Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Résumé

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones.

Résumé

Le Ca²⁺ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca^2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca²⁺ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca²⁺ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca^2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca^2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca^{2+, ainsi} que les interactions astrocyte-neurone.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca²⁺ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca²⁺dans des conditions physiologiques^1,2<....

Protocole

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia.

1. Construction de plasmides d’ADN

REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits.

1. Insérer la matrice mitochondriale (MM)-séquence de ciblage (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG

Résultats

L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca²⁺ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ sont présentés ici.

Signalisation mitochondrialein vitro du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones

Discussion

Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un promoteu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pommade pour larmes artificielles	Rugby	NDC-0536-6550-91	83 % de vaseline blanche
Colle cyanoacrylate	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissection stéréomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Chirurgie
Pince Dumont à pointe fine	Outils de science fine	11255-20	pour l’enlèvement de dura Lames de
protection en verre, 0,13-0,17 mm d’épaisseur	Fisher Scientific	12-542A	pour couvercle de fenêtre crânienne
Micro-foret à grande vitesse	Outils de sciences fines	18000-17	avec foret de polissage des os
Seringue d’injection	Hamilton	2,5 ml	pour injection virale
Kétamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg poids corporel
Agarose à faible point de fusion	Sigma-Aldrich	A9793	réduction des artefacts de mouvement Cadre
en métal	Sur mesure	voir Fig 1	pour la fixation du cerveau à la platine du microscope
Contrôleur de pompe à microseringue	World Precision Instruments	UMP3	Contrôleur de vitesse d’injection
Dispositif stéréotaxique de souris Stoelting		51725	pour tenir les souris
Chambre de perfusion	Warner Instruments	64-0284
Système de perfusion	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Coussin chauffant autorégulant	Outils de science fine	21061	pour prévenir l’hypothermie des souris
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	colorant fluorescent rouge pour marquer les astrocytes
Ciseaux chirurgicaux, 12 cm	Outils de science fine	14002-12	pour la dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	pour le nettoyage du matériau
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg de poids corporel