Immunocoloration flottante libre du cerveau des souris

Résumé

Ce protocole décrit une approche efficace et reproductible pour les études histologiques du cerveau de souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante, le montage tissulaire et l’imagerie.

Résumé

La coloration immunohistochimique du cerveau des souris est une technique de routine couramment utilisée en neurosciences pour étudier les mécanismes centraux sous-jacents à la régulation du métabolisme énergétique et d’autres processus neurobiologiques. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des résultats de l’histologie cérébrale peuvent varier d’un laboratoire à l’autre. Pour chaque expérience de coloration, il est nécessaire d’optimiser les procédures clés en fonction des différences d’espèces, de tissus, de protéines ciblées et des conditions de travail des réactifs. Cet article démontre un flux de travail fiable en détail, y compris la perfusion intra-aortique, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante librement, le montage tissulaire et l’imagerie, qui peuvent être facilement suivis par les chercheurs dans ce domaine.

Il est également question de la façon de modifier ces procédures pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Pour illustrer la fiabilité et l’efficacité de ce protocole, les filets périneuronaux ont été colorés avec de la glycine florbunda agglutinine (WFA) marquée à la biotine et de la vasopressine d’arginine (AVP) avec un anticorps anti-AVP dans le cerveau de la souris. Enfin, les détails critiques pour l’ensemble de la procédure ont été abordés, et les avantages de ce protocole par rapport à ceux d’autres protocoles. Pris ensemble, cet article présente un protocole optimisé pour l’immunocoloration flottante du tissu cérébral de souris. Le respect de ce protocole facilite ce processus pour les scientifiques débutants et supérieurs afin d’améliorer la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des études immunocolorantes.

Introduction

La prévalence de l’obésité et des comorbidités associées a atteint des niveaux épidémiques, ce qui a entraîné un énorme fardeau socioéconomique1,2. Divers modèles murins ont été développés pour mieux comprendre les processus biologiques responsables de l’obésité3,4. Parce que les mécanismes centraux sont importants pour la régulation de l’homéostasie énergétique dans ces modèles animaux, les études neuroanatomiques du cerveau des souris sont devenues une technique nécessaire dans ce domaine. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité de....

Protocole

Des souris C57BL/6J des deux sexes (âgées de 8 à 16 semaines) ont été utilisées dans la présente étude. Les soins de tous les animaux et de toutes les procédures ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine.

1. Perfusion

REMARQUE: Les étapes 1.1 à 1.6 sont effectuées dans une hotte aspirante.

1. Anesthésie
   1. Verser 5 mL d’isoflurane (voir la Table des matériaux) sur une serviette en papier placée au fond d’un dessiccateur. Introduisez la souris sur la barrière trouée à l’intérieur du dessiccateu....

Résultats

L’organigramme de ce protocole est brièvement illustré à la figure 1. La procédure de cryosection de ce laboratoire est illustrée à la figure 2A, dans laquelle 5 échantillons de cerveau ont été sectionnés simultanément. Le montage des sections cérébrales est illustré à la figure 2B, et une diapositive entièrement montée avec des sections cérébrales est illustrée à la figure 2C. Dans

Discussion

Ce protocole fournit une méthode établie pour les études neuroanatomiques du cerveau de la souris, y compris la perfusion, la section des tissus, l’immunocoloration flottante libre, le montage tissulaire et l’imagerie. Cependant, quelques détails clés essentiels pour des résultats cohérents et fiables doivent être optimisés.

La qualité de la perfusion est essentielle pour une coloration réussie. Les résultats de la coloration peuvent être affectés si le sang reste dans le cerveau, étant donné .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Flour 594 âne anti-lapin IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
; 30 % de saccharose	VWR	470302	30 g de saccharose disséminé dans 100 mL de PBS
. Formol à tampon neutre	VWR	16004-128	10 %, 25 ° ; C, pH 6,8-7,2
1 mL Seringue Sub-Q	BD	309597
48 puits Plaque de culture cellulaire	Corning	3548
Plaque de culture cellulaire 6 puits	Corning	3516
Média de montage anti-décoloration avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Dessiccateur plastique autoclavable	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
Anticorps AVP	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Tampon cryoprotecteur	Préférence de l’utilisateur	Non applicable 20	% de glycérol, 30 % d’éthylène glycol et 50 % de PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Sans objet
Boîtes de lames de microscope (50 places)	VWR	Sans objet
PBT	Préférence de l’utilisateur	Non applicable	2,5 mL de Triton X-100 dissous dans 1000 mL de PBS
Perfusion Deux système de perfusion automatisé	Leica	39471005
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 ° ; C, pH 7,3-7,5, 1x composition :137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampon
phosphate Microtome coulissant Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Chlorure de sodium	RICCA Chemical	7220-32	0,9 %, 25 ° ; C, pH 7,4
Protéine streptavidine, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
Anticorps WFA	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Sans objet
Zen 3.1 logiciel			scanner