Article de méthode

Fluorescence en direct, imagerie inverse du bourrelet cellulaire et macropinocytose

DOI :

10.3791/62870

⸱

5 août 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole démontre l’imagerie du dextran dans des cellules vivantes à l’aide d’une absorption continue et d’images inverses pour optimiser la visualisation du froissement, la maturation des macropinosomes et l’analyse du dextran et d’autres marquages cellulaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La macropinocytose est un processus hautement conservé mais encore incomplètement compris, essentiel à l’absorption et à l’ingestion de liquides, de nutriments en phase liquide et d’autres matériaux dans les cellules. L’extension spectaculaire des volants de surface cellulaire, leur fermeture pour former des macropinosomes et la maturation des macropinosomes internalisés sont des événements clés de cette voie qui peuvent être difficiles à capturer à l’aide de l’imagerie confocale conventionnelle basée sur le suivi d’un bolus de cargaison fluorescente. Les dextrans fluorescents sont couramment utilisés expérimentalement comme marqueurs de phase fluide pour les macropinosomes et pour d’autres voies endocytaires. Une méthode adoptée par le laboratoire pour optimiser l’imagerie de l’absorption de dextran consiste à utiliser l’imagerie en direct de cellules baignées dans de fortes concentrations de dextran fluorescent dans le milieu, les cellules non marquées apparaissant en relief (sous forme de noir). Les volants cellulaires sont mis en évidence pour visualiser la fermeture du volant, et les macropinosomes internalisés apparaissent sous forme de vacuoles fluorescentes à l’intérieur des cellules. Cette méthode est optimale pour visualiser les caractéristiques des macropinosomes et permet une segmentation et une quantification faciles. Cet article décrit le double marquage de voies avec des dextrans de différentes tailles et la co-expression de sondes lipidiques et de protéines membranaires fluorescentes pour marquer les macropinosomes et autres endosomes. La détection du dextran internalisé à un niveau ultrastructural à l’aide de la microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique (CLEM) est également démontrée. Ces processus cellulaires peuvent être imagés à l’aide de plusieurs modalités d’imagerie en direct, y compris en 3D. Ensemble, ces approches optimisent l’imagerie des macropinosomes pour de nombreux contextes et systèmes expérimentaux différents.

Introduction

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La plupart des types de cellules de vertébrés partagent la capacité innée d’absorption non sélective de liquide avec leurs prédécesseurs tout au long de l’évolution, remontant à l’amibe unicellulaire1. Ce processus hautement conservé d’absorption de la phase liquide par macropinocytose (grande consommation d’alcool) est utilisé par les amibes principalement pour l’acquisition de nutriments1, tandis que dans les cellules de vertébrés, il peut également être une voie d’approvisionnement pour obtenir des nutriments en cas de stress, et il est utilisé par les cellules immunitaires pour l’échantillonnage et la surveillance des environnements tissulaires2. La macropinocytose présente des caractéristiques qui la distinguent des autres formes d’endocytose, notamment les macropinosomes vacuolaires distinctifs (>0,2 mm de diamètre), la nature non sélective de l’absorption de liquide et de soluté et les étendues de membrane plasmique qui l’accompagnent qui sont internalisées de manière opportuniste dans les macropinosomes3. La nature non sélective de cette absorption signifie que le tri et le recyclage doivent se faire rapidement pour sauver les protéines solubles essentielles et les protéines membranaires plasmiques en les recyclant à la surface de la cellule. Une grande partie du matériel absorbé dans les macropinosomes est destinée à la dégradation dans les lysosomes, et il est acheminé dans les voies endo/lysosomales par la maturation des macropinosomes et la fusion avec d’autres endosomes. Les protéines de la membrane plasmique peuvent également être recyclées à la surface cellulaire à partir des macropinosomes. Le domaine du cancer suscite un vif intérêt pour la compréhension du processus de macropinocytose, qui est activé dans les cellules cancéreuses et aide à maintenir leur nutrition et leur prolifération 2,4,5,6. La macropinocytose se produit à la fois de manière constitutive et peut être induite lors d’une stimulation médiée par les récepteurs dans les cellules immunitaires, où les macropinosomes hébergent la signalisation des récepteurs, contribuent au traitement endo/lysosomal pour la présentation de l’antigène et fournissent une porte d’entrée pour une variété de virus, de bactéries et d’autres agents pathogènes 3,7.

Les macropinosomes ont peu de marqueurs distinctifs ou uniques. Ils sont plus facilement identifiés lors de leur formation à la base de volants cellulaires spectaculaires et riches en actine, qui sont près d’engloutir le liquide8. Immédiatement après la fermeture, l’actine F autour des macropinosomes est dépolymérisée et les macropinosomes eux-mêmes subissent des changements dynamiques associés à la fusion, à la tubulation et au rétrécissement homo- et hétérotypiques9. Les macropinosomes sont également difficiles à identifier à un niveau ultrastructurel car ils n’ont pas de manteau caractéristique ou d’autres caractéristiques et apparaissent simplement comme des vacuoles de tailles variables. En l’absence de marqueurs membranaires définitifs, les macropinosomes sont plus facilement et traditionnellement définis par leur cargaison fluide, ce qui, expérimentalement, se fait par l’utilisation de dextran fluorescent. Le dextran est un polysaccharide complexe dérivé du glucose qui peut être couplé à un large éventail de marqueurs fluorescents ou denses en électrons et ajouté au milieu pour être absorbé par les cellules ou perfusé pour être absorbé dans les tissus. De plus, le dextran de grand poids moléculaire (MW) (70 kDa) est maintenant considéré comme une cargaison sélective pour les macropinosomes car il ne pénètre pas dans d’autres vésicules endocytaires plus petites, et il est devenu le marqueur le plus courant pour la macropinocytose10,11. L’observation de la macropinocytose implique généralement l’incubation de cellules avec une impulsion de dextran fluorescent et l’utilisation de cellules fixes ou vivantes pour l’imagerie de fluorescence afin de visualiser le marquage du bolus de dextran à l’intérieur des cellules des macropinosomes. En raison de leur grande taille, les macropinosomes non marqués peuvent également être observés dans certains types de cellules à l’aide de la microscopie à contraste de phase ou à fond clair, dans laquelle les macropinosomes apparaissent sous la forme de grandes vacuoles blanches vides. Certaines informations contextuelles sont obtenues à partir des images en contraste de phase des cellules, et ces images peuvent ensuite être superposées avec des images de fluorescence pour décrire l’absorption de dextran fluorescent12,13. Des dextrans de différentes tailles et avec des marqueurs distincts peuvent être utilisés pour surveiller l’absorption de liquide dans plusieurs voies cellulaires et endocytaires 10,14,15 et le dextran peut être appliqué à des cultures cellulaires ou perfusé à des souris pour l’imagerie intra-vitale16 ou même injecté dans des embryons de mouches17 pour l’imagerie en direct.

Parmi les difficultés rencontrées lors de l’utilisation du dextran pour suivre les macropinosomes, citons sa fuite hors des macropinosomes après la fixation ou la perméabilisation des cellules, ses niveaux dilués ou difficiles à détecter dans les cellules qui n’effectuent pas de macropinocytose agressive, et son déploiement dynamique et sa dispersion à l’intérieur des cellules pendant la maturation des macropinosomes3. Ces problèmes sont aggravés dans la plupart des expériences, qui sont conçues pour suivre l’absorption d’une seule impulsion de dextran ajoutée aux cellules puis lavée.

Au lieu de cela, cet article décrit les avantages de l’application de dextran fluorescent sur les cellules et de le laisser dans le milieu pendant l’imagerie en direct pour enregistrer l’absorption continue dans les cellules. Cela amplifie le signal dextran dans les macropinosomes et les endosomes ultérieurs, montrant ainsi toute la voie de maturation. L’observation des macropinosomes marqués sur l’intérieur non marqué (noir) des cellules, en tant que réglage inverse à contraste élevé, révèle toutes les caractéristiques des macropinosomes et, inversement, à l’extérieur des cellules, le milieu hautement fluorescent met en évidence le froissement dynamique de la surface cellulaire. Cette méthode décrit l’imagerie en direct du dextran pour la microscopie optique, l’imagerie confocale, et pour sa détection après fixation cellulaire par microscopie corrélative à la lumière et au microscope électronique (CLEM). L’imagerie incluse ici a été réalisée sur différents types de cellules pour démontrer la large applicabilité de ces approches, y compris les macrophages activés et les cellules microgliales, où la macropinocytose est très active et rapide, et dans les cellules cancéreuses où la macropinocytose est relativement moins abondante.

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Protocole

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1. Préparation des cellules sur des plats à fond de verre de 35 mm (Jour 0)

  1. Maintenir et faire passer des lignées cellulaires en milieu complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (pour RAW264.7) ou régulier et 1 % de L-glutamine, à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  2. Plaquez le nombre approprié de cellules pour obtenir une confluence de 60 % en 24 h, sur des plats à fond de verre de 35 mm.
    REMARQUE : La densité cellulaire recommandée est comprise entre 2 mL de 0,15 x 106 cellules/mL et 0,25 x 106 cellules/mL pour les cellules microgliales RAW264.7, BV2 et MDA-MB 231 cellules cancéreuses du sein décrites ici.

2. Transfection de plasmide d’ADN par fluorescence (Jour 1) - Facultatif

REMARQUE : Différentes protéines et sondes marquées par fluorescence peuvent être exprimées de manière transitoire ou stable dans des lignées cellulaires clonées pour marquer spécifiquement les volants et les compartiments d’actine dans la voie endocytaire tels que les endosomes précoces, les endosomes tardifs ou les lysosomes.

  1. Transfecter les cellules à l’aide d’un kit de transfection à base de lipides selon les instructions du fabricant, 1 jour après le placage dans une hotte de culture tissulaire.
  2. Diluer 2 μg de plasmide d’ADN purifié exempt d’endotoxines dans 125 μL de milieu essentiel minimum (sérum réduit). Mélangez délicatement et laissez reposer 5 min à température ambiante.
  3. Diluer 5 μL d’agent de transfection dans 125 μL de milieu essentiel minimum (sérum réduit). Mélangez délicatement et laissez reposer 5 min à température ambiante.
  4. Combinez le plasmide d’ADN dilué et le réactif de transfection dilué et incubez pendant encore 10 minutes avant d’ajouter goutte à goutte aux cellules.
  5. Incuber les cellules avec complexe de transfection à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 3-4 h, avant de les remplacer par un milieu de culture frais et complet.
  6. Utilisez les cellules transfectées le lendemain pour des expériences ou soumises à un clonage à dilution limitée pour obtenir des lignées cellulaires exprimant de manière stable.

3. Visualisation des vésicules endocytaires et des macropinosomes (Jour 2)

REMARQUE : Des dextrans fluorescents (Dextran Alexa Fluor 488/647 à 10 kDa MW, et Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine à 70 kDa MW, Anionic, Lysine fixable) de différents poids moléculaires sont utilisés pour surveiller l’absorption de la phase liquide dans une gamme de voies endocytaires14. 70 kDa de dextran pour les macropinosomes et 10 kDa pour toutes les voies.

  1. Préparer le dextran sous forme de suspension concentrée 2x à 200-500 ng/mL dans un milieu de culture préchauffé pour l’ajout aux cellules.
  2. FACULTATIF : Les expériences peuvent nécessiter l’ajout préalable ou simultané de suppléments ou de médicaments pour influencer l’activité endocytaire. Par exemple, prétraitez les macrophages et les cellules microgliales avec des facteurs de croissance (par exemple, 200 ng/mL de CSF-1) ou des ligands activateurs (par exemple, LPS 100 ng/mL ou 300 ng/mL de CpG) pour améliorer le froncement et la macropinocytose. Cultivez les cellules cancéreuses dans un milieu exempt de sérum approprié pendant 12 à 16 h avant l’absorption du dextran dans le milieu complet. Reportez-vous à l’étape 1.2 pour la densité cellulaire recommandée.
  3. Pour se préparer à l’imagerie en direct, positionnez les cellules cultivées dans des boîtes à fond de verre sur la platine d’un microscope confocal inversé équipé d’un coussin chauffant à 37 °C et d’un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  4. Aspirez l’excédent de fluide en laissant 500 μL du fluide complet dans le plat à fond de verre.
  5. Trouvez une région appropriée de cellules et réglez la mise au point. Pour l’imagerie en accéléré, présélectionnez les lasers à fluorescence, les filtres et les paramètres appropriés avant l’acquisition. Utilisez les paramètres suivants pour résoudre les cellules individuelles et les macropinosomes.
    1. Imagez la région d’intérêt sur un microscope confocal inversé avec un objectif apochromatique Plan d’immersion dans l’huile 63x 1,4 NA.
    2. Sélectionnez 512 x 512 pour la taille de l’image, balayage bidirectionnel pour une imagerie rapide.
    3. Concentrez-vous sur un plan focal individuel des cellules. Définir pour capturer en une seule tranche ou définir une épaisseur de tranche optique (Nyquist) d’environ 0,3 μm pour combiner en Z-stacks.
    4. Sélectionnez le time-lapse avec un intervalle de 5 s, pour une durée comprise entre 20 et 45 min selon les types de cellules spécifiques.
    5. Sélectionnez la mise au point automatique/le suivi de la mise au point matérielle pour faciliter la stabilisation de l’image pendant la capture pendant une durée appropriée en fonction des types de cellules spécifiques.
    6. Ajoutez un volume égal de milieu dopé au dextran 2x et démarrez immédiatement la capture d’images en direct pour les macrophages. Attendez 20 min avant d’imager l’absorption plus lente dans les cellules MDA-MB 231.
      REMARQUE : Avec cette méthode, les cellules BV2 avec deux canaux fluorophores ont été imagées avec succès sur un seul plan avec suivi de vitesse maximale, en continu pendant 45 min lors de l’ajout du mélange de dextran. Pour détecter les macropinosomes précoces dans les cellules RAW 264.7, où la macropinocytose se produit très rapidement, acquérez une tranche unique (pour l’imagerie rapide) ou une pile Z de 4 à 6 tranches (pour la capture 3D) et un time-lapse avec un intervalle de 5 s pendant 20 min lors de l’ajout de dextran. Pour les cellules MDA-MB 231, obtenez des piles Z optimales entre 10 et 15 tranches, avec des intervalles de 5 s pendant 40 minutes.

4. Microscopie corrélative à la lumière et électronique (CLEM) (Jour 3) - Facultatif

  1. Préparez les cellules selon les étapes 1, 2 et 3 du protocole avec les adaptations. En bref, faire pousser 0,2 x 10 cellules RAW264.7 de6 cellules/ml sur des plats à fond de verre grillagé (plat de 35 mm, lamelle quadrillée n° 1.5, diamètre du verre de 14 mm, non revêtu), transfecter avec un plasmide fluorescent (par exemple, mCherry-2xFYVE) et laisser reposer toute la nuit avant l’ajout de dextran-488 (70 kDa) pendant 20 minutes à 37 °C, incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  2. Lavez rapidement les cellules avec 1 ml de PBS glacé et fixez avec 0,1 % de glutaraldéhyde.
  3. Acquérez les images de cellules fixes du dextran-488 et du mCherry-2xFYVE sur un microscope confocal.
  4. Capturez des images en fond clair pour identifier les positions de la grille avant que les paraboles ne soient traitées pour la microscopie électronique à transmission (EM), comme décrit précédemment18. En bref, fixez les cellules dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, postfixez dans du tétroxyde d’osmium réduit à 1 %, coloriez en bloc avec de l’acétate d’uranyle à 2 %, puis déshydratez-les à travers une série d’éthanol avant de les intégrer dans de la résine LX112. Excisez les emplacements quadrillés du bloc et collectez les sections ultra-minces à l’aide d’un ultra-microtome. Capturez des images au microscope électronique à 80 kV à l’aide d’un logiciel de système d’imagerie approprié.

5. Traitement et visualisation des données (jour 4)

REMARQUE : FIJI - un progiciel d’analyse d’images open source - est utilisé pour la visualisation et l’analyse33.

  1. Dupliquer les données brutes pour le traitement afin de se conformer aux principes de données F.A.I.R., c’est-à-dire que les données de recherche sont trouvables, accessibles, interopérables et réutilisables.
  2. Ajustez la luminosité et le contraste des jeux d’images de manière égale à l’aide des données de l’histogramme.
  3. Affichez les images sous forme de projections d’intensité maximale à partir des images de la pile Z acquises.
  4. Insérer une barre d’échelle pour les visionneuses d’images.
  5. Recadrer/faire pivoter les données FOV (facultatif). Créez des panneaux représentatifs pour les données de séries chronologiques.
  6. Pour une analyse et une quantification plus approfondies, quantifiez l’intensité de fluorescence du dextran absorbé dans les cellules comme mesure de l’activité de la macropinocytose. Pour limiter l’analyse à des cellules individuelles, utilisez la méthode d’imagerie décrite ici.
    1. Inversez la LUT pour inverser la couleur des zones de cellules dépourvues de fluorescence afin d’effectuer le seuillage.
    2. Segmentez l’objet de premier plan et créez un masque de cellule pour identifier les cellules individuelles.
    3. Utilisez le masque cellulaire en conjonction avec une méthode19 précédemment publiée qui identifie et mesure les macropinosomes individuels. Utilisez ces paramètres pour quantifier la macropinocytose, y compris la taille, le nombre et l’absorption totale par cellule.

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Résultats

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L’approche consistant à imager des cellules vivantes non marquées immergées dans une forte concentration de dextran fluorescent présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d’imagerie conventionnelles pour le suivi de la macropinocytose. En présentant les images en relief, les corps cellulaires apparaissent en noir et permettent une meilleure visualisation de la surface cellulaire spectaculaire sur un fond brillant et fluorescent, suivie d’une internalisation en phase fluide des macropinosomes remplis de TMR d...

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Discussion

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Cet article décrit des variantes de méthodes plus traditionnelles d’utilisation du marquage au dextran pour suivre la macropinocytose, basées sur l’imagerie en direct de cellules baignées en continu dans du dextran fluorescent et la visualisation de l’absorption sur fond noir de cellules non marquées. Le protocole optimisé fournit les moyens de distinguer les différentes vésicules intracellulaires et permet un suivi spatio-temporel de plusieurs cargaisons et protéines macropinocytotiques...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

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Les auteurs remercient Tatiana Khromykh pour son assistance technique experte. L’imagerie par fluorescence a été réalisée en microscopie IMB intégrant le Cancer Ultrastructure and Function Facility financé par l’Australian Cancer Research Foundation ; La microscopie électronique a été réalisée au Centre de microscopie et de microanalyse de l’UQ. Le financement a été reçu du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie (JLS APP1176209) et du Conseil australien de la recherche (DP180101910). NDC est soutenu en tant que scientifique en imagerie CZI par la subvention numéro 2020-225648 de l’initiative Chan Zuckerberg DAF, un fonds conseillé de la Silicon Valley Community Foundation. YH a été soutenu par une bourse de doctorat du gouvernement australien et un financement du programme de recherche sur la maladie d’Alzheimer de Yulgilbar. Z-JX a été soutenu par une bourse de l’Académie chinoise des sciences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sondes moléculaires de tétroxyde d’osmium à 2 %ProSciTechEMS19192
647-transferrine, Invitrogen  ; Cellules T23366
BV2Don aimablement offert par le Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Classe B) BIntegrated DNA TechnologiesCommande
Dextran Alexa Fluor 488  ; à 10 kDa MW LifeTechnology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  ; à 10 kDaMW Life Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 à 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine à 70 kDaMW Life Technology Australia Pty LtdD7173
Milieu DMEM avec pyruvate de sodium et L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Sérum de veau fœtalInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Solution aqueuse de glutaraldéhyde, grade EM 25 %ProSciTechC002
Jeol 1011 microscope électroniqueJEOL-L-Glutamine
Gibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  ; Plat à fond en verre 35 mm, grille non revêtueMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
Plats à fond en verre MatTek 35 mm non revêtusMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellulesATCCHTB-26
Opti-MEM milieu sérique réduitThermo Fisher Scientific31985088
Plasmide mCherry-2XFYVEDon aimablement offert par le Dr Frédéric Meunier (Université du Queensland)-
Plasmide mCherry-PLC&delta ;-PHDon aimablement offert par le Dr Frédéric Meunier (Université du Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640, sans L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Acétate d’uranyleProSciTechC079
Microscope confocal inversé Zeiss LSM880Zeiss-
personnalisée

Références

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Imagerie de fluorescence en directformation de macropinosomesdextran fluorescentcaptation de phase fluidemicroscopie lectronique et optique corr lativemarquage des prot ines membranairesvoies endocytaires
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