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Article de méthode

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

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DOI :

10.3791/62945

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20 septembre 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

Dans cet article

Résumé

L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Résumé

Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Introduction

Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs8,9,10. Cependant, la distribution des molécules de signalisation et des récepteurs impliqués dans la détection vagale reste mal caractérisée. C’est en partie parce que les ganglions vagales, malgré leur petite taille, expriment un large spectre de récepteurs, y compris un grand nombre de RCPG8,11,12,13. De plus, les neurones afférents vagals sont intrinsèquement hétérogènes et présentent des profils moléculaires distincts14. Pour compliquer la question, les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses sont attachés dans la souris, formant ainsi une seule masse ganglionnaire. Enfin, chez un sous-ensemble d’animaux, le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur sympathique15.

Dans le passé, les chercheurs se sont tournés vers l’immunohistochimie pour étudier la composition neurochimique des neurones afférentsvagals 16,17,18. Bien que l’immunohistochimie utilisant des anticorps validés soit utile, les résultats des études immunohistochimiques doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, de nombreux efforts pour identifier des anticorps spécifiques contre les RCPG ont échoué19,20,21,22,23,24,25, ce qui a conduit les chercheurs à conclure que la majorité des anticorps contre les RCPG ne sont pas fiables. Pour contourner ces problèmes, la PCR quantitative (qPCR) a été largement utilisée pour évaluer l’expression des gènes dans la masse ganglionnaire vagale du rongeur26,27,28,29. Cependant, l’examen de l’expression des gènes à l’aide de la qPCR se fait au prix d’une perte d’information spatiale. En particulier, il est impossible de prédire combien de cellules ou quel(s) type(s) cellulaire(s) expriment un gène particulier d’intérêt (p. ex., nodose vs cellules jugulaires). Les problèmes récurrents comprennent également la contamination par les tissus adjacents et l’inclusion de longueurs variables du nerf vague, des ganglions cervicaux supérieurs et jugulaires pendant la dissection15. En raison des difficultés ci-dessus, la controverse entoure l’expression et la distribution de plusieurs RCPG dans les neurones afférents vagals. Un exemple particulièrement déroutant concerne le récepteur de la ghréline (Ghsr). Alors que certaines études ont trouvé une expression répandue de ce récepteur dans les neurones afférents vagaux30,31,32, d’autres ont trouvé que l’ARNm Ghsr était presque indétectable dans le ganglion nodosé11,14. Une cartographie détaillée de l’ARNm Ghsr dans la masse ganglionnaire vagale est donc justifiée.

L’hybridation in situ (ISH) a également été utilisée pour évaluer les modèles d’expression génique dans la masse ganglionnaire vagale7,11,12,33,34,35. Parce que les techniques à base d’ARN restent plus fiables et spécifiques que les techniques à base d’anticorps dans la plupart des circonstances36,37, les études ISH se sont avérées précieuses pour une meilleure compréhension du codage neurochimique des neurones afférents vagal. Néanmoins, les techniques ISH traditionnelles elles-mêmes ne sont pas sans réserves. L’ISH radioactif est sensible mais génère un fond et reste encombrant38. L’ISH non radioactif est moins compliqué mais aussi moins sensible38. En revanche, la méthode RNAscope ISH récemment développée est très sensible et génère un arrière-plan minimal39. La présente étude a appliqué un ARN fluorescent multiplex à la détection de RCPG dans les neurones afférents vagaux de la souris. Nous nous sommes concentrés sur la cartographie de la distribution de Ghsr et avons comparé sa distribution à celle du récepteur de la cholécystokinine (Cck1r), un autre RCPG bien connu pour être exprimé dans le ganglion nodostique34. Enfin, les deux facteurs de transcription, l’homéobox 2b de type apparié (Phox2b) et la protéine de doigt de zinc du domaine PR 12 (Prdm12), ont été utilisés comme marqueurs sélectifs pour les neurones nodose et afférent jugulaire, respectivement14. Sans visualiser Phox2b ou Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les afférences jugulaires par rapport aux nodoses. Les pièges techniques potentiels sont également discutés tout au long de l’article.

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Protocole

REMARQUE: Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles de type sauvage sur un fond pur C57BL / 6J. Au total, 4 souris ont été utilisées pour le multiplex ISH. Toutes les souris avaient environ 8 semaines au moment du sacrifice. Une souris mâle (âgée d’environ un an) a également été utilisée pour démontrer une fluorescence endogène associée au vieillissement. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées à l’intérieur d’une installation de barrière avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical UT Southwestern a examiné et approuvé les procédures décrites ci-dessous. Des détails sur les réactifs et les outils peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.

1. Prélèvement d’échantillons

  1. Le jour du sacrifice, administrer une surdose d’hydrate de chloral (500 mg / kg, i.p.) aux souris. Perfuser les souris profondément anesthésiées de manière transcardique à l’aide d’une pompe péristaltique avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 50 mL de formol à 10% à température ambiante.
    REMARQUE: Ceci est fait dans une hotte pour empêcher l’inhalation de formol.
  2. Comme les ganglions nodoses, pétrosaux et jugulaires sont fusionnés pour former une seule masse ganglionnaire chez la souris15,collectez soigneusement toute la masse ganglionnaire vagale de chaque côté (gauche et droite) à l’aide d’une lunette de dissection et de fines ciseaux et pinces à ressort (voir le tableau des matériaux).
  3. Lorsque vous décapitez la souris avec une paire de gros ciseaux (voir la Table des matériaux),évitez d’écraser le tronc cérébral.
  4. Suite à une approche de dissection décrite précédemment chez le rat40,retirer les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée avec de petites pinces (Table des matériaux) pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région du muscle, du tissu adipeux et du tissu conjonctif jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague, le nerf hypoglosse et le foramen magnum soient visibles. Couper tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).
  5. Recherchez le ganglion nodosé comme une masse translucide proche du foramen magnum15. À l’aide de petits ciseaux (Table des matériaux), cassez soigneusement l’os occipital pour exposer davantage le ganglion jugulaire. Recherchez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel.
  6. Couper les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et extraire toute la masse ganglionnaire en tirant doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort (Table des matériaux).
  7. Enlevez le tissu conjonctif et la graisse collant au nerf vague et à la masse ganglionnaire autant que possible.
  8. Comme il est facile de perdre un ganglion lors du transfert d’un tube à l’autre, gardez ~ 0,5 cm du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons.
  9. Placer les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber à 4 °C dans du formol pendant 24 h et avec 30 % de saccharose pendant encore 24 h.
  10. Positionnez les ganglions à l’intérieur d’une petite goutte (~4 mm Ø) de température de coupe optimale (OCT) sur un morceau de papier d’aluminium. Ensuite, congelez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.
  11. Découpez les échantillons avec un cryostat à -20 °C en sections de 14 μm d’épaisseur et collectez sur des lames de microscope en verre à 3 séries espacées de 42 μm.
    REMARQUE : Évitez de placer des sections près des bords de la diapositive. Pour économiser les réactifs, gardez les sections de tissu aussi serrées que possible, mais sans chevauchement.
  12. Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour l’ISH pendant au moins 6 mois.
    REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1 pour le dépannage de la fluorescence endogène.

2. Prétraitement et ISH

  1. Avant le jour des expériences, la verrerie de laboratoire en autoclave à utiliser pour l’ISH, y compris la coloration de la vaisselle et le lavage des pots tampons.
    REMARQUE: Bien que travailler dans des conditions sans RNase ne soit pas critique, portez des gants en tout temps. Gardez les flacons de solution de décontamination de la RNase (Table des matériaux) à portée de main en cas de suspicion de contamination.
  2. Le premier jour, amenez les toboggans à température ambiante sur un banc spécifiquement dédié à l’ISH. Rincez les lames dans 1x PBS et faites-les cuire pendant 30 minutes à 60 °C dans un four à pâtisserie(Table des matériaux).
  3. Post-fixer les lames dans du formol à 4% pendant 15 min à 4 °C.
  4. Amenez les réactifs dans le kit multiplex(Table des matériaux)à température ambiante.
  5. Déshydratez les lames en 50%, 70% et 100% d’éthanol pendant 5 min chacune. Appliquer la solution H2O2 sur les échantillons pendant 10 min, puis rincer à l’eau double distillée (ddH2O).
  6. Traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant 5 min, rincer dans du ddH2O suivi d’éthanol à 100 % et sécher à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons.
    REMARQUE: N’appliquez pas la barrière hydrophobe trop près des sections de tissu.
  7. Appliquer la protéase pendant 30 min à 40 °C dans un four d’hybridation (Table des matériaux).
  8. En attendant, préchauffer les sondes à 40 °C et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.
  9. Incuber le tissu témoin négatif avec la sonde C1 cible de la dihydrodipicolinate réductase (DapB) pendant 2 h à 40 °C dans un four d’hybridation.
  10. Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les pendant la nuit dans 5x le citrate de sodium salin (SSC) à température ambiante. Pour plus de commodité, divisez l’expérience en deux jours. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage et incuvrez-les avec des réactifs d’amplification énumérés ci-dessous (voir le manuel d’utilisation dans le tableau des matériaux).
  11. Appliquer AMP1 (30 min à 40 °C), AMP2 (30 min à 40 °C) et AMP 3 (15 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
  12. Dissoudre chaque colorant opale(Table des matériaux)dans du sulfoxyde de diméthyle et conserver les solutions à 4 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
  13. Pour le canal 1, incuber les lames avec HRP-C1 (15 min à 40 °C) et Opal 520 (couleur verte ; dilution 1/1 500 ; 30 minutes à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
  14. Pour le canal 2, incuber les lames avec HRP-C2 (15 min à 40 °C) et Opal 570 (couleur jaune ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
  15. Pour le canal 3, incuber les lames avec HRP-C3 (15 min à 40 °C) et Opal 690 (couleur rouge foncé ; dilution 1/1 500 ; pendant 30 min à 40 °C). Rincer dans un tampon de lavage entre chaque étape.
  16. Lavez les lames et exposez-les au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 s.
  17. Appliquez immédiatement le support de montage sur chaque lame et placez un couvercle sur la section de tissu.
  18. Gardez les tissus à l’horizontale dans un porte-lames à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

3. Microscopie et analyse de données

REMARQUE: Les données ISH multiplex peuvent être imagées avec une large gamme d’instruments avec les filtres appropriés. Cependant, une méthode d’imagerie préférée est la microscopie confocale avec des objectifs 20x et 63x (huile); se référer à la discussion pour les raisons. Reportez-vous à la Figure 2 pour déterminer le rapport signal/bruit optimal.

  1. Utilisez un microscope confocal équipé de lignes laser de 488, 561 et 633 nm. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants (voir tableau 1): Opale 690 (HeNe 633 nm, plage de détection 668-696 nm, puissance 2,0, gain 724) ; Opal 570 (laser DPSS 561 nm, plage de détection 579-627 nm, puissance < 15,0,
  2. Pour améliorer la qualité des images, acquérez avec une moyenne de ligne de 4 et une taille de pixel d’au moins 1024 x 1024.
    REMARQUE: Les paramètres ci-dessus ne sont fournis qu’à titre d’exemple, et des modifications sont recommandées en fonction d’un instrument, du grossissement (20x ou 63x), des niveaux d’expression et des niveaux endogènes de fluorescence pour un tissu donné.
  3. Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, collectez les images en utilisant les mêmes paramètres. Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation.
    REMARQUE: Par exemple, rouge (Phox2b ou Prdm12), cyan (Cck1r), jaune (Ghsr) et gris (DAPI).
  4. Effectuez le comptage cellulaire à l’aide des images numériques en identifiant le contour des profils RNAscope-positif avec un noyau légèrement coloré avec DAPI. Calculer le pourcentage de profils RNAscope-positifs exprimant chaque transcription [Figure 3A-C].
  5. Pour améliorer la rigueur et la précision des estimations, comptez au moins 2 000 profils neuronaux d’au moins 4 animaux différents. Effectuez le comptage des ganglions gauche et droit séparément.
  6. Entrez les données dans un graphique à secteurs avec le nombre total de profils comptés.
  7. Utilisez un logiciel d’imagerie pour acquérir des images et assembler des images 20x. Utilisez ImageJ-Fiji et un autre logiciel de photo et de conception pour générer les plaques finales. Appliquez des réglages de contraste et de luminosité uniformément à toutes les images.

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Résultats

Bien que RNAScope puisse être appliqué à des animaux de tout âge, sexe ou bagage génétique, il est conseillé de travailler avec de jeunes adultes (<3 mois). En effet, les artefacts fluorescents (par exemple, la lipofuscine) sont des résultats courants dans les neurones d’animaux plus âgés41. Les ganglions fixés au formol de souris plus âgées contiennent souvent une fluorescence endogène étonnamment intense qui peut facilement être confondue avec une véritable coloration(Fig...

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Discussion

La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 196042. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. Néanmoins, les méthodes ish traditi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financé par la subvention des NIH #5P01DK119130-02. Les auteurs tiennent à remercier l’UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (dirigé par le Dr Phelps) et son personnel (Abhijit Bugde et Marcel Mettlen), soutenus en partie par la subvention des NIH #1S10OD021684-01, une ressource partagée du Harold C. Simmons Cancer Center, soutenue en partie par une subvention de soutien du NCI Cancer Center, P30 CA142543.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10xPBS Fisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° ; C congélateurPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Logiciel de photo et de conceptionAdobe
Four de cuissonThermo ScientificModèle :658
Microscope confocalZeissLSM880 Airyscan
Verre de couvertureBrain Research Laboratories2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 PinceF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lsupport de montage
HybEZ fourd’hybridation four
Stylo hydrophobeVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Grands ciseauxHenry Schein100-7561
Micro tubes à centrifugerVWR20170-333
Minipump débit variableFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTBiomarqueur fluorescent
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTBiomarqueur fluorescent
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTBiomarqueur fluorescent
ProLong Gold Support depour cellules marquées par fluorescence
RNAscope Kit de réactifs fluorescents multiplex v2ACD /Bio-Techne323100Kit multiplex
Sonde RNAscope Souris Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
Sonde RNAscope Souris DapBACD /Bio-Techne310043
Sonde RNAscope Souris GhsrACD /Bio-Techne
Sonde RNAscope Souris Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
Sonde RNAscope Souris Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase solution décontaminante
Petits ciseaux de dissectionLames Millipore SigmaZ265977
Superfrost PlusFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
Mode d’emploiACD323100 USM
Vannas Ciseaux à ressortRobozRS 5620
ZEN Logiciel d’imagerieZeiss
montage anti-effusion 426141

Références

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R cepteurs coupl s aux prot ines GISH multiplexeganglions nodoses jugulairestechnologie RNAscopemicroscopie confocaler cepteur de la chol cystokininer cepteur de la ghr linemarqueur Phox2b
Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex
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