Article de méthode

Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique

DOI :

10.3791/62888

⸱

3 août 2021

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de ce protocole est de développer un système modèle pour l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes des voies respiratoires de la fibrose kystique. Le milieu d’expectorations artificielles émule la composition des expectorations, et les conditions de culture hyperoxique modélisent les effets de l’oxygène supplémentaire sur les communautés microbiennes pulmonaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On pense que les communautés microbiennes des voies respiratoires jouent un rôle important dans la progression de la fibrose kystique (FK) et d’autres maladies pulmonaires chroniques. Les microbes ont traditionnellement été classés en fonction de leur capacité à utiliser ou à tolérer l’oxygène. L’oxygène supplémentaire est un traitement médical courant administré aux personnes atteintes de fibrose kystique (PWF); cependant, les études existantes sur l’oxygène et le microbiome des voies respiratoires se sont concentrées sur la façon dont l’hypoxie (faible teneur en oxygène) plutôt que l’hyperoxie (oxygène élevé) affecte les communautés microbiennes pulmonaires anaérobies principalement aérobies et facultatives. Pour combler cette lacune critique en matière de connaissances, ce protocole a été élaboré à l’aide d’un milieu d’expectorations artificielles qui imite la composition des expectorations du PWCF. L’utilisation de la stérilisation par filtre, qui donne un milieu transparent, permet des méthodes optiques pour suivre la croissance de microbes unicellulaires dans des cultures en suspension. Pour créer des conditions hyperoxiques, ce système modèle tire parti des techniques de culture anaérobie établies pour étudier les conditions hyperoxiques; au lieu d’éliminer l’oxygène, l’oxygène est ajouté aux cultures par barbotage quotidien de bouteilles de sérum avec un mélange d’oxygène comprimé et d’air. Les expectorations de 50 pwCF ont subi un éparpillement quotidien pendant une période de 72 heures pour vérifier la capacité de ce modèle à maintenir des conditions d’oxygène différentielles. Le séquençage métagénomique shotgun a été effectué sur des échantillons d’expectorations cultivées et non cultivées de 11 pwCF afin de vérifier la capacité de ce milieu à soutenir la croissance des microbes commensaux et pathogènes couramment présents dans les expectorations de la fibrose kystique. Des courbes de croissance ont été obtenues à partir de 112 isolats obtenus à partir de pwCF pour vérifier la capacité de ce milieu d’expectorations artificielles à soutenir la croissance d’agents pathogènes courants de la fibrose kystique. Nous constatons que ce modèle peut cultiver une grande variété d’agents pathogènes et de commensaux dans les expectorations de FK, récupère une communauté très similaire aux expectorations non cultivées dans des conditions normoxiques et crée différents phénotypes de culture dans des conditions d’oxygène variables. Cette nouvelle approche pourrait permettre de mieux comprendre les effets imprévus induits par l’utilisation de l’oxygène dans le PWCF sur les communautés microbiennes des voies respiratoires et les agents pathogènes respiratoires courants.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique caractérisée par une incapacité à éliminer le mucus épais des poumons, entraînant des infections répétées et un déclin progressif de la fonction pulmonaire qui entraîne souvent la nécessité d’une transplantation pulmonaire ou de la mort. Le microbiome des voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose (FCP) semble suivre l’activité de la maladie1, avec une réduction de la diversité microbienne associée à des résultats indésirables à long terme2,3. Dans les études cliniques de la PWF, l’oxygénothérapie supplémentaire a été associée à une maladie plus avancée4,5, bien que traditionnellement, l’utilisation de l’oxygénothérapie ait été considérée comme un simple marqueur de la gravité de la maladie6. Des études récentes issues d’un essai clinique sur des patients atteints d’insuffisance respiratoire ont montré que des niveaux d’oxygène plus élevés sont paradoxalement associés à une augmentation des infections bactériennes graves et à une mortalité plus élevée7,ce qui suggère que l’oxygène supplémentaire peut contribuer à la pathogenèse de la maladie. L’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome pulmonaire de la fibrose kystique et les communautés microbiennes pulmonaires et des voies respiratoires associées n’a pas été bien étudié.

Les études mécanistes ne peuvent souvent pas être effectuées directement sur des sujets humains en raison de difficultés logistiques et de problèmes éthiques potentiels associés à des interventions d’avantages ou de préjudices médicaux inconnus. Les approches translationnelles qui intègrent des échantillons biologiques humains dans des systèmes modèles peuvent offrir des informations biologiques importantes dans ces cas. Bien que la capacité d’utiliser ou de tolérer l’oxygène ait traditionnellement été un élément important de la classification microbienne, on sait peu de choses sur la façon dont l’introduction thérapeutique d’oxygène supplémentaire dans l’environnement pourrait perturber les communautés microbiennes des voies respiratoires. Pour faire la lumière sur les effets inconnus de l’oxygène supplémentaire sur les microbiomes des voies respiratoires du PWCF, nous devions relever deux défis majeurs; premièrement, la création d’un milieu de culture qui se rapproche physiologiquement de la composition des expectorations de la FK; deuxièmement, la création d’un système modèle qui permet le maintien de concentrations élevées d’oxygène en culture sur de longues périodes de temps.

Les milieux d’expectorations artificielles (ASM) sont largement utilisés pour émuler les expectorations pulmonaires ex vivo8,9,10, mais il n’y a pas de consensus clair sur une recette spécifique. Ce protocole décrit une recette et une stratégie de préparation de milieu d’expectorations artificielles soigneusement conçues pour se rapprocher physiologiquement des expectorations de pwCF. Le tableau 1 présente les valeurs de recette choisies en fonction de la littérature publiée. Les composants chimiques de base et le pH ont été appariés aux valeurs identifiées par les études sur les expectorations humaines de FK11,12,13. Des nutriments physiologiques à faible concentration ont été ajoutés à l’aide de jaune d’œuf, qui a été inclus comme 0,25% du volume final10, ainsi que des mélanges de vitamines et de métaux traces14,15. La mucine, le composant clé des expectorations16,a été incluse à 1% p/v14. Bien que nécessitant plus de main-d’œuvre, la stérilisation par filtre a été choisie par rapport à la pratique plus conventionnelle de la stérilisation thermique pour réduire les problèmes potentiels liés à la dénaturation induite par la chaleur des composants essentiels des milieux10. Un avantage supplémentaire de la stérilisation par filtre est qu’elle génère des milieux transparents (la stérilisation thermique peut créer des milieux troubles en raison de la précipitation et de la coagulation des sels et des protéines), ce qui permet d’utiliser ces milieux d’expectorations artificiels pour suivre la croissance microbienne en fonction de l’augmentation de la turbidité.

Ce système modèle pour la culture hyperoxique est basé sur des techniques de culture anaérobie où l’oxygène est ajouté plutôt que retiré, créant un modèle pour l’effet de l’utilisation supplémentaire d’oxygène pour pwCF. La figure 1 et le protocole d’épargnance en oxygène qui y est associé décrivent les composants d’un système de lutte contre l’oxygène, qui peut être obtenu à faible coût auprès des fournisseurs généraux de laboratoires et d’hôpitaux. Ce système permet de mélanger de l’oxygène comprimé et de l’air à des concentrations fixes allant de 21% à 100% d’oxygène. L’intégration d’un capteur d’oxygène permet de vérifier la concentration du mélange de gaz de sortie, ainsi que de vérifier la composition du gaz sortant des bouteilles de sérum préalablement épargnées pour vérifier que les conditions d’oxygène ont été maintenues dans la plage souhaitée.

Ce protocole décrit les procédures pour créer un milieu d’expectorations artificielles, la construction et l’utilisation d’un système de stockage d’oxygène et l’application des deux pour cultiver des expectorations de FIBRO dans des conditions d’oxygène différentiel.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a reçu l’approbation du Comité d’examen des établissements partenaires (Protocole no 2018P002934). Le critère d’inclusion comprenait les patients adultes atteints de fibrose kystique qui ont fourni un consentement éclairé écrit pour l’étude. Il n’y avait pas de critère d’exclusion. Selon les lignes directrices du protocole, tous les échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des patients atteints de fibrose kystique lors d’une visite ambulatoire programmée chez leur fournisseur de soins cliniques.

1. Préparation du milieu des expectorations artificielles

REMARQUE: Les quantités énumérées ici sont pour la production de 1 L de milieu final d’expectorations artificielles et supposent les réactifs spécifiques énumérés dans le tableau des matériaux. Les chiffres doivent être ajustés pour d’autres volumes ou pour l’utilisation de différents réactifs afin d’assurer le même produit final. Voir le tableau 1 pour les concentrations cibles.

  1. Mélange chimique d’expectorations artificielles (ASCM)
    REMARQUE: ASCM représente 25% du volume moyen final. Il est stable à la conservation et peut être préparé en vrac ou à l’avance. S’il est préparé pour une utilisation ultérieure, autoclavez le mélange chimique et conservez-le en toute sécurité à température ambiante.
    1. Mélanger les solutions mères chimiques constitutives.
      1. Préparer 1 M de NaCl : Ajouter 58,44 g de NaCl par litre d’eau stérile.
      2. Préparer un bouillon de 1 M KCl : Ajouter 74,55 g de KCl par litre d’eau stérile.
      3. Préparer 1 M MgSO4 bouillon: Ajouter 246,47 g de MgSO4·7H2O par litre d’eau stérile, ou 120,37 g de MgSO4 anhydre par litre d’eau stérile.
      4. Préparer 1 M de glucose : Ajouter 180,16 g de glucose par litre d’eau stérile.
    2. Stérilisez en autoclave les solutions mères chimiques, ainsi qu’une bouteille vide de 250 ml. Effectuez les étapes d’autoclavage à des valeurs standard d’au moins 121 °C et 15 PSI pendant 30 min.
    3. Ajouter 80,59 mL d’eau stérile à la bouteille vide de 250 ml.
    4. Ajouter 152,30 mL de 1 M de naCl au mélange.
    5. Ajouter 15,8 mL de 1 M de KCl au mélange.
    6. Ajouter 610 μL de 1 M MgSO4 au mélange.
    7. Ajouter 700 μL de 1 M de glucose au mélange.
  2. Mélange artificiel de mucine d’expectorations (ASMM)
    REMARQUE: ASMM représente 50% du volume moyen final. Assurez-vous qu’il est préparé le même jour que le lot moyen final.
    1. Ajouter 450 mL d’eau stérile dans une bouteille vide de 1 L.
    2. Ajouter 50 mL de 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au flacon.
    3. Ajoutez une barre d’agitation magnétique jetable à la bouteille.
    4. Autoclavez la bouteille contenant du PBS et la barre de remuage.
    5. Mesurez 10 g de poudre de mucine et ajoutez-la au PBS.
    6. Agiter vigoureusement la bouteille pour le mélange préliminaire.
    7. Placez la bouteille sur une plaque chauffante avec un agitateur magnétique. Réglez la chaleur à moyen-haut en ciblant 50 °C et la vitesse d’agitation à 1100 tr/min. Augmentez progressivement la vitesse afin que la barre ne s’envole pas de l’aimant.
      1. Laisser chauffer et remuer pendant 15 min.
      2. Ramassez la bouteille avec des gants résistants à la chaleur. Observez pour vérifier si la poudre de mucine se dépose hors de la solution.
      3. Si la poudre de mucine n’est pas complètement dissoute, remettre la bouteille à chauffer/agiter pendant des intervalles de 5 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
    8. Laissez le mélange de mucine refroidir à la température ambiante.
  3. Mélange biologique d’expectorations artificielles (ASBM)
    REMARQUE: ASBM représente 25% du volume moyen final. Préparez-le le même jour que le lot moyen final et, contrairement aux autres mélanges, n’exposez pas ses composants à la chaleur.
    1. Décongeler le stock de vitamines 100x dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace.
      REMARQUE: Pré-portionnez le stock de vitamines dans des aliquotes de 10 mL pour minimiser le nombre de cycles de congélation / dégel.
    2. Ajouter 124,24 mL d’eau stérile à la bouteille de 250 mL autoclavée vide.
    3. Ajouter 25,76 mL de 50x stock d’acides aminés essentiels au mélange.
    4. Ajouter 80,14 mL de 100x stock d’acides aminés non essentiels au mélange.
    5. Ajouter 10 mL de 100x de vitamines (décongelées) au mélange.
    6. Ajouter 1 mL de stock de métaux traces 1000x au mélange.
    7. Ajouter 8,33 mL d’émulsion de jaune d’œuf à 30 % au mélange.
    8. Ajouter 400 μL de 10 g/L de ferritine au mélange.
    9. Mélangez bien la solution en agitant manuellement.
  4. Milieu d’expectorations artificielles (ASM)
    1. Ajouter 250 mL d’ASCM à la bouteille de 1 L contenant de l’ASMM.
    2. Ajouter 250 mL d’ASBM à la bouteille moyenne.
    3. Titrer le support avec un tampon MOPS de base (1 M) pour atteindre un pH de 6,3 sur un papier à pH à plage étroite. Avant le titrage, le mélange moyen sera trop acide.
    4. Réfrigérer les expectorations artificielles résultantes à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être filtrées.
    5. Pour démarrer le processus de filtration, transférez 200 mL de milieu d’expectorations artificielles non filtrées à un système de filtration sous vide avec un filtre de taille de pores de 0,22 μm.
    6. Connectez le système de filtration à la pompe à vide, allumez la pompe à vide, réglez-la à 70 mbar, puis placez la chambre sur un agitateur orbital qui secoue à 90 tr/min dans une chambre froide à 4 °C.
      1. Complétez avec 150 mL supplémentaires du milieu car une quantité appréciable est filtrée. Il faut 1-2 jours pour filtrer complètement 1 L de milieu.
      2. Répétez l’opération avec des chambres supplémentaires jusqu’à ce que tous les supports soient filtrés.
        REMARQUE: Essayez de ne pas filtrer plus de 350 mL du milieu à travers le même filtre de 0,22 μm, car la mucine bouchera le filtre au fil du temps.
    7. Réfrigérer les expectorations artificielles filtrées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Utilisez ASM dans le mois suivant la préparation pour de meilleurs résultats.

2. Épargne d’oxygène

  1. Configuration de la station de combat
    REMARQUE: Ce protocole ne devrait avoir besoin d’être effectué en entier qu’une seule fois, après quoi la configuration peut être maintenue par une simple maintenance si nécessaire. Voir la figure 1 pour un schéma visuel du système de stockage d’oxygène.
    1. Obtenez et sécurisez correctement les réservoirs d’air comprimé et d’oxygène.
      ATTENTION: La haute pression rend les réservoirs extrêmement dangereux lorsqu’ils sont mal manipulés. Assurez-vous que les réservoirs sont complètement scellés et sécurisés, qu’il n’y a pas de fuites lorsque le réservoir est fermé et que tout le personnel de manutention est entièrement formé à leur utilisation.
    2. Fixez un régulateur d’air au réservoir d’air comprimé à l’aide d’une clé. Pour une lecture optimale du débit sur le régulateur, fixez le régulateur aussi près que possible d’une position verticale.
    3. Fixez un régulateur d’oxygène au réservoir d’oxygène comprimé, en le fixant le plus près possible d’une position verticale. Selon le réservoir d’oxygène, il peut être nécessaire d’inverser la direction pour serrer.
    4. Connectez le tube des régulateurs à un connecteur en Y pour combiner le flux de gaz des deux réservoirs.
    5. Connectez la sortie du connecteur en Y à la vanne centrale de jonction en T.
    6. Connectez un côté de la vanne centrale à jonction en T à un manomètre à gaz.
    7. Connectez l’autre côté du manomètre à gaz à un filtre à seringue stérile de 25 mm de diamètre avec une taille de pore de 0,22 μm.
    8. Fixez un deuxième filtre à seringue de 25 mm de diamètre à une seringue sans piston à utiliser comme dégagement de gaz pendant le combat.
    9. Connectez le dernier côté de la vanne centrale à jonction en T à une deuxième vanne à jonction en T pour le moniteur d’oxygène.
    10. Connectez un filtre à seringue de 25 mm de diamètre à un côté de cette deuxième valve à jonction en T, ainsi qu’un tube pour fixer des aiguilles de 18 G.
    11. Connectez le dernier côté de la deuxième vanne de jonction en T à l’appareil de surveillance de l’oxygène.
    12. Connectez un tube de coupure de l’autre côté de l’appareil de surveillance de l’oxygène à utiliser comme libération de gaz pendant la surveillance.
      ATTENTION : Lorsque vous testez ou utilisez le système d’échantillonnage de l’oxygène, prenez bonne note de la position des jonctions en T et assurez-vous qu’elle correspond au chemin prévu dans le système. Si vous ne le faites pas, la pression s’accumulera à l’intérieur du système et entraînera la défaillance et le démontage des composants.
    13. Pour la maintenance du système et pour qu’il continue à fonctionner à des performances optimales, les pratiques suivantes sont bénéfiques.
      1. Renforcez les connexions avec des quantités généreuses de ruban de téflon pour améliorer considérablement leur étanchéité et réduire le risque que les composants se détachent de la pression interne.
      2. Maintenir le débit combiné sous 10 L/min pour atténuer la pression maximale et éviter les défaillances.
      3. Si une fuite est suspectée, utilisez une solution détergente telle que des détecteurs de fuite de liquide disponibles dans le commerce pour identifier facilement son emplacement, car il bouillonnera au-dessus de toute fuite de gaz. Colmatez les fuites à l’aide d’un ruban de polytétrafluoroéthylène (p. ex. téflon).
      4. Remplacez les filtres à seringue de 25 mm de diamètre dans le système d’épandage d’oxygène toutes les deux semaines, mais cela varie en fonction de la fréquence d’utilisation. Au fil du temps, les particules coincées dans le filtre réduisent le débit de gaz et provoquent des accumulations de pression.
      5. Étalonnez le moniteur d’oxygène à 21% d’oxygène d’air comprimé avant d’effectuer des mesures.
      6. Une fois l’utilisation du système terminée, éteignez les réservoirs et purgez l’excès de gaz des régulateurs jusqu’à ce que le débit s’arrête complètement.
  2. Sécrétisme de culture en flacon
    1. Étiqueter les flacons de sérum autoclavés de 500 mL avec les identificateurs d’échantillon, la date et l’heure de l’inoculation et le pourcentage d’oxygène cible.
    2. Dans une hotte biologique, ajouter 24 mL de milieu d’expectorations artificielles à chaque flacon de sérum mis en place.
    3. Ajouter 1 mL d’expectorations du patient homogénéisées avec une aiguille de 18 G (diluée avec une solution saline stérile si nécessaire pour obtenir un volume suffisant d’échantillon pour chaque condition de culture) à chaque flacon de sérum.
    4. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les bouchons en caoutchouc autoclavés sur le dessus de chaque flacon de sérum.
    5. Appuyez sur les bouchons en caoutchouc, veillez à ne pas toucher le dessous du bouchon avec les mains.
    6. Retirez les bouteilles de la hotte, appliquez et sertissez les joints en aluminium. Retirez la pièce maîtresse des joints.
    7. Essuyez le dessus des bouteilles avec une lingette à l’alcool et passez-les à travers une flamme de brûleur Bunsen.
    8. Fixez une aiguille stérile de 18 G à une seringue sans piston avec un filtre. Insérez d’abord ce dégagement de gaz dans la bouteille.
    9. Fixez une aiguille stérile de 18 G à la sortie de gaz du système et insérez également l’aiguille de sortie de gaz dans la bouteille.
    10. Acheminez les jonctions en T des réservoirs à travers le moniteur d’oxygène. Vérifiez que la concentration cible d’oxygène circule dans le système. Ciblez environ 5 L/min de débit de gaz.
    11. Redirigez les jonctions en T des réservoirs jusqu’à la sortie de gaz. Le gaz commence à circuler à travers le flacon de sérum.
      ATTENTION : Portez une attention particulière au manomètre pendant le stockage de l’oxygène. Si la pression augmente de manière inattendue, éteignez immédiatement le système.
    12. Faites couler l’oxygène dans le flacon de sérum pendant 1 min. À 5 L/min, cela permet 10 échanges d’air et garantit que l’atmosphère interne atteint la pression partielle souhaitée.
    13. Retirez l’aiguille de dégagement de gaz 18-G.
    14. Laissez la pression dans le flacon de sérum s’accumuler jusqu’à +1 atmosphère (2 atmosphères au niveau de la mer), puis retirez immédiatement l’aiguille de sortie de gaz.
      REMARQUE: Le maintien de la pression favorise la rétention des conditions hyperoxiques au fil du temps.
    15. Placez le flacon de sérum dans un agitateur d’incubateur à 37 °C à 150 tr/min. Incuber les échantillons pendant trois intervalles de 24 heures. À chaque intervalle de 24 heures, prélever une aliquote pour l’analyse en aval, rééposer les échantillons et les remettre en incubation pendant une durée totale d’incubation de 72 h.
  3. Mesure de l’oxygène sortant
    1. Étalonnez le compteur d’oxygène à 21 % d’air comprimé, puis éteignez le réservoir.
    2. Acheminez la prise de sérum à travers le moniteur d’oxygène et fixez une aiguille stérile à la fin.
    3. Insérez l’aiguille à travers le bouchon en caoutchouc dans le flacon de sérum.
    4. Attendez que la lecture du débit sortant se stabilise. Un faible débit hors des bouteilles de sérum signifie que cela peut prendre jusqu’à 2 minutes. Signalez la différence maximale par rapport à l’air ambiant (nombre le plus éloigné de 21 %).
    5. Si vous effectuez plusieurs lectures, rincez le système avec de l’air comprimé entre les lectures.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces protocoles ont été appliqués à 50 échantillons d’expectorations expectorées provenant de pwCF présentant des soins de routine à une clinique ambulatoire de fibrose kystique au Massachusetts General Hospital à Boston, Massachusetts. Les expectorations de chaque patient ont été cultivées dans des conditions d’oxygène de 21%, 50% et 100% en utilisant le milieu d’expectorations artificielles, avec des aliquotes de 0,5 mL prélevées sur chaque culture à 24 h, 48 h et 72 h de temps de culture pour les tests. Les cultures on...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, un modèle in vitro a été développé pour étudier l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes pulmonaires. Ce modèle, basé sur des expectorations artificielles et le stockage quotidien de flacons de sérum, maintient des concentrations élevées d’oxygène et favorise la croissance des microbes identifiés dans les expectorations du PWCF.

Cette approche comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est le choix d’utiliser la stérilisation par filtre plutôt que...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une partie de ce travail a été réalisée au Laboratoire de biologie marine avec le soutien du Laboratoire de biologie marine, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numéro de subvention 5600373), et un don de la Fondation Simons.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BME Vitamins (100x) SolutionMilliporeSigmaB6891Solution concentrée de vitamines supplémentaires.
Sertisseuse, 30 mmDWK Life Sciences224307Sertisseuse pour la fixation de joints en aluminium sur des flacons de sérum.
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG7021Poudre de glucose solide (isomère dextrogyre).
Pompe à membrane ME 2 NTVACUUBRAND20730003Pompe à vide pour la filtration sous vide.
Emulsion de jaune d’œufHiMediaFD045Émulsion stérile de 30 % de jaune d’œuf dans une solution saline.
Ferritine cationisée à partir de la rate de chevalMilliporeSigmaF7879Ferritine (protéine de stockage du fer).
FIREBOY plus Safety Bunsen BurnerIntegra Biosciences144000Bec Bunsen avec interface utilisateur et fonctions de sécurité.
Papier pH Hydrion (1,0&ndash ; 14.0)Micro Essential Laboratory94pour la plage de 1,0 à 14,0.
Papier pH Hydrion (4,0&ndash ; 9.0)Micro Essential Laboratory55pour la plage de 4,0 à 9,0.
Papier pH Hydrion (6,0&ndash ; 8.0)Micro Essential Laboratory345pour la plage de 6,0 à 8,0.
Aiguille hypodermique Needle-Pro EDGE Dispositif de sécurité, 18 GSmiths Medical401815aiguilles 18 G avec capuchons de sécurité.
Manomètre en ligneMilliporeSigma20469Manomètre de gaz pour la surveillance de la pression des bouteilles.
Innova 42 Agitateur incubéEppendorf2231000756Combinaison incubateur/agitateur orbital.
Seringue Luer-Lok avec aiguille attachéeBecton Dickinson309580Seringue combinée de 3 ml et aiguille de 18 g.
Gamme de vannes LuerWorld Precision Instruments14011Vannes pour tubes d’écoulement de gaz.
Agitateur orbital LSEThermoFisher Scientific6780-NPAgitateur orbital pour agiter les médias pendant la filtration.
Sulfate de magnésium heptahydratéMilliporeSigmaM2773Sel d’Epsom solide (sulfate de magnésium heptahydraté).
Régulateur d’air médical à un étage avec débitmètreWestern EnterprisesM1-346-15FMRégulateur de débit d’air avec compteur de 15 L/min.
MEM Amino Acids (50x) SolutionMilliporeSigmaM5550Solution concentrée d’acides aminés essentiels.
MEM Acides aminés non essentiels (100x) SolutionMilliporeSigmaM7145Solution concentrée d’acides aminés non essentiels.
Filtre Millex-GP, 0,22 & micro ; mMilliporeSigmaSLMP25SS0,22 & micro ; Filtre à seringue stérile à membrane M polyéthersulfone.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01système de filtration d’eau stérile Milli-Q.
MiniOX 3000 Moniteur d’oxygèneMSA814365Moniteur de pourcentage d’oxygène en débit de gaz.
Tampon MOPS (1 M, pH 9,0)Boston BioProductsBBM-90Tampon MOPS pour ajuster le pH du support.
Mucine de l’estomac porcinMilliporeSigmaM2378Mucine (protéine glycosylée formant un gel) en poudre.
Kit de raccords cannelés en polypropylène naturelHarvard Apparatus72-1413Connecteurs pour tubes d’écoulement de gaz.
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1096 Préparation dela banque pour l’identification pendant le séquençage.
Système de séquençage NovaSeq 6000Illumina770-2016-025-NPlate-forme de séquençage canon pour la génération de lectures d’échantillons.
Régulateur d’oxygène à un étage avec débitmètreWestern EnterprisesM1-540-15FMRégulateur de débit d’oxygène avec compteur de 15 L/min.
Tube d’oxygène avec 2 connecteurs standardSunMed2001-01Tube pour le raccordement des composants du système de gaz.
Solution saline tamponnée au phosphate, 10x, pH 7,4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235Solution saline concentrée tamponnée au phosphate.
PC 420 Plaque chauffante/AgitateurMarshall ScientificCO-PC420Combinaison plaque chauffante/agitateur.
Chlorure de potassiumMilliporeSigmaP9541Sel solide de chlorure de potassium.
Barres d’agitation jetables en PTFEThermoFisher Scientific14-513-95Barres d’agitation magnétiques jetables.
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Cartouche de purification Q-Gard 2MilliporeSigmaQGARD00D2Cartouche de purification pour système Milli-Q.
Bouteilles de stockage de milieux réutilisablesThermoFisher Scientific06-423ABouteilles pour le mélange et le stockage des milieux de culture.
Bouchon en caoutchouc, 30 mm, gris bromobutyleDWK Life Sciences224100-331Bouchons en caoutchouc pour flacons de sérum.
Flacon de sérum avec graduations moulées, 500 mLDWK Life Sciences223952Des flacons de sérum en verre pour une culture scellée.
Kit d’extension de petit alésageBraun Medical471960Rallonge de tube avec connecteurs Luer Lock.
Chlorure de sodiumMilliporeSigmaS3014Sel de chlorure de sodium solide.
Spike-in Control I (charge microbienne élevée)ZymoBIOMICSD6320Microbes de pointe (I. halotolerans et A. halotolerans) pour le calcul de la charge microbienne absolue
vide à dégagement rapide StericupMilliporeSigmaS2GPU02RE250 mL 0,22 µ ; M Chambre de filtration sous vide.
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Papier d’analyse du pH Papier d’analyse du pH Papier d’analyse du pH Système de filtration stérile sous

Références

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