Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.
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Article de méthode
Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules
Dans cet article
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Résumé
Résumé
La synthèse de protéines sans cellules (CFPS) s’est développée en tant que plate-forme biotechnologique qui capture les mécanismes de transcription et de traduction in vitro. De nombreux développements ont rendu la plate-forme CFPS plus accessible aux nouveaux utilisateurs et ont élargi la gamme d’applications. Pour les systèmes CFPS à base de lysat, des extraits cellulaires peuvent être générés à partir d’une variété d’organismes, exploitant la biochimie unique de cet hôte pour augmenter la synthèse des protéines. Au cours des 20 dernières années, Escherichia coli (E. coli) est devenu l’un des organismes les plus largement utilisés pour soutenir le SFC en raison de son prix abordable et de sa polyvalence. Malgré de nombreuses avancées clés, le flux de travail pour la préparation de l’extrait de cellules d’E. coli est resté un goulot d’étranglement clé pour les nouveaux utilisateurs qui souhaitent mettre en œuvre CFPS pour leurs applications. Le flux de travail de préparation des extraits prend beaucoup de temps et nécessite une expertise technique pour obtenir des résultats reproductibles. Pour surmonter ces obstacles, nous avons déjà signalé le développement d’un flux de travail d’auto-induction sans cellule (CFAI) 24 heures sur 24 qui réduit les entrées des utilisateurs et l’expertise technique requise. Le flux de travail CFAI minimise le travail et les compétences techniques nécessaires pour générer des extraits de cellules tout en augmentant les quantités totales d’extraits de cellules obtenues. Nous décrivons ici ce flux de travail étape par étape afin d’améliorer l’accès et de soutenir la mise en œuvre à grande échelle du CFPS basé sur E. coli .
Introduction
L’utilisation de la synthèse de protéines sans cellules (CFPS) pour les applications biotechnologiques a considérablement augmenté au cours des dernières années 1,2,3. Cette évolution peut être attribuée en partie aux efforts accrus déployés pour comprendre les processus qui se produisent dans le SCFFC et le rôle de chaque composante 4,5. En outre, la réduction des coûts attribuée aux configurations optimisées et aux sources d’énergie alternatives a rendu la technologie sans cellules plus facile à mettre en œuvre pour....
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Protocole
1. Croissance des médias
- Préparer 960 mL de milieu CFAI comme décrit dans le tableau 1 et ajuster le pH à 7,2 à l’aide de KOH.
- Transférer le milieu de culture dans une fiole et un autoclave déconcertés de 2,5 L pendant 30 min à 121 °C.
- Préparer une solution de sucre de 40 ml comme décrit dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution dans un récipient en verre autoclavé séparé.
REMARQUE: La solution de sucre peut être stockée dans un incubateur à 30 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure. - Laisser le fluide refroidir complètement à moins de 40 °C après l’autoclavage.
- Avant l’inocu....
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Résultats
Lors de la préparation des milieux CFAI, le glucose a été échangé contre une augmentation du lactose et du glycérol en tant que principal substrat énergétique dans le milieu. De plus, la capacité de mise en mémoire tampon des médias CFAI a également été augmentée. Ces composantes spécifiques sont données dans le tableau 1.
Les cellules ont ensuite été cultivées à la fois à un OD600 de 10 et à la norme 2,5 dans les milieux CFAI pour montrer une cohérence avec la qual.......
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Discussion
La surveillance des chercheurs est traditionnellement nécessaire pour deux actions clés au cours de la croissance cellulaire : l’induction de l’ARNR T7 et la récolte de cellules à un OD600 spécifique. CFAI élimine ces deux exigences pour réduire le temps du chercheur et la formation technique requise pour préparer des extraits cellulaires de haute qualité. L’auto-induction de l’ARNR T7 est obtenue en remplaçant le glucose par du lactose comme sucre primaire dans le milieu, éliminant ainsi le besoin précédent d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier jennifer VanderKelen et Andrea Laubscher pour leur soutien technique. Les auteurs tiennent également à remercier Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington et Jillian Kasman pour leurs discussions utiles. Les auteurs reconnaissent également le soutien financier du Bill and Linda Frost Fund, de la Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant du Center for Applications in Biotechnology, de Cal Poly Research, Scholarly et de la National Science Foundation (NSF-1708919).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes microfuges de 1,5 mL | Phénix | MPC-425Q | |
| Tube à centrifuger 1L | Beckman Coulter | A99028 | |
| Centrifugeuse Avanti J-E | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Lecteur multimode | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose Alfa | Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Acide folinique | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycérol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Soc | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| Acide L-Aspartique | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cystéine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| Acide L-Glutamique | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Méthionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-phénylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Thréonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophane | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Bouillon Luria | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Eau de qualité moléculaire | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| Nouveau-Brunswick Innova 42/42R Incubateur | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTP | ThermoFisher | R0481 | |
| Acide oxalique | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Phosphate de potassium Dibasic | Acros, Organiques | A0382124 | |
| Phosphate de potassium Acros monobasiques | , Organiques | A0379904 | |
| PureLink HiPure Kit de préparation de plasmide | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| ARNt | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Processeur | à ultrasonsQSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Extrait de levure | Fisher Bioréactifs | 1/2/8013 |
Références
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics.....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
