Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

Résumé

L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Résumé

Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Introduction

Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses^1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux^4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs^8,

Protocole

REMARQUE: Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles de type sauvage sur un fond pur C57BL / 6J. Au total, 4 souris ont été utilisées pour le multiplex ISH. Toutes les souris avaient environ 8 semaines au moment du sacrifice. Une souris mâle (âgée d’environ un an) a également été utilisée pour démontrer une fluorescence endogène associée au vieillissement. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées à l’intérieur d’une installation de barrière avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical UT Southwestern a examiné et approuvé les procédures décrites ci-....

Résultats

Bien que RNAScope puisse être appliqué à des animaux de tout âge, sexe ou bagage génétique, il est conseillé de travailler avec de jeunes adultes (<3 mois). En effet, les artefacts fluorescents (par exemple, la lipofuscine) sont des résultats courants dans les neurones d’animaux plus âgés⁴¹. Les ganglions fixés au formol de souris plus âgées contiennent souvent une fluorescence endogène étonnamment intense qui peut facilement être confondue avec une véritable coloration(Fig.......

Discussion

La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 1960^42. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique^43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. Néanmoins, les méthodes ish traditi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x	PBS Fisher Scientific	BP399-4
20x SSC	Invitrogen	AM9763-80
° ; C congélateur	PHCBI	MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021	Logiciel de photo et de conception	Adobe
Four de cuisson	Thermo Scientific	Modèle :658
Microscope confocal	Zeiss	LSM880 Airyscan
Verre de couverture	Brain Research Laboratories	2460-1.5D
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Dumont #5 Pince	F.S.T.	11252-20
Ecomount	Biocare Medical	EM 897L	support de montage
HybEZ four			d’hybridation four
Stylo hydrophobe	Vector Laboratories	H-4000
ImageJ-Fiji	NIH
Grands ciseaux	Henry Schein	100-7561
Micro tubes à centrifuger	VWR	20170-333
Minipump débit variable	Fisher Scientific	13-876-1
Opal 520	Akoya biosciences	FP1 1487001KT	Biomarqueur fluorescent
Opal 570	Akoya biosciences	FP1 1488001KT	Biomarqueur fluorescent
Opal 690	Akoya biosciences	FP1 1497001KT	Biomarqueur fluorescent
ProLong Gold Support de			pour cellules marquées par fluorescence
RNAscope Kit de réactifs fluorescents multiplex v2	ACD /Bio-Techne	323100	Kit multiplex
Sonde RNAscope Souris Cck1r-C3	ACD /Bio-Techne	313751-C3
Sonde RNAscope Souris DapB	ACD /Bio-Techne	310043
Sonde RNAscope Souris Ghsr	ACD /Bio-Techne
Sonde RNAscope Souris Phox2b-C2	ACD /Bio-Techne	407861-C2
Sonde RNAscope Souris Prdm12-C2	ACD /Bio-Techne	524371-C2
RnaseZap	Sigma	R2020	Rnase solution décontaminante
Petits ciseaux de dissection	Lames Millipore Sigma	Z265977
Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015
Tissue Tek OCT medium	Sakura	4583
Mode d’emploi	ACD	323100 USM
Vannas Ciseaux à ressort	Roboz	RS 5620
ZEN Logiciel d’imagerie	Zeiss

montage anti-effusion 426141