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Article de méthode

Surveillance du cycle œstral des rongeurs à l’aide d’un lavage vaginal: pas de cycle normal

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DOI :

10.3791/62884

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30 août 2021

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1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

Dans cet article

Résumé

Cette étude détaille les facteurs cruciaux à prendre en compte dans les plans expérimentaux impliquant des rats femelles. Dans un sens plus large, ces données servent à réduire la stigmatisation et à aider à l’élaboration d’outils de diagnostic et d’intervention plus inclusifs.

Résumé

La méthodologie actuelle établit une approche reproductible, normalisée et rentable pour surveiller le cycle œstral des rats adolescents femelles de Sprague Dawley (SD). Cette étude démontre la complexité des cycles hormonaux et le large spectre de compréhension nécessaire pour construire une technique de surveillance fiable et valide. Grâce à un examen approfondi de la conception expérimentale principale et des éléments procéduraux, cette description du cycle et de ses principes fondamentaux fournit un cadre pour une meilleure compréhension et déconstruit les idées fausses pour une réplication future.

En plus d’un aperçu du processus de prélèvement d’échantillons utilisant le lavage vaginal, la procédure décrit le mécanisme de catégorisation des données dans le modèle en quatre étapes du proestrus, de l’œstrus, du metestrus et du diestrus. Ces étapes sont caractérisées par une nouvelle approche proposée, utilisant les 4 déterminants de catégorisation de l’état du liquide vaginal, du ou des types de cellules présents, de l’arrangement cellulaire et de la quantité de cellules au moment de la collecte. Les variations de chaque étape, les échantillons favorables et défavorables, la distinction entre cyclicité et acyclicité et les représentations graphiques des composantes de catégorisation collectées sont présentées parallèlement à des pratiques interprétatives et organisationnelles efficaces des données. Dans l’ensemble, ces outils permettent pour la première fois de publier des plages de données quantifiables, ce qui conduit à la normalisation des facteurs de catégorisation lors de la réplication.

Introduction

Contributions inédites
Le cycle œstral des rongeurs a été identifié comme un indicateur essentiel du bien-être. Cependant, les préjugés inconscients des chercheurs et les interprétations inexactes concernant le corps féminin entravent la communauté scientifique. L’étymologie même du mot « œstral » implique un sentiment d’infériorité et de négativité. Euripide a utilisé le terme pour décrire une « frénésie » ou une folie, Homère pour décrire la panique et Platon pour décrire une pulsion irrationnelle. Cette étude met en évidence comment ces perspectives primitives influencent la communauté scientifique actuelle et répond à ces préoccupations grâce à un nouveau paradigme de mosaïque – une combinaison mise à jour de méthodes précédemment étudiées, élargie dans la portée d’une approche plus globale.

L’étude et l’utilisation de cette technique sont d’abord nécessaires, car il n’existe pas de technique de surveillance normalisée et complète, et les pratiques d’interprétation des données peuvent être peu claires. Deuxièmement, bien que les caractéristiques du cycle œstral dépendent de l’étude individuelle des rats, elles sont souvent universalisées. Troisièmement, bien que les cycles hormonaux soient des processus routiniers et bénéfiques, ils sont entourés d’une stigmatisation dangereuse explorée dans la section « Traduction chez l’homme ». Cette étude vise à aborder ces trois questions de trois façons : (A) en décrivant une technique approfondie de surveillance du cycle œstral et en clarifiant la façon dont les résultats peuvent être interprétés, (B) en décrivant des méthodes qui maintiennent l’intégrité et l’individualité de chaque cycle, et (C) en attirant l’attention sur les idées fausses qui perpétuent des pratiques non fondées.

Cette étude est également unique en ce qu’elle se concentre sur les rats adolescents, une période marquée par des changements cruciaux du développement qui mettent en lumière diverses manifestations comportementales, anatomiques et physiologiques à l’âge adulte1. L’élaboration d’une conception expérimentale normalisée pour surveiller les cycles hormonaux dans une population sous-étudiée tout en déconstruisant les biais communs permettra le développement de corrélations hormonales fiables et valides 2,3,4 et la détermination des perturbations du cycle dépendantes de la condition 5,6,7,8,9,10 . En fin de compte, ces nouveautés servent à élargir les critères de diagnostic, les traitements et les interventions de diverses préoccupations en matière de bien-être.

Définitions et utilisations fondamentales
Le cycle œstral est un ensemble de processus physiologiques dynamiques qui se produisent en réponse aux trois hormones stéroïdes sexuelles féminines oscillantes: l’œstradiol, l’hormone lutéinisante (LH) et la progestérone (Figure 1A, B). Les interactions entre le système endocrinien et le système nerveux central régulent le cycle, qui persiste le plus souvent pendant 4 à 5 jours et se répète du début de la maturation sexuelle jusqu’à la sénescence reproductive et / ou l’arrêt. Il est divisé en catégories distinctes en fonction des niveaux d’hormones, le plus souvent dans les 4 stades du diestrus (DIE), du proestrus (PRO), de l’estrus (EST) et du metestrus (MET), qui progressent de manière circulaire. Le nombre de divisions peut varier de 3 étapes11 à 13 étapes12, selon la nature de l’étude13. Le nombre inférieur de divisions exclut souvent le STATUT de société opérant dans les conditions d’une économie de marché en tant qu’étape et la classe comme une période de transition de courte durée. Le nombre le plus élevé comprend généralement des sous-sections qui permettent une inspection plus approfondie de phénomènes tels que le développement de tumeurs ou la pseudoprégnance spontanée, l’état physiologique de la grossesse sans implantation embryonnaire 12,14,15.

Dans cette étude, les stades ont été identifiés à travers les composants du canal vaginal, nommés les 3 déterminants de catégorisation - type(s) de cellules présent(s), l’arrangement cellulaire et la quantité de cellules (Figure 2A-D). Bien que l’état du liquide vaginal n’ait pas été surveillé dans cette étude, il est recommandé de l’inclure comme quatrième composant de catégorisation. De plus amples renseignements sur l’examen du liquide vaginal se trouvent dans la liste de référence16. Les composants de catégorisation peuvent être examinés en extrayant les cellules par lavage vaginal, la principale technique recommandée dans la surveillance du cycle œstral moderne. Bien que les processus physiologiques approfondis à l’intérieur de chaque étape soient en dehors de la portée de cette étude, plus d’informations peuvent être trouvées dans la littérature17.

L’utilisation et le développement continu de cette technique de surveillance du cycle œstral sont enracinés dans les liens entre les hormones stéroïdes sexuelles et la fonction des systèmes corporels tels que le système cardiovasculaire18, le système endocrinien8 et le système nerveux central 19,20,21. Dans le même temps, la surveillance du cycle œstral peut ne pas toujours être nécessaire lorsque des rongeurs femelles sont impliqués 22,23,24,25. Il est plutôt important de déterminer d’abord si des différences entre les sexes ont été signalées dans le domaine d’étude spécifique, ce qui peut être exploré plus en détail dans les revues publiées22,23. Bien que la surveillance du cycle œstral soit vitale dans un large éventail d’investigations de recherche, elle ne doit pas être considérée comme un obstacle à l’inclusion des rongeurs femelles dans les expériences. Bien que cette technique puisse sembler complexe et prendre beaucoup de temps, la procédure elle-même peut prendre moins de 15 minutes, selon l’investigateur, et est rentable. Dans l’ensemble, l’inclusion des rongeurs femelles dans les études scientifiques est avantageuse pour la compréhension des systèmes corporels, de diverses conditions et pathologies, et du bien-être général, car ces développements ont été principalement basés sur le modèle corporel masculin.

Paramètres universels et variabilités naturelles chez le rongeur
Il est nécessaire d’établir des fourchettes pour les aspects considérés comme « typiques » pour définir des modèles de cycle standard, définir des paramètres à des fins de comparaison et d’analyse et détecter les anomalies et les valeurs aberrantes. Dans le même temps, il est également important de reconnaître que le cycle de chaque rat est unique et que des écarts basés sur la souche animale, les processus physiologiques et les conditions environnementales sont attendus. En fait, l’un des aspects les plus « normaux » du cycle œstral est la variabilité. Cela se voit dans la durée totale du cycle, avec une plage de 3 à 38 jours26,27; l’âge de maturation sexuelle qui peut varier de 32-34 jours à plusieurs semaines 28,29,30; ce qui est considéré comme acyclique11, et les modèles de déterminants de catégorisation11,13. Dans l’ensemble, il n’existe pas de modèle universel pour le cycle œstral, et le traduire à la fois à la communauté scientifique et au grand public est une partie importante du processus expérimental.

Points temporels expérimentaux et âge du développement
Reconnaître ce principe de variabilité aide à construire une conception expérimentale fiable et valide. Par exemple, le début de la surveillance du cycle œstral repose sur le développement anatomique et physiologique des rats, qui varie en fonction de facteurs environnementaux et physiologiques. La surveillance ne peut commencer qu’après le développement de l’ouverture vaginale (VO), qui est l’orifice vaginal externe entouré de la vulve qui mène à la partie interne du canal vaginal (Figure 3A-D). Bien que la VO se développe souvent pleinement entre 32 et 34 jours, elle reste individualisée à chaque sujet, et beaucoup de choses sur le processus restent inconnues. Cette ouverture a été utilisée pour identifier le début de la maturation sexuelle, qui a été liée à l’augmentation de l’œstradiol31, à la maturation de l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien32 et à la première ovulation chez le rat 17,33,34,35. Cependant, des publications récentes ont montré qu’il ne s’agit que d’un marqueur indirect du développement reproductif, car il peut être découplé des occurrences hormonales et développementales dans des environnements défavorables31 et peut représenter des changements dans les niveaux d’œstradiol plutôt que la maturation sexuelle33. Par conséquent, il est recommandé de ne pas se fier uniquement à la VO pour déterminer l’âge de développement et comme qualificatif pour la surveillance du cycle œstral36, mais également d’utiliser l’apparition du premier stade EST et la cornification des cellules épithéliales30 pour marquer le début de la maturation sexuelle.

Le poids corporel est notamment corrélé avec l’âge de développement pendant la période de l’adolescence chez les rongeurs30,37 et peut donc également aider à déterminer l’âge de développement au cours de cette période. Les mécanismes proposés liés à ce phénomène comprennent la stimulation des hormones nécessaires au développement de la reproduction, telles que l’hormone de croissance, et l’inhibition de l’axe hypothalamo-hypophysaire surrénalien (HPA) par le régulateur de l’appétit, la leptine30. Cependant, il n’est pas recommandé d’utiliser cette mesure comme seul indicateur de l’âge de développement en raison de la grande variance observée entre les rats d’une espèce à l’autre et les fournisseurs de fournisseurs38. La variabilité observée dans le développement de la VO et le poids corporel illustrent l’importance du concept dans le processus expérimental global.

Traduction à l’homme : contextes culturels et scientifiques
La relation translationnelle des études de reproduction entre l’animal et l’homme est bidirectionnelle. Les résultats d’études sur des animaux influencent la façon dont les processus humains sont évalués, approchés et analysés39. La perception du système reproducteur humain et de ses processus connexes influence la façon dont les animaux sont étudiés. En fait, l’une des indications les plus fortes pour d’autres recherches dans ce domaine provient de croyances socioculturelles biaisées liées aux cycles hormonaux qui influencent le processus scientifique. Bon nombre de ces conventions découlent d’une aversion culturelle générale pour la discussion sur les menstruations, ce qui a entraîné un manque de données dans les connaissances bien étayées40,41. Cela a un éventail de conséquences qui vont de mineures à mortelles, de la hauteur des étagères et de la taille du smartphone à l’ajustement du gilet pare-balles de la police et aux diagnostics de cancer manqués42.

La description de la menstruation comme insalubre, destructrice et toxique – vue dans les textes vénérés, les médias, les dictionnaires et les enseignements médicaux – est conservée par des publications scientifiques. Cela se produit par des descriptions inexactes et biaisées des cycles hormonaux, l’isolement du système reproducteur de ses homologues neuroendocriniens et des influences environnementales, et la perspective réductionniste de l’achèvement d’un cycle comme un « échec à concevoir»43,44. Cela conduit à la création de pratiques expérimentales malsaines, telles que l’omission de variables externes qui influencent les cycles hormonaux, la détermination du début et des extrémités basées uniquement sur les développements anatomiques et la mesure de l’avancement du cycle de manière linéaire plutôt que circulaire. Malgré la corrélation directe entre les facteurs socioculturels et les conséquences biologiques, elle n’est pas souvent prise en compte dans la littérature scientifique. Grâce à l’inspection de publications plus holistiques 43,44,45, les chercheurs peuvent déconstruire ces stigmates et créer des plans expérimentaux plus fiables et valides.

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Protocole

Toutes les méthodes de manipulation et de procédure décrites dans ce protocole sont conformes aux directives de soins et d’utilisation des animaux des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Pepperdine et le Comité de recherche animale (ARC) du chancelier de l’UCLA.

1. Soins et utilisation des animaux

  1. Acquérir des rats femelles, en nombre selon l’analyse de puissance, et des rats mâles pour favoriser l’effet Whitten ou un cycle plus cohérent46. Déterminer la souche en fonction de l’objectif de l’étude dans des bases de données connues47.
    REMARQUE: Les données actuelles reflètent celles du Programme international de normalisation génétique (IGS) de SD chez les adolescentes en présence de rats SD mâles situés dans les laboratoires de l’Université Pepperdine et de l’UCLA dans le cadre d’une étude collaborative. Ces rats sont arrivés en groupes distincts à l’âge de 28 jours, et la progression du cycle œstral a été surveillée pendant 10 ou 20 jours pour démontrer des différences sur les niveaux aigus et chroniques, à partir de l’âge de 34 jours (après une période d’acclimatation de 7 jours).
  2. Avant la manipulation, prévoir une période de quarantaine et/ou d’acclimatation pour la stabilisation physiologique après le transport et l’adaptation au nouvel environnement.
    NOTE: Une période minimale de 3 jours a été citée, avec une période de 7 jours recommandée 48,49,50,51,52. Dans l’ensemble, cela dépend des conditions de transport, de la souche animale et des objectifs de l’étude.
  3. Assurez-vous que le stress est réduit avec l’utilisation d’une période d’acclimatation, car le stress peut perturber le bon fonctionnement du système reproducteur53. Cependant, ne surcompensez pas en essayant de l’éliminer, car une quantité modérée de stress est bénéfique pour le bien-être des animaux51.
  4. Hébergez les rats dans un environnement à température contrôlée (68-79 °F, c’est-à-dire 20-26 °C) et à humidité contrôlée (30-70 %) en contactant le vivarium ou les gestionnaires de laboratoire et en assurant ces caractéristiques. Distribuez de l’eau et du chow ad libitum avec les composants nutritifs énumérés sur le site Web de l’entreprise et nettoyez la cage une fois par semaine.
    REMARQUE: Dans cette étude, les rats ont été logés dans des groupes de 2 séparés par sexe dans des cages en plastique réutilisables transparentes de 19 « x 10 » x 8 » et ont eu accès à une litière en épi de maïs qui était changée une fois par semaine. La température a été maintenue à 70 ° F et l’humidité à 35-79%, avec une moyenne de 62%.
  5. Vérifiez le développement d’une nécrose à queue annulaire ou ischémique de la queue et des orteils pour détecter des signes de faibles niveaux d’humidité relative et de températures extrêmes, ce qui peut entraîner l’alternance des réponses biologiques.
    REMARQUE: La température et l’humidité sont importantes pour le système reproducteur, la maturation sexuelle et la cyclicitéœstrale 54,55,56,57,58.
  6. Assurer un éclairage adéquat et équilibré dans tout l’espace du logement en déposant des quantités égales de sources lumineuses dans tout l’espace du laboratoire qui agissent sur un système lumière/obscurité contrôlé dans le temps.
    REMARQUE: Ici, un cycle lumière:obscurité de 12:12-h, avec des lumières allumées de 06h00 à 18h00, était contrôlé par des ampoules LED linéaires de 2 550 lumens.
  7. Suivez les exigences de lux fournies52 en fonction des variations de la pigmentation, de l’âge, de la souche, du sexe et du statut hormonal des animaux.
    REMARQUE: Lorsque les chercheurs classent les échantillons de cellules collectés, un éclairage cohérent permettra une détection visuelle appropriée et une mise en scènefiable 59. La durée et l’intensité de la lumière sont directement liées au système reproducteur, à la maturation sexuelle et au cycle œstral 54,55,56,57,60,61.

2. Équipement et préparation des expériences

  1. Passez en revue les déterminants de la catégorisation (vus à la figure 2A) : comment identifier chaque étape du cycle œstral et comment utiliser le microscope et l’équipement de caméra.
  2. Assurez-vous que chaque sujet à surveiller a atteint la maturation sexuelle et présente des indicateurs de développement appropriés – VO, poids corporel et âge. Pesez les rats et examinez-les pour la VO entre la même heure chaque jour pour des comparaisons précises et transférez-les avec une méthode de manipulation approuvée. Consultez le vétérinaire affilié à l’université si un animal perd plus de 20% de son poids corporel précédent.
    REMARQUE: Le VO reste caudal à l’ouverture urétrale et crânien à l’anus, situé entre les deux, comme illustré à la figure 3.
  3. Comme ces facteurs dépendent de la souche, vérifiez auprès du fournisseur les spécifications et tenez compte des facteurs environnementaux spécifiques au laboratoire62.
    REMARQUE: En général, cela se produira entre 32 et 34 jours et un poids corporel moyen allant de 75 à 150 grammes63 pour les rats SD et est indiqué par une ouverture de forme circulaire préalablement recouverte d’une gaine membraneuse.
  4. Choisir une période de prélèvement d’échantillons appropriée pour le groupe de rats surveillés afin d’éviter le prélèvement d’échantillons transitoires. Tout d’abord, échantillonnez quelques animaux à 2 ou 3 moments différents tout au long de la journée pour déterminer l’heure à laquelle la plupart des étapes du cycle sont présentes (par exemple, échantillonnage à 12h00, 13h00 et 14h00 pour différents animaux). Complétez le lavage vaginal à la même heure chaque jour pour une stadification cohérente et fiable.
    REMARQUE: Il a été rapporté que les heures entre 12h00 et 14h00 sont les meilleures pour capturer toutes les étapes. Dans cette étude, la surveillance du cycle œstral a eu lieu entre 12h00 et 14h00, gérée avec la prise de style compression (voir étape 3.4). L’importance du calendrier de surveillance du cycle œstral par rapport à d’autres interventions expérimentales (p. ex., conditionnement comportemental, médicaments) est un domaine de recherche en développement et peut être exploré plus avant11. La détermination de la durée de la surveillance du cycle œstral dépend de l’étude et peut être explorée plus en détail dans les études publiées11,33.
  5. Retirez le couvercle de protection du microscope et fixez l’appareil photo à l’ordinateur en retirant le couvercle de l’objectif de l’appareil photo de protection et en plaçant l’objectif sur l’oculaire du microscope.
  6. Ensuite, ouvrez le logiciel présélectionné sur l’ordinateur. Pour utiliser le logiciel sélectionné dans cette étude, sélectionnez l’appareil photo connecté à l’USB situé sur le côté gauche de l’écran, sous l’onglet intitulé Liste des caméras. Assurez-vous que la caméra USB est correctement connectée à l’ordinateur, qui lira Aucun périphérique sous l’onglet intitulé Liste des caméras, sinon.
  7. Une fois que la caméra USB a été sélectionnée sous l’onglet, allumez l’interrupteur d’éclairage du microscope situé sur la base.
  8. Créez un dossier sur l’ordinateur désigné pour les exemples de photos de cellule. Créez un dossier de fichiers pour chaque jour distinct où les données sont collectées, préparées à l’avance avant que les images ne soient prises.
  9. Une fois l’équipement préparé, récupérez la cage du sujet de son lieu de détention et apportez-la à la station de prélèvement d’échantillons.

3. Collecte de cellules vaginales

  1. Récupérez une seringue jetable et remplissez chacune des seringues avec 0,2 mL de NaCl stérile à 0,9 %. Si des bulles d’air sont présentes, faites glisser doucement la seringue en baril jusqu’à ce que toutes les bulles d’air aient atteint l’extrémité ouverte de la seringue et expulsez l’air. S’il y a encore des bulles d’air présentes, expulser la solution dans le récipient NaCl et remplir jusqu’à ce qu’il n’y en ait pas.
    REMARQUE: Un scintillement excessif peut entraîner la formation de plus de bulles d’air.
  2. Retournez chaque seringue sur l’emballage en plastique pour maintenir un champ stérile, avec l’extrémité de la seringue à l’intérieur de la partie scellée de l’emballage.
  3. Ouvrez la cage et soulevez doucement le sujet par la base de la queue ou le tronc du corps, en fermant le couvercle de la cage pour empêcher les autres de sortir. Sélectionnez une méthode de détention parmi celles énumérées ci-dessous en fonction des préférences personnelles et de la réponse des animaux.
  4. Utilisez la prise de style compression pour les rats adolescents en plaçant le sujet contre la région supérieure de la poitrine, le nez du sujet pointant vers le sol. Avant de commencer l’écouvillonnage, assurez-vous que le sujet est suffisamment comprimé pour empêcher le mouvement, mais qu’il est confortable et sûr dans la prise. Exposez le canal vaginal du sujet en fléchissant doucement la queue avant d’insérer la seringue.
  5. Utilisez le lifting des pattes postérieures pour les rats adultes en plaçant les pattes antérieures de l’animal sur le dessus ou le côté de la cage, tandis que la queue et les membres postérieurs sont retenus avec une prise douce entre le premier et le deuxième doigt, laissant le pouce libre pour faire fonctionner la seringue64.
  6. Permettre aux animaux de s’acclimater à la manipulation et à la surveillance. Manipulez les animaux doucement mais en toute sécurité pour réduire l’excès de stress et protéger le chercheur contre les agressions telles que les morsures.
    REMARQUE: Les premiers jours de surveillance peuvent ne pas produire les résultats souhaités car les animaux s’acclimatent à leurs conditions. La manipulation des animaux pour collecter des poids corporels pendant la période d’acclimatation peut faciliter cette transition33.
  7. Tout en maintenant la seringue stable avec l’index et le majeur, insérez l’extrémité de la seringue (pas plus de 2 mm) à un angle parallèle au canal vaginal. Expulsez lentement le NaCl dans le canal en poussant le piston vers l’intérieur. N’insérez pas la seringue plus loin dans le canal, car cela pourrait perturber le cycle œstral.
  8. Extrayez le NaCl du canal vaginal en tirant le piston de la seringue loin de la muqueuse épithéliale (vers le haut). S’il est difficile de garder le sujet dans la cale pendant ce processus, replacez-le dans la cage pendant une courte période de repos avant de tenter l’extraction du NaCl.
  9. Une fois l’échantillon cellulaire prélevé, replacez le sujet dans la cage et répétez cette procédure pour chaque animal avant que tous les échantillons ne soient évalués au microscope.
    REMARQUE: Alternativement, chaque échantillon peut être collecté et évalué avant de passer à l’animal suivant. Un animal peut nécessiter un deuxième lavage si l’échantillon ne peut pas être catégorisé. La même seringue de la collecte initiale peut être réutilisée si elle n’entre pas en contact avec la solution saline directement dans le récipient et uniquement pour le même animal.

4. Évaluation de l’échantillon

  1. Commencez la catégorisation en examinant l’échantillon de liquide vaginal extrait. Enregistrez la viscosité comme visqueuse ou non visqueuse et la coloration comme opaque ou transparente sur le document de description ou tout autre système d’enregistrement.
    REMARQUE : Cette section du protocole peut être effectuée au moment du prélèvement de l’échantillon ou ultérieurement.
  2. Expulsez 2-3 gouttes du fluide sur une lame de microscope et placez un verre de couverture de microscope sur le dessus de la lame. Placez le verre de couverture sur la lame du microscope du haut de la lame vers le bas ou d’un côté de la lame à l’autre pour éviter la formation de bulles d’air. Si possible, laissez environ la moitié de l’échantillon prélevé dans la seringue si un examen plus approfondi est nécessaire et pour éviter qu’une quantité excessive de liquide ne soit placée sur la lame.
  3. Localisez les cellules collectées en déplaçant la lame du microscope sur la scène. S’il y a trop peu de cellules ou une grande quantité de débris, expulser le liquide restant sur une nouvelle lame et réexaminer. Si la quantité d’échantillon laissée dans la seringue est insuffisante ou si la deuxième goutte présente des problèmes similaires, prélever un autre échantillon sur le sujet avant d’essayer d’identifier le stade du cycle œstral.
  4. Une fois les cellules localisées et avant de toucher l’ordinateur ou le clavier de l’ordinateur, retirez le gant pour éviter de salir le clavier.
  5. Obtenez des images des échantillons de cellules en cliquant sur la fonction intitulée Snap sur le côté gauche du panneau logiciel.
  6. Ensuite, enregistrez le fichier en cliquant sur Enregistrer sous sous l’icône Fichier dans le coin supérieur gauche de la page. Enregistrez la photo sous un dossier pré-étiqueté sur l’ordinateur.
    REMARQUE: Exemple de modèle d’étiquette: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lentille utilisée.
  7. Prenez plus d’une photo à chaque objectif s’il n’y a pas beaucoup de cellules dans chaque cadre.
    REMARQUE: Exemples d’étiquettes pour plusieurs images: #1_01/09/2021_EST_4x1 et #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. Répétez la procédure pour chaque échantillon prélevé sous plusieurs objectifs. Incluez au moins une objectivation plus petite, telle que 4x, et au moins une objectivation plus grande, telle que 20x.
  9. Téléchargez les images sur un lecteur/dossier partagé ou un disque dur externe afin que tous les chercheurs impliqués aient accès aux fichiers et que des copies de sauvegarde soient disponibles.

5. Catégorisation des étapes

  1. Configurez l’écran de l’ordinateur pour afficher simultanément les photos prises et la feuille d’enregistrement (Figure 4A-C).
    REMARQUE : Cela permettra à la documentation de se produire lors de l’affichage de l’échantillon collecté. Cette partie du protocole peut être complétée au moment du prélèvement de l’échantillon ou plus tard.
  2. Déterminez quels types de cellules sont présents dans l’échantillon. Choisissez parmi les quatre options énumérées aux étapes 5.2.1 à 5.2.4 à l’aide des critères et consignez les résultats.
    1. Cellules épithéliales kératinisées anucléées (AKE)/épithéliales cornifiées
      1. Recherchez des cellules déchiquetées ou à bords angulaires, comme on le voit sur les figures 2B et 5C, qui, malgré l’absence de noyaux, peuvent montrer des zones rondes claires (fantômes nucléaires) à l’intérieur de la cellule qui représentent l’endroit où un noyau était autrefois présent. Utilisez un grossissement plus élevé, tel que 20x et plus, pour différencier ces cellules nucléées et anucléées.
      2. Utilisez un grossissement plus élevé pour distinguer la partie kératinisée ou cornifiée de la cellule – une fine couche de cellules dépourvues de noyaux et remplies de kératine – si vous le souhaitez.
        REMARQUE: En plus de leur aspect déchiqueté, ceux-ci peuvent également être distingués par la façon dont ils peuvent se plier ou se désassembler, créant des structures déchiquetées et allongées connues sous le nom de barres de kératine.
    2. Grandes cellules épithéliales nucléées (LNE)
      1. Recherchez ces cellules de forme généralement ronde à polygonale entourées de bordures irrégulières, déchiquetées ou angulaires.
      2. Observez comment leurs noyaux peuvent prendre diverses formes, allant de intactes à dégénérées ou pykontiques, liées à la condensation irréversible de la chromatine dans le noyau d’une cellule en cours de mort ou de détérioration, comme le montrent les figures 2B et 5D1,2. Prenez note de la façon dont ces noyaux occupent moins d’espace que le cytoplasme dans la cellule, avec un rapport nucléaire / cytoplasmique (N: C) inférieur à celui des petites cellules épithéliales. Recherchez les granules cytoplasmiques qui peuvent être vus à des grossissements plus élevés13.
    3. Leucocytes (LEU)/neutrophiles/cellules polymorphonucléaires
      1. Recherchez ces cellules sphériques compactes avec des noyaux multilobulés (d’où le nom de cellules polymorphonucléaires), qui disparaissent à mesure que la cellule mûrit (Figure 2B et Figure 5A). Un grossissement plus élevé (par exemple, 40x) peut être utilisé pour observer les noyaux multilobulés.
        REMARQUE: Lors de la collecte et de la préparation, ces cellules peuvent se condenser, se plier ou se rompre.
    4. Petites cellules épithéliales nucléées (SNE)
      1. Recherchez ces cellules de forme ronde à ovale qui sont plus grandes que les neutrophiles décrits ci-dessus.
      2. Observez les noyaux ronds de ces cellules épithéliales non kératinisées (Figure 2B), qui occupent une plus grande quantité d’espace que le cytoplasme à l’intérieur de la cellule, créant un rapport N:C plus élevé par rapport aux grandes cellules épithéliales.
        REMARQUE : Lors de la collecte et de la préparation, ces cellules peuvent se plier ou se chevaucher pour créer une forme qui ressemble à une chaîne ou à une barre, comme illustré à la figure 5B1.
  3. Examinez comment les cellules présentes dans l’exemple sont organisées pour chaque objectivation. Utilisez l’objectivation inférieure, telle que 4x, pour afficher une vue représentative de la disposition globale des cellules. Indiquez si les cellules sont agglomérées (C), dispersées uniformément (DE) ou dispersées de façon aléatoire (RD) (voir la figure 4C) et notez l’organisation spécifique de chaque type de cellule (p. ex., les petites cellules épithéliales nucléées sont agglomérées et les neutrophiles sont répartis uniformément).
  4. Ensuite, estimez et enregistrez visuellement la quantité totale de cellules (un smidge, modéré, nombreux) et les quantités de cellules individuelles (pourcentage de chaque type de cellule présent).
    REMARQUE : Un smidge représente le plus petit nombre de cellules présentes qui peuvent être utilisées pour déterminer la catégorisation de l’échantillon, beaucoup représentent la présence d’un nombre incalculable de cellules qui représentent la majeure partie, sinon la totalité, de l’espace sur la diapositive ou qui sont empilées les unes sur les autres, et un nombre modéré de cellules représente un nombre relativement moyen de cellules (exemples vus à la figure 5A-D et à la figure 6A-D).
  5. Notez s’il y a des écarts par rapport aux critères énumérés ou aux aspects typiques du sujet spécifique dans la catégorie « anomalies » et consultez un vétérinaire si nécessaire.
  6. Déterminez quelle étape du cycle œstral est présentée dans l’échantillon à l’aide des composants de catégorisation et des descriptions ci-dessous.
    1. Mourir
      1. Recherchez les LEU comme le type de cellule dominant ou unique présent, disposé de manière agglomérée au début de DIE mais plus dispersé dans les derniers stades.
        REMARQUE: Lors de la transition vers DIE, la quantité de cellules peut diminuer à mesure que les cellules épithéliales commencent à se décomposer, comme le montre la figure 6D1. Dans le même temps, le nombre d’UFE commence à augmenter et ils ont tendance à être disposés de manière agglomérée au départ et à se disperser au fil du temps.
      2. Notez que la quantité totale de cellules peut être relativement faible, le plus souvent dans les derniers stades de la période DIE, le deuxième ou le troisième jour.
      3. Observez la grande quantité de mucus qui peut être présente à ce stade, qui se présente sous forme de brins concentrés de LEU (Figure 5A1). Recherchez de petits amas ou des brins cellulaires de cellules SNE accompagnant les LEU pendant les phases tardives de la transition vers PRO (Figure 5A1,2).
      4. Observez l’aspect visqueux et opaque du liquide vaginal lors de la transition vers, de la transition complète vers et de la transition hors de DIE.
        REMARQUE: La durée moyenne de cette étape est de 48 h au cours d’un cycle de 4 jours et éventuellement de 72 h au cours d’un cycle de 5 jours.
    2. Pro
      1. Recherchez les cellules SNE comme cellules dominantes et les cellules LEUs, LNE et / ou AKE qui peuvent être vues en faible nombre. Utilisez une objectivation élevée pour observer l’aspect granulaire des cellules SNE qui sont généralement disposées en grappes, feuilles ou brins au cours de cette étape (Figure 5B1,2).
      2. Observez l’aspect visqueux et opaque du liquide vaginal lors du passage de DIE à PRO, et comment il devient non visible et transparent une fois complètement passé au stade PRO (durée moyenne de 14 h chez le rat).
    3. HNE
      1. Recherchez la dominance des cellules AKE, une diminution des cellules SNE dans l’EST et une augmentation du nombre et de la taille des cellules à mesure que l’EST se poursuit11,13.
      2. Notez la caractéristique distinctive de la disposition souvent groupée des cellules AKE, sous la forme de barres de kératine ou contenant des noyaux fantômes, qui peuvent se disperser de manière plus aléatoire lors de la transition de PRO (Figure 6B) à MET (Figure 6C).
      3. Observez le liquide vaginal non visqueux et transparent caractéristique, auquel on peut s’attendre lorsque les rats font la transition vers, complètement transférés et sortis de l’EST.
        NOTE : La progression de l’EST comprend une grande diversification (Figure 5C et Figure 6B, C). Le stade se produit généralement pendant une moyenne de 24 heures dans un cycle de 4 jours ou peut-être 48 heures dans un cycle de 5 jours.
    4. Rencontrèrent
      1. Recherchez un nombre plus élevé de cellules SNE et LNE au fur et à mesure que le rat passe au MET, soit dominant en termes de proportion cellulaire dans le canal, soit presque égale à la proportion égale des LEU11,13. De plus, notez la plus grande quantité de débris dans le MET et les transitions qu’à d’autres stades en raison de la désintégration des cellules épithéliales après l’EST et le passage dans DIE.
      2. Observez le manque d’arrangement cohérent au fur et à mesure que tous les types de cellules sont vus et en différentes quantités (Figure 5D1-3). Cependant, recherchez les LEU qui sont emballés ou agglutinés à proximité des cellules épithéliales dans les premiers stades qui peuvent revenir à l’arrangement aggloméré lors de la transition vers DIE.
      3. Observez l’aspect non visible et transparent du liquide vaginal à ce stade et le passage à un aspect plus visqueux et opaque lors du passage à DIE.
        REMARQUE: La durée moyenne de cette étape est de 6-8 h.
  7. Étiquetez les échantillons dans les transitions avec l’étape vers laquelle le sujet se dirige, avec la transition entre parenthèses pour suivre quand ceux-ci sont collectés. De plus amples informations sur la façon de distinguer entre ces 4 étapes et leurs transitions peuvent être trouvées dans les résultats représentatifs.
    REMARQUE : Comme les échantillons prélevés sont statiques et que le cycle est dynamique, les diapositives peuvent représenter des transitions entre les étapes (voir la figure 6A-D).
  8. Terminez ce processus pour chaque animal jusqu’à ce que la phase de surveillance soit terminée.
  9. Le jour 11 (45 jours) ou le jour 21 (55 jours), euthanasier les rats avec 5% d’isoflurane et 2% d’oxygène avant une décapitation à la guillotine. Ces délais peuvent varier en fonction de la nature de l’étude.

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Résultats

Les données actuelles reflètent celles des adolescentes SD International Genetic Standardization Program (IGS) en présence de rats mâles SD. Ces animaux ont été localisés dans les laboratoires de l’Université Pepperdine et de l’UCLA dans le cadre d’une étude collaborative. La figure 5 présente de multiples variations des 4 étapes du cycle. Figure 5A1 a été identifié comme un échantillon de diestrus avec plusieurs types de cellules présentes. Cet...

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Discussion

Étapes clés et considérations importantes
Certaines étapes critiques du protocole fourni nécessitent une emphase, en particulier dans la collecte des cellules vaginales. Pendant l’extraction du liquide vaginal, il est essentiel de s’assurer de l’angle et de la profondeur appropriés de l’insertion de la seringue pour produire des résultats satisfaisants et, en fin de compte, prévenir l’irritation, les blessures ou la stimulation cervicale de l’animal. La stimulation du col de l’utérus peut être une sou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été menée dans le cadre d’une collaboration financée par les NIH entre le Centre de recherche sur les lésions cérébrales de l’Université de Californie à Los Angeles (BIRC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
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BD PrecisionGlide Pack d’aiguilles, 20G x 1, biseau courtFischer Scientific14-815-526https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8NEWCO93009https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning&Commerce ; Lames de microscope simples Verre blanc d’eau brutFischer Scientific12-553-7Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
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