Method Article

Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, un flux de travail expérimental est présenté qui permet la détection du traitement de la caspase-8 directement au niveau du complexe de signalisation induisant la mort (DISC) et détermine la composition de ce complexe. Cette méthodologie a de vastes applications, allant du démêlage des mécanismes moléculaires des voies de mort cellulaire à la modélisation dynamique des réseaux d’apoptose.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’apoptose extrinsèque est médiée par l’activation de récepteurs de la mort (DR) tels que CD95 / Fas / APO-1 ou le récepteur 1 / récepteur 2 induit par le facteur de nécrose tumorale (TRAIL-R1 / R2). La stimulation de ces récepteurs avec leurs ligands apparentés conduit à l’assemblage du complexe de signalisation induisant la mort (DISC). DISC comprend DR, la protéine adaptatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, et cellular FADD-like interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Le DISC sert de plate-forme pour le traitement et l’activation de la procaspase-8. Ce dernier se produit via sa dimérisation/oligomérisation dans les filaments du domaine effecteur de la mort (DED) assemblés au DISC.

L’activation de la procaspase-8 est suivie de son traitement, qui se produit en plusieurs étapes. Dans ce travail, un flux de travail expérimental établi est décrit qui permet la mesure de la formation de DISC et le traitement de la procaspase-8 dans ce complexe. Le flux de travail est basé sur des techniques d’immunoprécipitation soutenues par l’analyse par transfert Western. Ce flux de travail permet une surveillance attentive des différentes étapes du recrutement de la procaspase-8 dans le DISC et son traitement et est très pertinent pour étudier les mécanismes moléculaires de l’apoptose extrinsèque.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’un des récepteurs de la mort (DR) les mieux étudiés est CD95 (Fas, APO-1). La voie apoptotique extrinsèque commence par l’interaction du DR avec son ligand apparenté, c’est-à-dire que CD95L interagit avec CD95 ou que TRAIL se lie à TRAIL-R. Il en résulte la formation du DISC au DR. DISC correspondant se compose de CD95, FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP protéines1,2. En outre, le DISC est assemblé par des interactions entre des protéines contenant du domaine de la mort (DD), telles que CD95 et FADD, et des protéines contenant de la DED telles que FADD, procaspase-8/-10 et c-FLIP(Figure 1). La procaspase-8 subit une oligomérisation par association de ses DED, entraînant la formation de filaments de DED, suivie de l’activation et du traitement de la procaspase-8. Cela déclenche une cascade de caspases, qui conduit à la mort cellulaire (Figure 1)3,4. Ainsi, la procaspase-8 est une caspase initiatrice centrale de la voie d’apoptose extrinsèque médiée par CD95 ou le TRAIL-R, activée à la plateforme macromoléculaire correspondante, DISC.

Deux isoformes de la procaspase-8, à savoir la procaspase-8a (p55) et la -8b (p53), sont connues pour être recrutées au DISC5. Les deux isoformes comprennent deux DED. DED1 et DED2 sont situés dans la partie N-terminale de la procaspase-8a/b suivie des domaines catalytiques p18 et p10. L’analyse détaillée par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) des DED procaspase-8 a révélé l’assemblage de protéines procaspase-8 dans des structures filamenteuses appelées filaments DED4,6. Remarquablement, les chaînes linéaires de procaspase-8 ont d’abord été suggérées pour être engagées dans la dimérisation suivie de l’activation de la procaspase-8 au DISC. Or, on sait que ces chaînes ne sont qu’une sous-structure du filament DED procaspase-8, ce dernier comprenant trois chaînes assemblées en une triple hélice3,4,6,7.

Lors de la dimérisation au niveau du filament DED, des changements conformationnels dans la procaspase-8a/b conduisent à la formation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation3,8. Vient ensuite le traitement de la procaspase-8, qui est médié par deux voies : la première passe par la génération d’un produit de clivage p43/p41 et la seconde par la génération initiale d’un produit de clivage p30. La voie p43/p41 est initiée par le clivage de la procaspase-8a/b à Asp374, ce qui donne des produits de clivage p43/p41 et p12(Figure 2). De plus, ces fragments sont auto-catalytiquement clivés à Asp384 et Asp210/216, donnant lieu à la formation de l’hétérotétramère actif de la caspase-8, p102/p1829,10,11. En outre, il a été démontré que, parallèlement à la voie de traitement p43/p41, la procaspase-8a/b est également clivée à Asp216, ce qui conduit à la formation du produit de clivage terminal C p30, suivi de sa protéolyse à p10 et p1810 (Figure 2).

L’activation de la procaspase-8a/b au niveau du filament DED est strictement régulée par des protéines nommées c-FLIPs12. Les protéines c-FLIP se présentent sous trois isoformes : c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)et c-FLIPRaji (c-FLIPR). Les trois isoformes contiennent deux DED dans leur région N-terminale. c-FLIPL a également un C-terminal catalytiquement inactif caspase-like domaine12,13. Les deux isoformes courtes de c-FLIP-c-FLIPS et c-FLIPR-agissent de manière anti-apoptotique en perturbant la formation de filaments DED au NIVEAU DU DISC6,14,15. De plus, c-FLIP L peut régulerl’activation de la caspase-8 en fonction de la concentration. Cela peut entraîner des effets pro- et anti-apoptotiques16,17,18. En formant l’hétérodimère L de procaspase-8/c-FLIPL catalytiquement actif, c-FLIPL conduit à la stabilisation du centre actif de la procaspase-8 et à son activation. La fonction pro- ou anti-apoptotique de c-FLIPL dépend directement de sa quantité au niveau des filaments DED et de la quantité ultérieure d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIPL assemblés19. Des concentrations faibles ou intermédiaires de c-FLIPL au niveau du DISC entraînent des quantités suffisantes d’hétérodimères de procaspase-8/c-FLIPL au filament DED, qui soutient l’activation de la caspase-8. En revanche, des quantités accrues de c-FLIPL conduisent directement à ses effets anti-apoptotiques au DISC20.

Ensemble, l’activation et le traitement de la procaspase-8a/b au DISC est un processus hautement réglementé impliquant plusieurs étapes. Cet article traite de la mesure du traitement de la procaspase-8 directement au DISC ainsi que de l’analyse de la composition de ce complexe. Celui-ci sera présenté en utilisant CD95 DISC comme complexe DR exemplaire.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les expériences sur les lymphocytes T ont été réalisées conformément à l’accord éthique 42502-2-1273 Uni MD.

1. Préparation des cellules pour l’expérience

NOTE: Le nombre moyen de cellules pour cette immunoprécipitation est de 1 × 107. Les cellules adhérentes doivent être ensemencées un jour avant l’expérience afin qu’il y ait 1 ×10 7 cellules le jour de l’expérience.

  1. Préparation des cellules adhérentes pour l’expérience
    1. Graine 5-8 × 106 cellules adhérentes dans 20 mL de milieu (voir le tableau des matériaux pour la composition) pour chaque condition dans des plats de 14,5 cm un jour avant le début de l’expérience.
    2. Le jour de l’expérience, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80-90% et adhérentes au plat. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes.
  2. Préparation des cellules de suspension pour l’expérience
    1. Placez soigneusement 1 × 107 cellules de suspension dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
    2. Si vous utilisez des cellules primaires, isolez les cellules T primaires conformément à la procédure décrite précédemment21. Traiter les lymphocytes T primaires avec 1 μg/mL de phytohémagglutinine pendant 24 h, suivi d’un traitement par 25 U/mL IL2 pendant 6 jours.
    3. Placer soigneusement 1 × 108 lymphocytes T primaires dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des plats de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
      REMARQUE: Ce nombre plus élevé de cellules T primaires est recommandé, car ces cellules sont plus petites.

2. Stimulation CD95L

  1. Stimuler les cellules avec CD95L (produit comme décrit précédemment20 ou disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux)).
    REMARQUE: La concentration du CD95L et le temps de stimulation dépendent du type cellulaire13,15,22,23,24,25. Préparez une condition de stimulation deux fois pour générer un échantillon de « contrôle de perles » en parallèle.
    1. Stimuler les cellules adhérentes avec la concentration sélectionnée de CD95L. Tenez la plaque en angle et pipetez le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
    2. Stimuler les cellules de suspension avec CD95L en pipetant la solution de ligand dans la suspension cellulaire.

3. Récolte cellulaire et lyse

  1. Placez les plats cellulaires sur de la glace.
    REMARQUE: Ne jetez pas le support. Les cellules mourantes flottent dans le milieu et sont importantes pour l’analyse.
  2. Ajouter 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) à la suspension cellulaire et gratter les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL.
  3. Lavez deux fois la boîte cellulaire avec 10 mL de PBS froid et placez la solution de lavage dans le même tube de 50 mL. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C.
  4. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL.
  5. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid.
  6. Centrifuger la suspension de la cellule à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lyse (contenant 4% de cocktail d’inhibiteurs de protéase). Incubez-le pendant 30 min sur de la glace.
  7. Centrifuger le lysat à la vitesse maximale (~17 000 × g)pendant 15 min, 4 °C.
  8. Transférer le surnageant (lysat) dans un tube propre. Jetez la pastille. Prendre 50 μL du lysat dans un autre tube. Analyser la concentration en protéines par le test de Bradford et prendre la quantité de lysat correspondant à 25 μg de protéines dans un flacon. Ajouter un tampon de chargement (voir le tableau des matériaux pour la composition) au flacon. Conservez-le à -20 °C comme contrôle de lysat.

4. Immunoprécipitation (PI)

  1. Ajouter 2 μL d’anticorps anti-APO-1 et 10 μL de billes de sépharose de protéine A (préparées selon les recommandations du fabricant) au lysat. Ajouter seulement 10 μL de billes dans un tube séparé contenant du lysat (échantillon stimulé) pour générer un « contrôle de perles ».
    REMARQUE: Utilisez des pointes de pipette avec de larges orifices, soit en coupant les pointes, soit en achetant des pointes spéciales pour IP tout en manipulant les perles de sépharose de protéine A.
  2. Incuber le mélange de lysat avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose en mélangeant doucement pendant la nuit à 4 °C. Centrifuger les lysats avec des billes d’anticorps/protéine A de sépharose à 500 × g pendant 4 min, 4 °C. Jetez le surnageant, ajoutez 1 mL de PBS froid aux perles et répétez cette étape au moins trois fois.
  3. Jetez le surnageant. Aspirer les billes de préférence avec une seringue Hamilton de 50 μL.

5. Transfert western

  1. Ajouter 20 μL de tampon de charge 4x (voir le tableau des matériaux pour la composition) aux billes et chauffer à 95 °C pendant 10 min. Chauffer les commandes de lysat à 95 °C pendant 5 min.
  2. Chargez les lysats, les IP et un étalon de protéines sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 12,5% (voir la table des matériaux pour la préparation du gel) et exécutez avec une tension constante de 80 V.
  3. Transférer les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose.
    NOTE: Ici, la technique semi-sèche, optimisée pour les protéines d’intérêt, a été utilisée pour le transfert sur 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Faire tremper la membrane de nitrocellulose et deux piles de transfert de mini-taille dans un tampon d’électrophorèse (voir le tableau des matériaux pour la composition, préparer selon les instructions du fabricant) pendant quelques minutes avant le transfert western.
  4. Placez la membrane tachée dans une boîte et bloquez-la pendant 1 h dans une solution bloquante (0,1% Tween-20 dans du PBS (PBST) + 5% de lait). Incuber la membrane avec la solution bloquante sous une légère agitation.
  5. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.

6. Détection de Western blot

  1. Ajouter le premier anticorps primaire à la dilution indiquée (voir le tableau des matériaux)à la membrane et l’incuber pendant la nuit à 4 °C avec une agitation douce.
  2. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
  3. Incuber la membrane avec 20 mL d’anticorps secondaires (dilués 1:10 000 dans du PBST + 5% de lait) en agitant doucement pendant 1 h à température ambiante.
  4. Lavez la membrane trois fois avec pbST pendant 5 minutes à chaque lavage.
  5. Jeter le PBST et ajouter environ 1 mL de substrat de peroxydase de raifort à la membrane.
  6. Détecter le signal chimioluminescent (voir le Tableau des matériaux).
    REMARQUE: Le temps d’exposition et le nombre d’images capturées dépendent de la quantité de protéines dans la cellule et de la spécificité des anticorps utilisés. Il doit être établi empiriquement pour chaque anticorps utilisé pour la détection.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour analyser le recrutement de caspase-8 au DISC et son traitement au CD95 DISC, cet article décrit un flux de travail classique, qui combine l’IP du CD95 DISC avec l’analyse western blot. Cela permet de détecter plusieurs caractéristiques clés de l’activation de la caspase-8 au DISC : l’assemblage de la plateforme macromoléculaire activant la caspase-8, le recrutement de la procaspase-8 dans le DISC, et le traitement de cette caspase initiatrice(Figure 1 et Figure 2).<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette approche a été décrite pour la première fois par Kischkel et al.27 et a été développée avec succès depuis lors par plusieurs groupes. Plusieurs questions importantes doivent être prises en compte pour une immunoprécipitation DISC efficace et une surveillance du traitement de la caspase-8 dans ce complexe.

Tout d’abord, il est essentiel de suivre toutes les étapes de lavage pendant l’immunoprécipitation. Les dernières étapes de lavage des perles de sépharose et le ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions la Fondation Wilhelm Sander (2017.008.02), le Centre des systèmes dynamiques (CDS), financé par le programme de l’UE FEDER (Fonds européen de développement régional) et la DFG (LA 2386) pour leur soutien à notre travail. Nous remercions Karina Guttek d’avoir soutenu nos expériences. Nous remercions le professeur Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) de nous avoir fourni des lymphocytes T primaires.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12,5 % de SDSgel fait maisonpour deux gels de séparation :
3,28 mL distillé H2O
2,5 mL Tris ; pH 8,8 ; 1,5 M
4,06 mL acrylamide
100 µ ; L 10 % FDS
100 & micro ; L 10 % APS
7.5 & micro ; L TEMED

pour deux gels collecteurs :
3,1 mL de H2O
1,25 mL de Tris ; pH 6,8 ; 1,5 M
0,5 mL d’acrylamide
50 & micro ; L 10 % FDS
25 & micro ; L 10 % APS
7.5 & micro ; L TEMED
14,5 cm Boîtes cellulairesGreiner639160
acrylamideCarl RothA124.1
Pointes de pipette de filtre à aérosol avec filtre à haute récupération et orifice largeVWR46620-664 (Amérique du Nord) ou 732-0559 (Europe)Utilisé pour le pipetage des billes vers le lysat
anti-actine AbSigma AldrichA2103dilution : 1:4000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abfourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par EnzoALX-805-038-C100utilisé uniquement pour l’immunoprécipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3dilution : 1:1000 en PBST + 1:100 NaN3
signalisation cellulaire en anticorps anti-caspase-3DilutionS: 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZOALX-804-242-C100dilution : 1:20 en PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715dilution : 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abfourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZOALX-804-961-0100dilution : 1:10 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abfourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZOADI-AAM-212-Edilution : 1:10 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Signalisationcellulaire9542dilution : 1:1000 dans PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
&beta ;-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006utilisé selon les instructions du fabricant
CD95Lfournies dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZOALX-522-020-C005
détecteur de chimioluminescence
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001préparé selon les instructions du fabricant
DPBS (10x) sans Ca, MgPANBiotech P04-53500dilution 1:10 avec H2O, stockage au réfrigérateur
fait maison10x tampon d’électrophorèse :
60,6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
dilution 1:10 avant utilisation
glycineCarl Roth3908.3
Chèvre Anti-souris IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05dilution 1:10.000 in PBST + 5 % de lait
de chèvre Anti-souris IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05dilution 1:10.000 in PBST + 5 % de lait
de chèvre Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05dilution 1:10.000 dans PBST + 5 % de lait
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001pour l’activation des lymphocytes
T KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
tampon de chargement
4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL		Bio Rad161-0747préparé selon les instructions du fabricant
Substrat Luminata Forte Western HRPMilliporeWBLUFO500
Tampon de lysefait13,3 mL Tris-HCl ; pH 7,4 ; 1,5 M
27,5 mL NaCl ; 5 M
10 mL EDTA ; 2 mM
100 mL Triton X-100
ajouter 960 mL H2O
pour cellules adhérentes DMEM F12 (1:1) avec glutamine stable, 2 438 g/LPAN BiotechP04-41154ajoutant 10 % de FCS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,0001 % de puromycine au milieu
pour cellules T primairesgibco par Life Technologie21875034ajoutant 10 % de FCS et 1 % de pénicilline-streptomycine au lait en
poudreCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTself made20x PBST :
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 avant utilisation
PBST + 5 % de laitfait50 g de lait en poudre + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801pour l’activation des cellules T
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Utilisation entre 3-5 & micro ; L
Protéine A Sepharose CL-4Bbilles Novodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01billes de résine d’affinité préparées selon les instructions du fabricant
grattoirVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
azoture de sodiumCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-sizetransfer stacks Bio Rad170-4270utilisé selon les instructions du fabricant
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938préparé selon les instructions du fabricant
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulosemembrane Bio Rad170-4270utilisé selon les instructions du fabricant
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
AB tampon d’élétrophorèse maison maison

References

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