Article de méthode

Test d’absorption des vésicules extracellulaires par analyse d’imagerie au microscope confocal

DOI :

10.3791/62836

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14 février 2022

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1The Brady Urological Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Urology, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les vésicules extracellulaires (VE) contribuent à la biologie cellulaire et aux communications intercellulaires. Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des VE par les cellules. Le protocole actuel propose le test d’absorption ev en utilisant l’imagerie de fluorescence tridimensionnelle par microscopie confocale, après l’isolement EV par un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des vésicules extracellulaires (VE) des cellules. L’adoption des VE joue un rôle dans la communication intercellulaire dans divers domaines de recherche; biologie du cancer, neurosciences et administration de médicaments. De nombreux tests d’absorption des VE ont été rapportés dans la littérature; cependant, il y a un manque de méthodologie expérimentale pratique et détaillée. L’absorption des VE peut être évaluée en marquant les VE par fluorescence pour détecter leur emplacement dans les cellules. Il est difficile, mais essentiel, de faire la distinction entre les VE internalisés dans les cellules et les VE superficiels sur les cellules pour déterminer avec précision l’absorption des VE. Par conséquent, un test qui quantifie efficacement l’absorption des VE par microscopie confocale à fluorescence tridimensionnelle (3D) est proposé dans ce travail. Les véhicules électriques marqués par fluorescence ont été préparés à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, visualisés par microscopie confocale 3D, puis analysés à l’aide d’un logiciel de traitement d’image avancé. Le protocole fournit une méthodologie robuste pour l’analyse des véhicules électriques au niveau cellulaire et une approche pratique pour une analyse efficace.

Introduction

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique liées à la membrane lipidique qui sont classées en fonction de leur taille : ectosomes (100-500 nm) et exosomes (50-150 nm)1. Les VE contiennent diverses biomolécules, telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. Ces biomolécules proviennent des cellules avant d’être encapsulées sous forme de cargaison et libérées dans l’espace extracellulaire via les VE1,2,3.

En raison de la variété de leur cargaison, on pense que les ....

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Protocole

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1. Isolation des VE et marquage immuno-fluorescent ev sur puce

  1. Collecte des milieux de culture cellulaire (CCM) et prétraitement du CCM pour l’isolement des VE
    1. Ensemencez des cellules PC3 à 30 % de confluence dans une fiole de culture cellulaire de 75 cm2 . Permettre aux cellules témoins de croître jusqu’à 90% de confluence (~ 48 h) dans les milieux standard et les suppléments spécifiques à la lignée cellulaire.
      REMARQUE: Pour empêcher les composants contenant des VE d’affecter l’absorption cellulaire (c.-à-d. le sérum bovin fœtal), utilisez des milieux et des suppléments appauvris en exosomes.
    2. Récoltez le CCM.
    3. Cen....

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Résultats

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À l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, les VE ont été isolés du PC3 CCM et marqués avec un anticorps spécifique à l’EV conjugué au fluorophore (CD63) (Figure 1). Les véhicules électriques marqués ont été visualisés avec succès par la microscopie confocale 3D (Figure 2). Les VE marqués ont été incubés avec des cellules pendant plusieurs heures dans des milieux appauvris en exosomes. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec d.......

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Discussion

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Un test d’absorption EV basé sur l’imagerie par fluorescence 3D via la microscopie confocale fournit une méthodologie efficace et une analyse sensible. Cet étiquetage fluorescent des VE facilite la visualisation des VE et effectue avec succès un test d’absorption précis des VE. Des méthodes antérieures d’étiquetage des véhicules électriques et d’élimination du colorant résiduel ont été rapportées en éliminant les précipitations à l’aide de l’ultracentrifugation (CU); cependant, la CO peut co-précipiter les VE, e.......

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Déclarations de divulgation

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Y.-K. Cho est l’un des inventeurs des brevets sur le dispositif microfluidique à base de nanofiltration, Exodisc, qui sont concédés sous licence à Labspinner (Ulsan, Corée). Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIC. U54CA143803, CA163124, CA093900 et CA143055 à K. J. P. Cette recherche a été soutenue par une subvention du projet coréen de R&D sur les technologies de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être de la République de Corée (numéro de subvention : HI19C1122). Œuvre de J. Kim et Y.-K. Cho a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R020-D1), financé par le gouvernement coréen. Les auteurs remercient les membres actuels et passés de l’Institut urologique Brady, en particulier les membres du l....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 488 anti-humain CD63Anticorps Biolegend353038Colorant fluorescent conjugué Anticorps spécifique de l’EV
CellTracker Orange CMTMRColorant Thermo Fisher ScientificC2927Cellule vivante (cytoplasme) réactif de marquage fluorescent
CFI Apo Lambda S 40XC WINikonMRD77400 Objectif pour l’imagerie confocale, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20XMRD70200Objectif pour l’imagerie confocale, NA=0,75
ExodiscLabspinner Inc.EX-D1001Un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration pour l’isolation des véhicules électriques
ExoDiscoveryLabspinner Inc.EX-R1001Dispositif de fonctionnement pour Exodisc
FBS appauvri en exosomesThermo Fisher ScientificA2720801Nutriment des milieux de culture cellulaire pour la collection EV dérivée de la lignée cellulaire PC3
Sérum fœtal bovin (FBS)VWR1500-500Nutriment pour la culture cellulaire
Chèvre Anti-souris IgG H& L préadsorbéabcam  ; ab7063Anticorps IgG de souris pour le contrôle négatif de l’étiquetage EV
Ibidi USA  ; U DISH &mu ;-Dish 35 mmIbidi81156Antenne de culture pour l’imagerie confocale
Imaris 9.7.1Oxford Instruments9.7.1Logiciel de traitement post-image
Incubator System+ CO2/O2/N2 Mélangeur de gazLive Cell InstrumentTU-O-20Système d’incubateur pour l’imagerie de cellules vivantes
Appareil photo Nikon A1 HD25 / A1R HD25NikonNAAppareil photo pour l’imagerie confocale
Microscope Nikon Eclipse TiNAMicroscope inversé pour l’imagerie confocale
NIS-Elements AR 4.50.00Nikon4.50.00Logiciel de traitement d’image pour microscope Nikon
NTA, NanoSight NS500Malvern PanalyticalNS500Appareil de mesure pour la concentration EV
OriginPro 2020OriginLab9.7.0.185Logiciel de représentation graphique
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Antibiotiques pour la culture cellulaire
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21875034Milieux de culture cellulaire pour la culture de lignées cellulaires PC3
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution dans DMSOThermo Fisher ScientificS32703Colorant fluorescent de coloration de l’ARN pour le marquage EV
Nikon Nikon

Références

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  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
  2. Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....

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Mots-clés

Essai de capture des VEmicroscopie confocalemarquage fluorescent des VEdispositif microfluidiqueanalyse d imagerie 3Dinternalisation des VElogiciel de traitement d imagescommunication cellulairesuivi des VE

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