Logiciel d’acquisition de données convivial, à haut débit et entièrement automatisé pour la cryo-microscopie électronique à particule unique

Résumé

La cryo-microscopie électronique à particule unique exige un progiciel approprié et un pipeline convivial pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Nous présentons ici l’application d’un logiciel d’acquisition d’images entièrement automatisé, Latitude-S, et un pipeline pratique pour la collecte de données de biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.

Résumé

Au cours des dernières années, les progrès technologiques et méthodologiques de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) ont ouvert une nouvelle voie pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques. Malgré les progrès remarquables de la cryo-EM, il est encore possible d’améliorer divers aspects du flux de travail d’analyse d’une seule particule. L’analyse monoparticule exige un progiciel approprié pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Plusieurs progiciels d’acquisition automatique de données ont été développés pour l’imagerie automatique pour la cryo-EM monoparticule au cours des huit dernières années. Cet article présente une application d’un pipeline d’acquisition d’images entièrement automatisé pour les biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.

Il présente un progiciel capable de collecter des données cryo-EM de manière complète, automatique et précise. De plus, divers paramètres microscopiques sont facilement contrôlés par ce progiciel. Ce protocole démontre le potentiel de ce progiciel dans l’imagerie automatisée de la protéine de pointe du syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) avec un cryomicroscope électronique de 200 keV équipé d’un détecteur d’électrons direct (DED). Environ 3 000 images de films cryo-EM ont été acquises en une seule session (48 h) de collecte de données, ce qui a donné une structure de résolution atomique de la protéine de pointe du SARS-CoV-2. De plus, cette étude structurale indique que la protéine de pointe adopte deux conformations majeures, 1-RBD (domaine de liaison aux récepteurs) ouverte et toutes les conformations RBD fermées.

Introduction

La cryo-EM monoparticule est devenue une technique de biologie structurale courante pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules ^biologiques1. La reconstruction d’une seule particule dépend de l’acquisition d’un grand nombre de micrographies d’échantillons vitrifiés pour extraire des images de particules bidimensionnelles (2D), qui sont ensuite utilisées pour reconstruire une structure tridimensionnelle (3D) d’une macromolécule ^{biologique2,3}. Avant le développement des DED, la résolution obtenue à partir de la reconstruction d’une seule particule variait e....

Protocole

REMARQUE: Trois étapes importantes sont nécessaires pour la collecte de données cryo-EM: 1. préparation de la grille cryo-EM, 2. étalonnage et alignement du microscope, 3. collecte automatique de données (Figure 1). En outre, la collecte automatisée de données est subdivisée en a. sélection de zone appropriée, b. optimisation de Latitude-S, c. démarrage automatique de la sélection automatique des trous et d. démarrage automatique de l’acquisition automatique des données (Figure 1).

1. Préparation de la grille Cryo-EM et chargement des échantillons pour l’acquisition automatique de do....

Résultats

Dans la situation pandémique actuelle, la cryo-EM joue un rôle clé dans la caractérisation des structures de diverses protéines du SARS-CoV-226,27,28,29, qui peuvent aider à développer des vaccins et des médicaments contre le virus. Il y a un besoin urgent d’efforts de recherche rapides avec des ressources humaines limitées pour lutter contre la maladie à coronavirus de 2019. L’acquisition de d.......

Discussion

Latitude-S est une interface utilisateur intuitive qui fournit un environnement permettant de configurer et de collecter automatiquement des milliers de micrographies haute résolution ou de fichiers vidéo en deux jours. Il permet une navigation facile à travers les grilles et maintient la position de l’étage du microscope tout en passant d’un faible grossissement à un grossissement élevé. Chaque étape de l’acquisition de données avec Latitude-S est rapide, avec des fonctionnalités telles qu’une interface utilisateur simp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Papier buvard	Ted Pella, INC.	47000-100	Article de préparation d’échantillon EM
Capsule	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	Unité de préparation d’échantillon EM
Cassette Thermo	Fisher Scientific	1020863	Unité de préparation d’échantillon
EM C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Élément de préparation d’échantillon EM
Outil d’insertion C-Clip	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	Outil de préparation d’éprouvette EM
C-Clip Ring	Thermo Fisher Scientific	1036173	Élément de préparation d’éprouvette EM
grille (Quantifoil)	Microscopie électronique	Sciences Q3100AR1.3	R 1.2/1.3 300 Mesh,
Gold Machine à décharge Lueur	Quorum	N/A	Quorum GlowQube Machine à décharge luminescente
K2 DED	Gatan Inc.	N/A	Dispositif de collecte de données Cryo-EM (caméra)
Latitude S Software	Gatan Inc.		Logiciel d’imagerie
Station de chargement	Thermo Fisher Scientific	1130698	Unité de préparation d’échantillons
EM Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific&trade ;	N/A	Cryo-Microscope Electronique
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A	Unité de préparation d’échantillons

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