez les grilles montées sur cartouche congelées dans la cassette du chargeur automatique et transférez la cassette par le nano capuchon vers le chargeur automatique prérefroidi du microscope pour la collecte de données.

2. Réglage du microscope et alignement de base avant l’acquisition automatique des données

  1. Décalage du faisceau
    1. Cliquez sur Décalage de la poutre dans l’onglet Alignement direct .
    2. Réduisez le grossissement et centrez le faisceau sur l’axe optique à l’aide des boutons multifonctions X et Y .
  2. Alignement du point pivot
    1. Cliquez sur l’option Inclinaison de la poutre dans Alignement direct pp X dans l’onglet Alignement direct .
    2. Condensez le faisceau en un endroit et minimisez le mouvement à l’aide du bouton multifonction X et Y .
  3. Centrage d’ouverture C2
    1. Sélectionnez l’ouverture du condenseur dans l’onglet Alignement .
    2. Condensez le faisceau en un point, centrez le faisceau sur l’axe optique, puis élargissez le faisceau pour couvrir le cercle uniformément.
    3. Répétez ces étapes jusqu’à ce que l’ouverture du condenseur 2 soit ajustée.
  4. Alignement sans coma
    1. Cliquez sur Coma-free Alignment X dans l’onglet Alignement direct pour aligner le faisceau sur l’axe optique.
    2. Utilisez le bouton Multifonction pour minimiser la forme et le mouvement de la FFT (assurez-vous qu’elle est stable).
    3. Répétez la même procédure pour Coma - alignement libre Y.
  5. Réglez l’éclairage parallèle avant la collecte des données dans le cryo-EM en raison de la lentille double C.
    1. Insérez l’ouverture de l’objectif (70 μm) en mode diffraction.
    2. Focalisez l’ouverture de l’objectif sur le plan focal avant de l’objectif de diffraction en contrôlant le bouton d’intensité de mise au point (objectif et courant de l’objectif C2).
    3. Assurez-vous que le bord net de l’ouverture de l’objectif est visible après une mise au point appropriée.
    4. Insérez le bouchon de faisceau et répartissez l’intensité jusqu’à ce que les anneaux de diffraction de la poudre d’or soient minimisés.
      REMARQUE: Si le faisceau est correctement réparti, un anneau de diffraction clair de la poudre d’or est visible à l’écran, ce qui indique que le faisceau est parallèle.
    5. Rétractez le bouchon du faisceau après avoir réglé l’éclairage parallèle et changez le mode microscope en Nano sonde.
      REMARQUE: Vérifiez le réglage du microscope avant de commencer la collecte de données pour assurer les performances optimales du microscope. Tous ces réglages seraient effectués dans l’onglet GUI d’alignement direct du microscope. Tout le réglage du microscope est effectué à l’aide d’une grille de test avant la collecte des données.

3. Acquisition de données avec Latitude-S

  1. Démarrez le logiciel d’acquisition de données automatisé Latitude-S.
    REMARQUE : L’installation du Latitude-S nécessite également un étalonnage au microscope, qui sera effectué avant la collecte des données, et les paramètres seront stockés en permanence. Cinq états différents pour la collecte de données sont étalonnés avec quatre grossissements différents (Figure 1 et Figure 2). L’état de l’Atlas et l’état de la grille sont dans deux grossissements différents en mode LM (plages de faible grossissement). L’état du trou est en mode SA (plages de grossissement élevé) mais avec un grossissement modéré. La mise au point et l’état des données utilisent le mode SA à fort grossissement.
    1. Cliquez sur DigitalMicrograph dans le menu Démarrer ou double-cliquez sur l’icône DigitalMicrograph sur le bureau.
    2. Sélectionnez l’icône Gestionnaire de techniques dans DigitalMicrograph.
      REMARQUE : ce système affiche les icônes TEM et Latitude-S (Figure 2 et Figure supplémentaire S1).
    3. Sélectionnez l’icône Latitude-S pour la collecte automatisée de données à une seule particule.
      REMARQUE: La caméra K2 fonctionne en trois modes: linéaire / intégré, compté et super-résolution. L’utilisateur peut sélectionner n’importe quel mode dans l’interface de DigitalMicrograph. Les images de données peuvent être enregistrées en tant que piles d’images fractionnées par dose ou en tant qu’images additionnées dans des fichiers MRC, TIF ou .dm4 avec des profondeurs de bits différentes. De plus, les données peuvent être enregistrées sous forme d’images corrigées de mouvement pour la caméra K3. Sur une caméra K2, une pile d’images non traitées peut être enregistrée en tant que fichiers MRC 4 bits, TIF 8 bits ou .dm4 8 bits.
  2. Créez une nouvelle session en fonction des paramètres d’une session précédente.
    1. Cochez la case Basé sur la session précédente dans la palette.
    2. Sélectionnez le bouton Nouveau .
    3. Choisissez le dossier contenant la session sur laquelle les paramètres de la nouvelle session sont basés. Accédez au répertoire de session précédente pour créer la nouvelle session. Choisissez le dossier dans lequel enregistrer la nouvelle session et les données associées.
    4. Sélectionnez et choisissez le dossier dans lequel la nouvelle session et les données associées seront enregistrées.
      REMARQUE : Chaque état et ses paramètres sous-jacents (grossissement, conditions d’éclairage, image ou projecteur) et les paramètres de décalage du faisceau et de caméra (exposition totale, exposition à une seule image et regroupement) seront exportés de la session existante vers la nouvelle session. Le chemin d’accès du dossier est affiché sous forme de chaîne de texte au bas de la palette. Chacun des états et palettes de configuration a un astérisque (*) ajouté au titre pour montrer qu’il a déjà été configuré et qu’il est prêt à l’emploi.
  3. Poursuivez une session existante.
    1. Appuyez sur le bouton Continuer de la palette pour poursuivre une session existante.
      REMARQUE : Le montage de l’atlas ne peut pas être modifié.
    2. Choisissez et accédez au dossier qui contient la session à poursuivre.
  4. Commencez une toute nouvelle session.
    1. Cliquez sur Nouvel onglet dans la palette. Choisissez le dossier qui contient la session à poursuivre. Sélectionnez un dossier pour enregistrer les données.
      Remarque : Le nom de dossier par défaut est généré en utilisant la date et l’heure.
    2. Cliquez sur l’icône Paramètres . Dans la zone Gérer l’exploration de l’état qui s’affiche, ajoutez l’état, définissez la condition TEM, la condition de la caméra et l’image/pile, puis nommez l’état.
      REMARQUE : Le flux de travail d’acquisition de données automatisé utilise 5 états différents pour la collecte automatisée de données. Ces états sont configurés et stockés dans leurs palettes d’états respectives. Le résumé de l’état est donné dans le tableau 1.
  5. Configurez l’état de l’atlas.
    1. Cliquez sur Palette d’états Atlas.
    2. Configurez l’état de l’atlas avec les paramètres suivants : grossissement 115x mode LM en nano sonde, conditions d’éclairage-taille du spot 8 et luminosité 934400, binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s pour l’imagerie à faible grossissement. Reportez-vous au résumé de l’état donné dans le tableau 1.
    3. Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
      REMARQUE: L’état de l’Atlas est l’état de grossissement le plus bas, qui fournit l’étude de l’ensemble de la grille (figure supplémentaire S2). Généralement, cet état nous aide à visualiser les grilles entières à faible grossissement et à juger de l’épaisseur de la glace, de la planéité et du carré brisé des grilles. Il est recommandé de générer l’atlas à différentes zones de la grille pour observer l’épaisseur optimale de la glace et l’épaisseur de glace sous-optimale des grilles (figure supplémentaire S3). Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
  6. Configurez l’état de la grille.
    1. Cliquez sur la palette État de la grille.
    2. Configurez l’état de la grille avec l’optique d’imagerie de microscope suivante (mode grossissement 380x LM dans la sonde Nano), les conditions d’éclairage (taille du spot: 8 et luminosité 626 200), le binning: 1 et le temps d’exposition de l’appareil photo: 1,0 s.
    3. Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S fourni dans le tableau 1.
    4. Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
      REMARQUE : L’état de la grille est défini à un grossissement supérieur à l’état de l’atlas, de sorte que le champ de vision est d’un carré de grille (Figure 2). Dans ce grossissement particulier, un carré de grille est observé. Par conséquent, les trous sont observés correctement dans ce grossissement, ce qui permet de vérifier l’épaisseur de glace des trous (figure supplémentaire S4). Un simple filtre passe-bande est utilisé à l’état de grille pour localiser les trous dans la grille de brevet. Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
  7. Configurez l’état du trou.
    1. Cliquez sur la palette de trous.
    2. Configurez l’état du trou avec les paramètres de microscope suivants: optique d’imagerie (grossissement 4500x mode SM dans la sonde Nano), conditions d’éclairage (taille du spot: 7 et diamètre du faisceau 8,81 μm), binning: 1 et temps d’exposition de la caméra: 1,0 s.
    3. Modifiez les paramètres si nécessaire en fonction du type de grille. Voir le résumé de l’état fourni dans le tableau 1.
    4. Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
      REMARQUE: Le mode SA indique une plage de grossissement élevée dans le microscope électronique. L’état du trou est dans la plage de grossissement SA avec un champ de vision de quelques micromètres (10-20 μm) (Figure 2 et Figure supplémentaire S4). Cette plage de grossissement est supérieure à l’état Atlas ou Grille, mais beaucoup plus petite que l’état Focus/Data. Dans ce grossissement, des trous individuels seront visibles. La taille du trou est appropriée pour observer des degrés élevés de contamination, des trous vides et l’épaisseur de glace appropriée des trous. Les trous pour l’imagerie sont sélectionnés en fonction de ces hypothèses. Deux filtres sont utilisés dans l’état du trou : l’un pour la corrélation croisée d’une image de référence de trou avec une nouvelle image de trou et l’autre pour ajuster la hauteur de la scène à la hauteur eucentrique.
  8. Configurez l’état du focus.
    1. Cliquez sur Palette focus.
    2. Configurez l’état de mise au point avec les paramètres de microscope suivants : optique d’imagerie (grossissement 45 000x mode SA en nano sonde), conditions d’éclairage (taille du spot : 8 et luminosité 934400), binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s.
    3. Concentrez-vous sur la zone de carbone amorphe près du trou. Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S fourni dans le tableau 1.
    4. Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
      REMARQUE: Le mode SA indique une plage de grossissement élevée dans le microscope électronique. L’état Focus est le grossissement de plage SA le plus élevé. En mode mise au point, le faisceau est déplacé vers une zone de carbone proche du trou cible et effectue automatiquement la mise au point pour collecter les données dans l’état des données. Un filtre passe-bande combiné à un filtre hanning ou rectangulaire souple est utilisé dans l’état de mise au point pour mesurer le décalage entre deux images d’état de mise au point de la même zone (Figure 2). Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
  9. Configurez l’état des données.
    1. Cliquez sur Palette de données.
    2. Configurez l’état des données avec les paramètres de microscope suivants : optique d’imagerie (par exemple, grossissement 28 000x, 45 000x, 54 000x en mode SA en nano sonde), conditions d’éclairage (taille du spot : 8 et luminosité 934400), binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s.
    3. Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S présenté dans le tableau 1.
    4. Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
      REMARQUE : L’état des données est le grossissement le plus élevé sélectionné en fonction de la taille des pixels requis et de la résolution cible (Figure 2). Généralement, après la mise au point, le faisceau est automatiquement déplacé vers la zone cible pour collecter les données. Les paramètres mentionnés ci-dessus peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.

4. Configuration du focus

  1. Cliquez sur La palette de configuration Focus. Spécifiez la plage de valeurs de mise au point et la taille du pas dans l’onglet donné.
  2. Appuyez sur le bouton Suivant pour passer à l’étape suivante.
    REMARQUE : Des valeurs de défocalisation plus faibles peuvent être utilisées pour l’acquisition de données haute résolution. En règle générale, des valeurs de défocalisation de -0,5 à -3,0 μm avec des tailles de pas de mise au point de 0,25 ou 0,5 sont utilisées pour l’acquisition d’images. Les utilisateurs peuvent ignorer l’étape de configuration du focus s’ils souhaitent uniquement filtrer l’exemple. Appuyez simplement sur le bouton Suivant de la palette pour ignorer l’étape de configuration du focus.

5. Alignement fin

  1. Concentrez-vous sur certaines caractéristiques de la grille (p. ex., la glace hexagonale de contamination de la glace); voir la figure 3.
    REMARQUE: Les fonctionnalités ne doivent pas être trop grandes ou trop petites. Ils doivent être visibles à la fois au grossissement de l’état Atlas 115x (mode LA) et au grossissement des données.
  2. Cliquez sur le bouton Capturer . Placez la croix rouge sur la même fonction sur chaque image d’états différents.
  3. Commencez par les états de mise au point, de données et de trous, car leur champ de vision est beaucoup plus grand que les états de l’atlas et de la grille. Zoomez sur les états de l’atlas et de la grille pour positionner la croix rouge sur la même entité dans les états de l’atlas et de la grille.
  4. Cliquez sur le bouton Calculer pour calculer les positions de cinq états différents, qui calculera les décalages entre chacun des états et les reflétera dans la fenêtre de sortie.
    REMARQUE : Les valeurs de décalage sont intégrées dans les états pour une utilisation ultérieure (Figure 3). Un alignement fin est effectué pour fournir une grande précision de la position de chaque état (Figure 3). Cet alignement fin permet de déterminer la position exacte dans les cinq états. L’alignement fin est essentiel pour l’acquisition de données à une seule particule. Par conséquent, il est fortement recommandé d’effectuer un alignement fin avant l’imagerie.

6. Procédure d’acquisition de données à l’aide de Latitude-S

  1. Cliquez sur la palette Capture.
    REMARQUE: Généralement, les données de l’atlas sont collectées à faible grossissement (115x) pour visualiser la plupart des carrés de la grille.
  2. Choisissez la taille de l’atlas pour couvrir la totalité de la grille ou une partie de la grille en fonction des besoins (par exemple, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 ou 8 x 12).
    REMARQUE: La taille de l’atlas 16 par 16 couvre l’ensemble de la grille.
  3. Cliquez sur le bouton Capturer pour capturer l’atlas.
    REMARQUE : la fenêtre de navigation principale du Latitude-S s’ouvre et remplit l’espace disponible dans DigitalMicrograph (figure supplémentaire S5). Trois volets d’image dans la fenêtre de navigation principale affichent des images des états du système à trois grossissements différents. L’atlas global est actuellement affiché dans son état actuel d’acquisition dans le volet le plus à gauche. Les tuiles de l’atlas se remplissent à chaque capture.
  4. Sélectionnez le carré de la grille en fonction de l’épaisseur de la glace en naviguant sur l’atlas (figure supplémentaire S5). Une fois que les carrés de grille souhaités sont sélectionnés, cliquez sur le bouton Planifier et observez les tuiles du carré de la grille se remplir au fur et à mesure que chaque carré de grille est capturé.
  5. Cliquez sur le bouton Planifier une fois les carrés de la grille sélectionnés.
  6. Sélectionnez un trou représentatif dans le carré de la grille en ajoutant sa position. Une fois qu’une image de trou est acquise, définissez les positions des données et de la mise au point et enregistrez la mise en page en tant que modèle (figure supplémentaire S6).
  7. Cliquez sur Recherche automatique, donnez la taille du trou (par exemple, R1.2 / 1.3) et cliquez sur le bouton Rechercher dans le programme, ce qui entraînera le programme Rechercher à trouver automatiquement les trous en fonction du diamètre du trou. Ensuite, cliquez sur le bouton Marquer pour ajouter le modèle (Figure 4) et ajouter des marques de cercle rouge dans tous les trous d’une grille ou d’un carré de grille partiel.
  8. Configurez l’intensité pour enlever les trous du carré de la grille et la contamination par la glace (Figure 4).
    REMARQUE: Enfin, les trous sélectionnés seront marqués en jaune pour planifier la collecte de données.
  9. Cliquez sur le bouton Planifier dans les tâches Latitude après avoir ajouté les trous via la recherche automatique.
    REMARQUE: Avant de planifier la collecte automatisée de données, assurez-vous que le niveau du réservoir d’azote liquide est suffisant, que la turbopompe du chargeur automatique est éteinte et que l’espace disque RAID est libre. Le gestionnaire de tâches Latitude-S affiche le nombre d’atlas, de carrés de grille, de trous et d’états de données planifiés pour la collecte de données (Figure 5). Dans l’interface graphique de Latitude-S, différents schémas de couleurs seront visibles et la signification des différents schémas de couleurs sera affichée : 1. Le jaune indique qu’il n’est pas planifié ; 2. Le vert indique programmé; 3. Le bleu indique Acquis; 4. Le rouge indique l’échec.

7. Traitement des données Cryo-EM

REMARQUE: Le traitement d’image cryo-EM de la protéine de pointe est décrit en détail dans la littérature récente25.

  1. Effectuer le traitement d’image de la protéine de pointe du SARS-CoV2 à l’aide de RELION 3.011.
  2. Filtrez manuellement les images vidéo collectées à l’aide de Latitude-S et effectuez la correction de mouvement induite par le faisceau des films individuels à l’aide du logiciel MotionCor29. Effectuez manuellement le criblage initial des micrographies corrigées du mouvement à l’aide du progiciel cisTEM14.
    REMARQUE: Près de 85% des micrographies acquises automatiquement étaient de bonne qualité et les données avaient un signal compris entre 3,7 et 5,2 Å, ce qui est calculé à l’aide du logiciel cisTEM14 (figure supplémentaire S7A, B).
  3. Traitez les données à l’aide du progiciel RELION 3.011.
    1. Choisissez manuellement les particules de pointe et soumettez-les à une classification de classe 2D (figure supplémentaire S7C). Utilisez la meilleure classe 2D comme référence pour sélectionner automatiquement 3 99 842 particules à pointe unique à partir des micrographies à l’aide de l’outil de sélection automatique RELION11.
      NOTE: Trois cycles de classification 2D ont été effectués avant de soumettre les particules à une classification 3D (figure supplémentaire S8). Environ 2 55 982 particules uniques ont été sélectionnées pour la classification 3D, et l’ensemble de données a été classé en six classes. L’auto-raffinement 3D final a été effectué avec la meilleure classe; 85 227 particules de pointe ont été obtenues à partir de la classification 3D.
    2. Après l’affinage automatique, effectuez un raffinement de mise au point par particule avec des paramètres d’inclinaison du faisceau appropriés pour améliorer la résolution. Ensuite, soumettez les particules à un polissage bayésien à l’aide du progiciel RELION 3.011. Enfin, utilisez le jeu de particules polies pour un autre cycle d’auto-raffinement 3D à l’aide de RELION 3.011.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la situation pandémique actuelle, la cryo-EM joue un rôle clé dans la caractérisation des structures de diverses protéines du SARS-CoV-226,27,28,29, qui peuvent aider à développer des vaccins et des médicaments contre le virus. Il y a un besoin urgent d’efforts de recherche rapides avec des ressources humaines limitées pour lutter contre la maladie à coronavirus de 2019. L’acquisition de d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S est une interface utilisateur intuitive qui fournit un environnement permettant de configurer et de collecter automatiquement des milliers de micrographies haute résolution ou de fichiers vidéo en deux jours. Il permet une navigation facile à travers les grilles et maintient la position de l’étage du microscope tout en passant d’un faible grossissement à un grossissement élevé. Chaque étape de l’acquisition de données avec Latitude-S est rapide, avec des fonctionnalités telles qu’une interface utilisateur simp...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts concurrent ou financier à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Département de biotechnologie, le Département des sciences et de la technologie (DST) et des Sciences, et le Ministère du développement des ressources humaines (MHRD), Inde, pour le financement et l’installation cryo-EM à IISc-Bangalore. Nous reconnaissons le programme DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) et DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) pour l’installation nationale de Cryo-EM à IISc, Bangalore. Nous reconnaissons le soutien financier du Conseil de la recherche en sciences et en génie (SERB) (subvention n° SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 et SERB-IPA/2020/000094), DBT (subvention n° 2020/000094), DBT (grant no. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Nous remercions Mme Ishika Pramanick d’avoir préparé les grilles cryo-EM, la collecte de données cryo-EM et la préparation de la table des matériaux. Nous remercions également M. Suman Mishra pour le traitement d’image cryo-EM et pour nous avoir aidés à préparer les chiffres. Nous remercions le professeur Raghavan Varadarajan de nous avoir aidés à obtenir l’échantillon de protéine de pointe purifié pour cette étude.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papier buvardTed Pella, INC.47000-100Article de préparation d’échantillon EM
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591Unité de préparation d’échantillon EM
Cassette ThermoFisher Scientific1020863Unité de préparation d’échantillon
EM C-ClipThermo Fisher Scientific1036171Élément de préparation d’échantillon EM
Outil d’insertion C-ClipThermo Fisher Scientific9432 909 97571Outil de préparation d’éprouvette EM
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173Élément de préparation d’éprouvette EM
grille (Quantifoil)Microscopie électroniqueSciences Q3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh,
Gold Machine à décharge LueurQuorumN/AQuorum GlowQube Machine à décharge luminescente
K2 DEDGatan Inc.N/ADispositif de collecte de données Cryo-EM (caméra)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Logiciel d’imagerie
Station de chargementThermo Fisher Scientific1130698Unité de préparation d’échantillons
EM Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific&trade ;N/ACryo-Microscope Electronique
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AUnité de préparation d’échantillons
EM

References

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