Article de méthode

Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène

DOI :

10.3791/62880

⸱

17 septembre 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie intestinale. Les ROS sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils sont produits en réponse à une infection ou à une blessure au niveau de la muqueuse car ils sont impliqués dans les réponses antimicrobiennes et la cicatrisation des plaies. Ils sont également des messagers secondaires essentiels, régulant plusieurs voies, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. D’autre part, des niveaux excessifs de ROS conduisent à un stress oxydatif, qui peut être délétère pour les cellules et favoriser les maladies intestinales comme l’inflammation chronique ou le cancer. Ce travail fournit une méthode simple pour détecter les ROS dans les organoïdes murins intestinaux par imagerie en direct et cytométrie en flux, à l’aide d’une sonde fluorogénique disponible dans le commerce. Ici, le protocole décrit le dosage de l’effet des composés qui modulent l’équilibre redox dans les organoïdes intestinaux et détectent les niveaux de ROS dans des types de cellules intestinales spécifiques, illustré ici par l’analyse des cellules souches intestinales génétiquement marquées avec GFP. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres sondes fluorescentes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils peuvent également être produits activement par des complexes enzymatiques spécialisés tels que les NADPH-oxydases (NOX) et les oxydases doubles (DUOX) liées à la membrane, qui génèrent des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène1. En exprimant des enzymes antioxydantes et des piégeurs de ROS, les cellules peuvent ajuster finement leur équilibre redox, protégeant ainsi l’homéostasie tissulaire2. Bien que les ROS puissent être très toxiques pour les cellules et endommager l’ADN, les protéines et les lipides, ce sont des molécules de signalisation cruciales2. Dans l’épithélium intestinal, des taux modérés de ROS sont nécessaires pour la prolifération des cellules souches et progénitrices3; des niveaux élevés de ROS conduisent à leur apoptose4. Le stress oxydatif chronique est lié à de nombreuses maladies gastro-intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer. À titre d’exemple, dans un modèle murin de cancer intestinal induit par Wnt, une production élevée de ROS par activation des NADPH-oxydases s’est avérée nécessaire pour l’hyperprolifération des cellules cancéreuses5,6. Définir comment les cellules intestinales, en particulier les cellules souches, les cellules souches gèrent le stress oxydatif et comment l’environnement cellulaire peut avoir un impact sur cette capacité est essentiel pour mieux comprendre l’étiologie de cette maladie7.

Dans un tissu, différents types de cellules présentent un état oxydatif basal qui peut varier en fonction de leur fonction et de leur métabolisme et de l’expression de différents niveaux de molécules oxydantes et antioxydantes4,7. La surveillance des ROS in vivo est très difficile. Des colorants perméables cellulaires qui émettent de la fluorescence en fonction de leur état redox ont été développés pour visualiser et mesurer les ROS cellulaires dans les cellules vivantes et les animaux. Cependant, leur efficacité dépend de leur diffusion à l’intérieur des tissus vivants et de leur lecture rapide, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les modèles animaux8.

Dans le passé, l’étude de l’effet des composés sur la génération de ROS a été réalisée à l’aide de lignées cellulaires, mais cela peut ne pas refléter la situation in vivo . Le modèle organoïde intestinal, développé par le groupe clevers9, permet la croissance des cellules primaires intestinales ex vivo. La culture de cryptes intestinales dans des matrices, en présence de facteurs de croissance définis, conduit à des structures tridimensionnelles, appelées organoïdes (mini-intestin), qui reproduisent l’organisation crypte-villosité, avec des cellules des différentes lignées épithéliales tapissant une lumière interne, et les cellules souches intestinales résidant dans de petites protubérances ressemblant à des cryptes.

Ici, en tirant parti de ce modèle, une méthode simple est décrite pour étudier le stress oxydatif dans les cellules intestinales primaires à la résolution unicellulaire en ajoutant un colorant sensible aux ROS disponible dans le commerce dans le milieu de culture organoïde.

Les lecteurs de plaques sont souvent utilisés pour détecter la production de ROS dans une population totale. Ce protocole utilise la cytométrie en flux ou le test d’imagerie pour détecter les ROS dans un type cellulaire particulier avec des cellules génétiquement modifiées ou une coloration d’anticorps spécifique. Ce travail implique la culture d’organoïdes intestinaux de souris et la visualisation des ROS par imagerie confocale et quantification par cytométrie en flux. En utilisant des organoïdes de l’intestin grêle dérivés de souris Lgr5-GFP, il est possible d’analyser spécifiquement le niveau de stress oxydatif dans les cellules souches intestinales lors de différents traitements. Ce protocole peut être adapté pour tester l’influence de molécules exogènes, telles que le muramyl-dipeptide (MDP)10 dérivé du microbiote, sur l’équilibre ROS, après avoir stimulé les organoïdes avec les composés sélectionnés.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées après approbation par le Comité d’Utilisation de l’Institut Pasteur et par le Ministère de l’Agriculture Français n° 2016-0022. Toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’une hotte de culture tissulaire.

1. Préparation de réactifs et de matériaux pour la culture d’organoïdes intestinaux

  1. Pour préparer le milieu de culture de croissance, mélanger le DMEM/F-12 avancé complété par 1x glutamine, 1x solution de pénicilline/streptomycine (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL d’EGF murin, 20 μg/mL de Noggin murin 500 ng/mL de R-Spondin1 de souris (voir tableau des matériaux). Laissez le milieu à température ambiante (RT) pendant l’extraction de la crypte.
    REMARQUE: Congeler le milieu inutilisé dans des aliquotes à -20 °C. Évitez le gel et le dégel.
  2. Remplissez un tube de 50 mL avec 40 mL de DMEM/F-12 avancé et gardez-le sur la glace.
    REMARQUE : Conserver le milieu inutilisé à 4 °C. Il sera utilisé pour le passage des organoïdes.
  3. Préchauffez les plaques de culture cellulaire (μ-Slide 8 chambres de puits et/ou fond rond de 96 puits) dans l’incubateur à 37 °C.
  4. Dégel de la matrice de membrane basale (BMM) (voir Tableau des matériaux) aliquotes sur la glace (avant de commencer le protocole ou au moins 1 h avant le placage des cryptes).
    REMARQUE: Le BMM se solidifiera rapidement s’il n’est pas conservé au froid.
  5. Préparer une solution de lavage/rinçage en ajoutant une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % au DPBS (DPBS-P/S).
  6. Remplissez une boîte de Pétri de 100 mm avec 10 mL de DPBS-P/S froid. Remplissez six tubes de 15 mL avec 10 mL de DPBS et étiquetez-les de F1 à F6.
  7. Préparer 30 mL de solution d’EDTA de 10 mM par dilution à partir de 0,5 M d’EDTA dans du DPBS. Remplissez deux tubes de 15 mL avec 10 mL d’EDTA de 10 mM et étiquetez-les E1 et E2.
  8. Gardez toutes les solutions pré-refroidies à 4 °C et conservez-les sur la glace pendant la procédure.

2. Culture d’organoïdes intestinaux

  1. Sacrifiez une souris Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 à 10 semaines conformément aux règles et réglementations nationales.
  2. Recueillir 5 à 8 cm du jéjunum englobant la région située entre le duodénum (5 cm de l’estomac) et l’iléon (10 cm du caecum) et conserver dans le DPBS-P/S froid sur de la glace.
  3. Nettoyez le contenu intestinal en rinçant avec 5-10 mL de DPBS-P/S froid.
    REMARQUE: Les seringues de rinçage faites maison peuvent être obtenues en branchant une pointe de 200 μL sur une buse de seringue de 10 mL.
  4. Ouvrez l’intestin longitudinalement à l’aide de ciseaux à pointe à bille (voir tableau des matériaux) (pour éviter d’endommager les tissus).
  5. À l’aide d’une pince, transférer le tissu dans une boîte de Pétri contenant du DPBS-P/S froid à température ambiante et le secouer pour le rincer.
  6. Avec une pipette Pasteur en plastique, prélèvez l’intestin par aspiration et transférez-le dans un tube de 15 mL étiqueté E1 contenant 10 mL d’EDTA froid de 10 mM.
  7. Inverser le tube 3 fois et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  8. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférer le tissu dans le tube F1 contenant 10 mL de DPBS. Vortex pendant 2 min (sur le vortex normal, en tenant le tube à la main et en veillant à ce que l’intestin tourbillonne bien).
  9. Mettez 10 μL de la fraction dans une boîte de Pétri et évaluez la qualité de la fraction au microscope.
    REMARQUE: Toutes les étapes du vortex sont effectuées à la vitesse maximale et la qualité de chaque fraction doit être évaluée au microscope (Figure 1).
  10. Avec une pipette Pasteur en plastique, saisir l’intestin par aspiration et le transférer dans le tube F2 contenant 10 mL de DPBS et vortex pendant 2 min.
  11. Répétez l’étape 2.10, en transférant le tissu dans le tube F3 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 2 min.
  12. Répétez l’incubation de l’EDTA comme à l’étape 2.6, en transférant le tissu dans le tube E2 contenant 10 mM d’EDTA.
  13. Inverser le tube 3 fois et incuber sur de la glace pendant 5 min.
  14. Répétez l’étape 2.10, en transférant le tissu dans le tube F4 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
  15. Répétez l’étape 2.14, en transférant le tissu dans le tube F5 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
  16. Répétez l’étape 2.15, en transférant le tissu dans le tube F6 contenant 10 mL de DPBS et le vortex pendant 3 min.
  17. Combinez les meilleures fractions filtrant par gravité à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube de 50 mL (sur glace) pour éliminer les villosités et les débris importants.
    REMARQUE: Habituellement, F5 et F6 sont les fractions contenant de nombreuses cryptes et moins de débris.
  18. Faire tourner les cryptes à 150 x g à 4 °C pendant 3 min.
  19. Videz le tube, perturbez mécaniquement la pastille et ajoutez 5 mL de DMEM/F12 froid.
  20. Mettez 10 μL de la suspension dans une boîte de Pétri et comptez manuellement le nombre de cryptes présentes dans l’aliquote au microscope.
    REMARQUE: Ne comptez pas les cellules individuelles ou les petits débris.
  21. Calculer le volume (V) de suspension de cryptes requis en μL, en considérant que 300 cryptes sont plaquées par puits, W est le nombre de puits et N est le nombre de cryptes comptées sur 10 μL de la suspension. Transférez les cryptes dans un nouveau tube de 15 mL.
    REMARQUE : V = 300 x L x 10/N. Si un petit volume est utilisé dans l’expérience prévue, un tube de centrifugeuse de 1,5 mL peut être utilisé.
  22. Faire tourner les cryptes à 200 x g à 4 °C pendant 3 min.
  23. Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
  24. Perturber mécaniquement la pastille et ajouter doucement le milieu de culture de croissance pour obtenir une concentration de 90 cryptes/μL.
  25. Ajouter 2 volumes de BMM non dilué pour obtenir une concentration finale de 30 cryptes/μL. Pipeter soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
    REMARQUE: Gardez toujours le tube sur la glace pour éviter la solidification BMM.
  26. Plaque 10 μL des cryptes/BMM se mélangent dans chaque puits. Pour l’analyse par cytométrie en flux, utilisez des plaques à fond rond de 96 puits. Répartir 10 μL au centre de chaque puits sous forme de dôme. Pour l’imagerie, utilisez μ-slide 8 (voir tableau des matériaux) et déposez les 10 μL sous forme de couche mince.
    REMARQUE: Plaquez les organoïdes comme une couche mince pour le test d’imagerie afin de permettre leur imagerie en profondeur.
  27. Laissez la plaque pendant 5 min à TA pour permettre au BMM de se solidifier. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
  28. Ajouter 250 μL de milieu de croissance dans chaque puits, en prenant soin de ne pas détacher le BMM.
  29. Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  30. Effectuer l’analyse ROS entre les jours 4 et 6 de culture. Sinon, changez le milieu et divisez les organoïdes après l’apparition de plusieurs et longues structures bourgeonnantes et lorsque les cellules mortes s’accumulent dans les lumières organoïdes.

3. Passage des organoïdes

  1. Commencez à transmettre les organoïdes de l’intestin grêle à partir du 6ème jour de culture, lorsque des structures bourgeonnantes importantes se sont formées et que les lumières organoïdes sont devenues sombres.
    REMARQUE: La lumière de l’organoïde devient sombre en raison de l’accumulation de cellules mortes, de débris et de mucus. Évitez de laisser les organoïdes envahir avant de se fendre. Le rapport de fractionnement dépend de la croissance des organoïdes. Il est recommandé de passer les organoïdes avec un rapport de 1:2 au jour 6 et de 1:3 au jour 10.
  2. Remplissez un tube de 15 mL avec 4 mL de DMEM/F-12 avancé froid et gardez-le sur la glace.
    REMARQUE: Ici, les volumes pour une plaque de culture de 96 puits sont fournis. Si un format différent est utilisé, réglez le volume en conséquence.
  3. Aspirer soigneusement le fluide avec une pipette ou une pompe à vide des puits sans toucher les dômes BMM et le jeter.
  4. Ajouter 100 μL de DMEM/F-12 avancé froid par puits. Pipette de haut en bas pour briser le BMM et transférer le contenu du puits dans le tube de 15 mL.
  5. Lavez le puits avec 200 μL de froid Advanced DMEM/F-12 et collectez-le dans le même tube.
    REMARQUE: Si vous passez plusieurs puits de la même condition expérimentale, le contenu des puits peut être regroupé dans le même tube collecteur de 15 mL.
  6. Faire tourner le tube collecteur de 15 mL à 100 x g pendant 5 min à 4°C.
  7. Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de DMEM/F-12 avancé froid à la pastille. À l’aide d’une pointe P1000, prenez une pointe P10 (sans filtre) et pipetez de haut en bas au moins 20 fois.
  8. Ajouter 4 mL de DMEM/F-12 avancé froid au tube. Tourner à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
  9. Aspirer le surnageant avec une pipette ou une pompe à vide sans déranger le granulé. Ensuite, perturbez mécaniquement la pastille.
  10. Ajouter le BMM dilué dans un milieu de culture de croissance (rapport 2:1). Pipetez soigneusement de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
  11. Plaque 10 μL des cryptes/BMM se mélangent dans chaque puits.
  12. Conservez la plaque pendant 5 min à TA pour permettre au BMM de se solidifier. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
  13. Ajouter 250 μL de milieu de croissance dans chaque puits.
    REMARQUE: Veillez à ne pas détacher le BMM.
  14. Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.

4. Préparation de réactifs et de matériaux pour évaluer le stress oxydatif chez les organoïdes intestinaux

  1. Préparer une solution mère de 250 mM d’inhibiteur de la N-acétylcystéine (NAC) (voir tableau des matériaux), remettre en suspension 10 mg avec 245 μL de DPBS. Utiliser à une concentration finale de 1 mM.
  2. Préparer une solution mère de 50 mM d’inducteur d’hydroperoxyde de tert-butyle (tBHP), à 70 % dans l’eau, diluer 3,22 μL avec 496,8 μL de DPBS. Utiliser à une concentration finale de 200 μM.
  3. Pour l’étude de cytométrie en flux, préparer une solution de travail de 250 μM d’une sonde fluorogénique (voir Tableau des matériaux) en diluant la solution mère 1/10 dans du DMSO. Utiliser à une concentration finale de 1 μM.
    REMARQUE: Comme indiqué dans les instructions du fabricant, la sonde fluorogénique est sensible à la lumière et à l’oxygène. Les stocks et les aliquotes ne doivent pas être ouverts et fermés trop de fois.
  4. Pour l’étude d’imagerie, préparer une solution de travail de 1,25 mM de la sonde fluorogénique en diluant la solution mère 1/2 dans du DMSO. Utiliser à une concentration finale de 5 μM.
  5. Préparer une solution finale de 0,1 μg/mL de DAPI dans le DPBS, à utiliser pour la discrimination des cellules mortes dans le test de cytométrie en flux.
  6. Diluer Hoechst 33342 à 1,25 mg/mL dans du DPBS. Utilisation à une concentration finale de 5 μg/mL à utiliser pour la coloration nucléaire dans le test d’imagerie.
  7. DMEM chaud sans rouge phénol à 37 °C.
    REMARQUE : Ces étapes décrivent l’utilisation de témoins négatifs et positifs qui doivent être inclus dans tous les essais, en utilisant les conditions indiquées à la figure 2A. Le test peut être utilisé pour tester des composés anti- ou pro-oxydants. Les étapes sont les mêmes, et la seule différence est lorsque les composés sont ajoutés avant d’utiliser le colorant fluorogène.

5. Visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes 3D par microscopie confocale

  1. Prendre les organoïdes plaqués dans les chambres de puits μ-Slide 8 et ajouter 1 μL de solution mère NAC dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
  2. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
  3. Ajouter 1 μL de solution mère tBHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
  4. Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
  5. Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mM de la sonde fluorogénique pour obtenir une concentration finale de 5 μM.
  6. Ajouter 1 μL par puits de la dilution de 1,25 mg/mL de Hoescht pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL.
  7. Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
  8. Retirez le support sans déranger le BMM. Doucement, ajouter 250μL de DMEM chaud sans rouge phénol.
    REMARQUE: Si une acquisition à long terme est prévue, ajoutez des composés de facteurs de croissance au DMEM sans rouge de phénol.
  9. Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une chambre thermique et d’une alimentation en gaz qui détecte la sonde fluorogénique (ROS).
    REMARQUE: L’excitation / émission (ex / em) pour la sonde fluorogénique est 644/665, ex / em pour Hoechst (noyaux) est 361/486 et ex / em pour GFP (cellule souche intestinale des souris Lgr5-GFP) est 488/510. Un objectif d’immersion dans l’huile 63x est utilisé pour détecter les signaux dans les cellules souches. Ne modifiez pas les paramètres laser entre les échantillons. Un objectif 20x peut être utilisé pour permettre une vue d’ensemble de la production de ROS.
  10. Utilisez le contrôle positif pour configurer l’intensité du laser et l’exposition temporelle du signal ROS et vérifiez que ce signal est plus faible dans le contrôle négatif.
  11. À l’aide d’un écran oculaire, la diapositive permet d’identifier les organoïdes GFP exprimant et d’ajuster l’intensité du laser.
    REMARQUE : cette étape est effectuée manuellement.
  12. Définissez des positions pour obtenir une image cousue de l’organoïde entier. Configurez une pile z de 25 μm (taille de pas 5 μm) pour obtenir une section des organoïdes montrant une couche de cellules.
    REMARQUE: Reportez-vous au manuel d’utilisation du microscope pour optimiser la configuration. En utilisant des cellules vivantes, l’acquisition doit être effectuée dans les 1 h suivant la fin de l’incubation.
  13. Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images open source (voir Tableau des matériaux).
  14. Parcourez la pile z et choisissez la section dans laquelle le milieu des organoïdes est bien représenté et créez une nouvelle image avec la zone sélectionnée.
  15. Quantifiez les images conformément aux étapes 5.15.1 à 5.15.5.
    1. Sélectionnez l’outil ligne à main levée.
    2. Tracez une ligne en suivant les noyaux.
      REMARQUE: Sélectionnez uniquement les régions présentant des cellules GFP positives si seules les cellules souches sont analysées.
    3. Augmentez la largeur de la ligne pour recouvrir la couche cellulaire avec la ligne sans inclure les débris luminaux.
    4. Sélectionnez le canal pour le signal ROS et mesurez l’intensité de fluorescence dans la région sélectionnée et annotez les valeurs.
    5. Tracez une ligne où il n’y a pas de signal et mesurez l’intensité fluorescente de l’arrière-plan qui sera soustraite à la valeur précédente pour obtenir l’intensité finale.

6. Quantification du stress oxydatif sur les organoïdes dissociés à l’aide du cytomètre en flux

  1. Ajouter 1 μL de solution mère de NAC dans les puits pour les témoins négatifs afin d’obtenir une concentration finale de 1 mM.
    REMARQUE: Utilisez les organoïdes plaqués dans les plaques à fond rond de 96 puits.
  2. Incuber pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
  3. Ajouter 1 μL de solution mère tBHP dans les puits correspondants pour obtenir une concentration finale de 200 μM.
  4. Incuber pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
  5. À l’aide d’une pipette multicanal, retirez le fluide sans perturber le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque inférieure ronde de 96 puits. Gardez cette assiette de côté.
  6. Ajouter 100 μL de trypsine et, à l’aide d’une pipette multicanal, pipeter de haut en bas au moins cinq fois pour détruire le BMM.
  7. Incuber pendant 5 min au maximum à 37 °C et 5 % de CO2.
  8. Avec une pipette multicanal, pipette de haut en bas au moins cinq fois pour dissocier les organoïdes.
  9. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  10. Jetez le surnageant en inversant la plaque. Rajoutez le milieu recueilli à l’étape 6.3 aux puits correspondants et remettez en suspension les cellules en pipetant 5 fois vers le haut et vers le bas.
  11. Ajouter la sonde fluorogénique à la concentration finale de 1 μM. Ajouter 1 μL par puits à partir de la dilution de 250 μM et incuber pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO2.
    REMARQUE : N’ajoutez pas la sonde fluorogénique aux puits nécessaires aux réglages de l’instrument (Figure 2B).
  12. Tourner à 300 x g pendant 5 min à RT.
  13. Remettre en suspension les cellules avec 250 μL de solution de DAPI de 0,1 μg/mL. Transférez les échantillons dans les tubes de cytométrie en flux appropriés, maintenez les tubes sur la glace et procédez à l’analyse.
    REMARQUE : Ajoutez PBS au lieu de DAPI aux puits nécessaires aux réglages de l’instrument (Figure 2B).
  14. Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur les tensions de contrôle et laser non colorées pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons mono-colorés.
  15. À l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée (figure 4A), collectez un minimum de 20 000 événements.
    REMARQUE : 50 000 événements sont préférables. Les paramètres d’acquisition détaillés varient en fonction de l’instrument utilisé.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme preuve de concept du protocole décrit, les cryptes obtenues à partir de la lignée de souris Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 ont été utilisées dans lesquelles les cellules souches intestinales présentent une expression mosaïque de GFP, qui a été établie par Barker et al., pour caractériser initialement les cellules souches intestinales10 et permettre de cartographier ces cellules en fonction de leur expression GFP. Un modèle est ainsi fourni pour comparer les niveaux de ROS dans une population de type...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail fournit un protocole étape par étape pour isoler les cryptes jéjunales murines, les cultiver en organoïdes 3D et analyser les ROS dans les organoïdes en combinant une sonde fluorogénique sensible aux ROS avec une imagerie microscopique qualitative des organoïdes entiers et une mesure quantitative des ROS en utilisant la cytométrie en flux sur des cellules individuelles après la dissociation organoïde.

La première étape critique de cette méthode est la procédure d’extraction des cryp...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par Français subvention 17-CE14-0022 (i-Stress) de l’Agence nationale de la recherche (ANR).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)ThermoFisher12634010
B-27 Supplement, moins la vitamine AThermoFisher12587010Concentration du stock : 50x
GlutaMAX (glutamine)ThermoFisher35050038Concentration du stock : 100x
HepesThermoFisher15630056Concentration du stock : 1 M
Murine EGFR& D2028-EG-200 Concentration desstocks : 500 & micro ; g/mL dans du PBS
murin NogginR& D1967-NG/CFConcentration du stock : 100 & micro ; g/mL dans PBS
Murine R-spondin1R& D3474-RS-050 Concentration destock : 50 & micro ; g/mL dans le supplément PBS
N-2ThermoFisher17502048Concentration du stock : 100x
Pénicilline-Streptomycine (P/S)ThermoFisher15140122Concentration du stock : 100x (10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 µ ; g/mL de streptomycine)
Matériel
micro ; Crépine à cellules mCorning352350
96 puits à fond rondCorning3799
ciseaux à pointe sphériqueFine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® ; Réactif rouge profondThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phé ; nylindole, dichlorhydrate) (sonde fluorgénique)ThermoFisherD1306stock à 10 mg/mL
DPBS 1x sans calcium ni magnésium (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM sans rouge de phénol)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570stock à 10 mg/mL
Matrigel à facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol (matrice de membrane basale )Corning356231une fois reçus, décongeler o/n au réfrigérateur, se conserver 1h sur de la glace et, faire 500 mL d’aliquotes et les conserver à -20 ° ; C
µ ;-Slide 8 Chambres à puitsIbidi80826
N-acétylcystéine (NAC)SigmaA9165
hydroxyde de tert-butyle (tBCHP)solution (70 % en poids. Dans H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol (trypsine)ThermoFisher12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Inhibiteur de roche à utiliser pour minimiser la mort cellulaire lors de la dissociation tissulaire
Programmes et équipements
Attune NxT (cytomètre en flux)ThermoFischerAnalyseur de cytomètre en flux
Fidji/ImageJGénération d’images https://imagej.net/software/fiji/downloads
FlowJoBD BioscienceAnalyse FACS
Observer.Z1Zeisssystème confocal
Opterra (confocaux en champ balayé)Système confocalBruker
haute vitesse EMCCD Caméra Evolve Delta 512Système confocalphotométrique
PrismGraphPad Logicield’analyse statistique
70 &

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Organo des murinsCytom trie en fluxMicroscopie confocaleCulture d organo desAnalyse des cellules souchesImagerie sur cellules vivantes

Articles connexes