Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Summary

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Abstract

L’ubiquitine est une petite protéine de 8,6 kDa qui est un composant central du système ubiquitine-protéasome. Par conséquent, il peut se lier à un large éventail de protéines avec une spécificité élevée mais une faible affinité. Grâce à l’affichage des phages, les variantes de l’ubiquitine (UbV) peuvent être conçues de manière à présenter une affinité améliorée par rapport à l’ubiquitine de type sauvage et à maintenir une spécificité de liaison aux protéines cibles. L’affichage des phages utilise une bibliothèque de phagémides, dans laquelle la protéine de la couche pIII d’un bactériophage filamenteux M13 (choisie parce qu’elle est affichée à l’extérieur sur la surface du phage) est fusionnée avec des UbV. Les résidus spécifiques de l’ubiquitine de type sauvage humain sont mous et randomisés (c.-à-d. qu’il existe un biais vers la séquence de type sauvage indigène) pour générer des UbV afin d’éviter les changements délétères dans la conformation des protéines tout en introduisant la diversité nécessaire pour promouvoir de nouvelles interactions avec la protéine cible. Au cours du processus d’affichage des phages, ces UbV sont exprimés et affichés sur les protéines de la couche de phage et placés contre une protéine d’intérêt. Les UbV qui présentent des interactions de liaison favorables avec la protéine cible sont conservés, tandis que les liants pauvres sont emportés et retirés du pool de la bibliothèque. Les UbV retenus, qui sont attachés à la particule de phage contenant le phagémide correspondant de l’UbV, sont élués, amplifiés et concentrés de sorte qu’ils puissent être placés contre la même protéine cible dans une autre série d’affichage de phages. En règle générale, jusqu’à cinq cycles d’affichage de phages sont effectués, au cours desquels une forte pression de sélection est imposée contre les UbV qui se lient faiblement et / ou promiscuité afin que ceux ayant des affinités plus élevées soient concentrés et enrichis. En fin de compte, les UbV qui démontrent une spécificité et/ou une affinité plus élevée pour la protéine cible que leurs homologues de type sauvage sont isolés et peuvent être caractérisés par d’autres expériences.

Introduction

Comprendre les détails moléculaires des interactions protéine-protéine est essentiel pour délimiter les mécanismes de transduction du signal des processus biologiques, en particulier ceux qui contribuent à des maladies cliniquement importantes. Au cours des dernières années, l’affichage des phages a été utilisé comme une méthode pratique et accessible pour isoler les protéines / peptides avec une liaison beaucoup améliorée à une protéine cible souhaitée1,2,3,4, qui à son tour peut être utilisée comme sonde intracellulaire des interactions protéine-protéine.

L’ubiquitination est une cascade d’activités enzymatiques (enzyme activatrice E1 → enzyme conjuguante E2 → ligas E3) qui conjuguent de manière covalente l’ubiquitine (Ub) aux substrats protéiques pour les cibler pour la dégradation ou pour arbitrer les changements de signalisation cellulaire. De plus, les déubiquitinases catalysent l’élimination de l’ubiquitine des protéines. Par conséquent, dans les cellules, il existe des milliers d’interactions protéine-protéine dépendantes de l’Ub, dont la grande majorité reconnaît une surface commune avec une faible affinité mais une spécificité élevée pour permettre des interactions faibles à travers des surfaces grandes et diverses.

Ernst et al. ont introduit des mutations dans des régions de liaison connues d’Ub afin de voir si elles pouvaient améliorer l’affinité de liaison pour une protéine d’intérêt tout en maintenant une sélectivité ^élevée5. Une bibliothèque combinatoire de plus de 10 milliards (7,5 x ¹⁰¹⁰) de variantes Ub (UbV) avec des mutations à des positions à travers la surface Ub qui médient les interactions Ub-protéine connues a été développée. Cette bibliothèque était composée de phagémides qui expriment la protéine de la couche de bactériophage PIII M13 fusionnée à des UbV diversifiés. Par conséquent, les UbV individuels peuvent être affichés à la surface du phage via la protéine de la couche lors de l’expression. Au cours du processus de sélection, les phages qui présentent des UbV avec des interactions de liaison considérables avec la protéine cible seront conservés et enrichis dans les cycles suivants d’affichage des phages, tandis que les phages affichant des UbV qui se lient mal à la protéine cible sont lavés et retirés du pool de phages. Les particules de phage retenues contiennent le phagémide correspondant à leur UbV affiché, ce qui leur permet d’être séquencées et caractérisées une fois isolées.

En utilisant cette stratégie d’ingénierie des protéines, des inhibiteurs de l’UbV ont été développés pour les déubiquitinases5 humaines et les protéases ^virales6. Il est important de noter que nous avons généré des UbV inhibiteurs pour les ligas E3 de la famille HECT humaine en détournant le site de liaison E2 et en activant les UbV qui occupent un exosite de liaison Ub sur le domaine ^HECT7. Nous pouvons également inhiber les E3 monomères de la famille RING en ciblant le site de liaison E2 et induire la dimérisation UbV pour activer l’anneau homodimérique ^E3s8. Pour les RING E3 multi-sous-unités, les UbV peuvent provoquer une inhibition en ciblant la sous-unité RING (par exemple, pour le complexe APC/^C9) ou en perturbant la formation de complexes (par exemple, pour SCF ^E3s10). Collectivement, les UbV peuvent être exploités pour interroger systématiquement les interactions protéine-protéine dans le système Ub-protéasome (UPS) afin que nous puissions mieux déchiffrer les mécanismes biochimiques des enzymes UPS et identifier et valider les sites fonctionnels pour une intervention thérapeutique.

Le protocole suivant décrit comment utiliser une bibliothèque UbV affichée par un phage précédemment générée pour cibler une protéine d’intérêt et comment enrichir les liants UbV qui interagissent avec la protéine cible à travers des cycles successifs d’affichage des phages.

Protocol

1. Préparation du réactif

1. PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : Mélanger 50 mL de solution 10x PBS avec 450 mL de _H2O ultrapur. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C ou température ambiante (~20-25 °C).
2. 10% de BSA (albumine sérique bovine) : Ajouter lentement 1 g de BSA à 7 mL de _H2O ultrapur et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 10 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
3. Tampon PB (PBS complété par 1% de BSA): Ajouter lentement 5 g de BSA à 400 mL de _H2O ultrapur et 50 mL de PBS et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
4. Tampon PBT (PBS complété par 1% de BSA et 0,05% Tween 20): Ajouter lentement 5 g de BSA à 400 mL de _H2O ultrapur et 50 mL de PBS et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Ajouter 250 μL de Tween 20. Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C.
5. Tampon PT (PBS complété par 0,05% Tween 20): Mélanger 1 mL de Tween 20 avec 400 mL de PBS. Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 2 L. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C ou à température ambiante (~20-25 °C).
6. Bouillon 2YT : Ajouter 16 g de tryptone, 10 g d’extrait de levure et 5 g de NaCl à 800 mL de _H2O ultrapur et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 1 L. Stériliser par autoclavage et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
7. Plaques LB/carb : Ajouter 12,5 g de mélange LB préfabriqué et 7,5 g de gélose à 400 mL de _H2O. Compléter avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL et stériliser par autoclavage. Assurez-vous que la gélose est complètement dissoute et attendez qu’elle refroidisse en dessous de 60 °C. Ajouter 500 μL de 100 mg mL de carbénicilline, bien mélanger et verser dans la plaque. Conserver à 4 °C.
8. Plaques LB/tet : Ajouter 12,5 g de mélange LB préfabriqué et 7,5 g de gélose à 400 mL de _H2O ultrapur. Compléter avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 500 mL et stériliser par autoclavage. Assurez-vous que la gélose est complètement dissoute et attendez qu’elle refroidisse en dessous de 60 °C. Ajouter 500 μL de 10 mg mL de tétracycline, bien mélanger et verser dans la plaque. Conserver à 4 °C.
9. 20 % de PEG (polyéthylène glycol)/2,5 M de NaCl : Ajouter 50 g de PEG-8000 et 36,5 g de NaCl à 200 mL de _H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
   REMARQUE: Cela peut prendre un certain temps; le chauffage peut aider. Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 250 mL. Stériliser par filtration ou autoclavage.
10. 0,1 M HCl: Mélanger 20 mL de 1 M HCl avec 180 mL de _H2O ultrapur. Stériliser par filtration et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11,0) : Ajouter 6,1 g de base Tris à 40 mL de _H2O ultrapur. Ajuster le pH à 11,0 avec HCl et mélanger jusqu’à ce que Tris soit complètement dissous. Complétez avec du _H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 50 mL. Stériliser par filtration et conserver à température ambiante (~20-25 °C).
12. 100 mg/mL (1000x) de carbenicilline : Ajouter 2 g de sel disodique de carbénicilline à 20 mL de _H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.
13. 50 mg/mL (1000x) de kanamycine : Ajouter 1 g de sulfate de kanamycine à 20 mL de _H2O ultrapur. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.
14. 10 mg/mL (1000x) de tétracycline : Ajouter 0,2 g de chlorhydrate de tétracycline à 20 mL d’éthanol à 70 %. Mélanger jusqu’à dissolution complète. Stériliser par filtration et conserver à -20 °C.

2. Préparation des protéines

1. Déterminer la concentration du stock protéique cible en μM. Le moyen le plus pratique d’évaluer la concentration en protéines est de mesurer l’absorbance du stock protéique à 280 nm. Si la concentration est connue en mg/mL, convertissez-la en μM en utilisant le poids moléculaire de la protéine cible. Une gamme de méthodes peut être utilisée en fonction de la protéine d’intérêt; voir la section Discussion pour plus de détails.
   REMARQUE: Si la protéine est tronquée (domaine / motif protéique spécifique) ou étiquetée, n’oubliez pas de tenir compte de ces changements de poids moléculaire lors de la conversion de mg / mL en μM.
2. Préparez trois tubes de microcentrifugation étiquetés « round 1 », « round 2/3 » et « round 4/5 ».
   1. Calculer le volume de protéine nécessaire pour le diluer à 1 μM dans 800 μL pbS et aliquoter ce volume dans les tubes sans ajouter de PBS.
      REMARQUE: Si la quantité de protéine cible disponible est faible, la concentration peut être réduite à aussi peu que 0,25 μM.

3. Préparation au premier tour de sélection

1. Préparez une culture de graines pour la culture de l’entrée de phages pour la deuxième ronde de sélection.
   1. Inoculer 5 mL de 2YT/tet avec une colonie d’Escherichia coli bien isolée et incuber pendant la nuit à 37 °C avec des secousses orbitales à 200 tr/min.
2. Enduire l’assiette pour le premier tour de sélection.
   1. Diluer la protéine cible dans le tube « rond 1 » avec la quantité appropriée de PBS et aliquoter 100 μL dans huit puits d’une plaque de liaison de 96 puits (c.-à-d. la plaque cible).
      REMARQUE: L’affichage des phages peut être effectué pour quatre protéines différentes simultanément sur une seule plaque en recouvrant les puits dans les coins de la plaque.
   2. Contrôle facultatif : Si la protéine cible est marquée, par exemple avec la TPS ou la MBP (protéine de liaison au maltose), recouvrir huit puits d’une autre plaque de liaison de 96 puits avec 100 μL d’une solution de 1 μM contenant l’étiquette d’épitope appropriée. Cela sera utilisé pour supprimer les phages indésirables qui se lient à la balise de manière non spécifique.
   3. Agiter la ou les plaques pendant la nuit à 4 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.

4. Premier tour de sélection

1. Préparez les entrées de la deuxième ronde.
   1. Inoculer 30 mL de 2YT/tet avec 200 μL de la culture de semences de l’étape 3.1.
   2. Incuber à 37 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min jusqu’à ce que les bactéries soient en phase mi-logarithmique (_OD600 0,6 - 0,8). Cela prend environ trois h.
2. Plaque cible de bloc.
   1. Retirez la solution de revêtement de la plaque, ou des deux plaques si une plaque de contrôle a été fabriquée, en inversant et en secouant sur un évier. Sécher sur des serviettes en papier.
   2. Ajouter 300 μL de tampon PB à chaque puits revêtu.
   3. Retirez le tampon PB comme à l’étape 4.2.1 et ajoutez 200 μL supplémentaires de tampon PB.
   4. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
3. Préparez la bibliothèque de phages.
   1. Décongelez la bibliothèque de phages sur de la glace et diluez-la à 100 fois la diversité de la bibliothèque dans PBS. Par exemple, si la diversité de la bibliothèque est de 1 x ¹⁰¹⁰ et que la concentration de la bibliothèque est de 1 x ¹⁰¹³, diluez la bibliothèque de sorte que la concentration soit de 1 x 1012. Pour les bibliothèques utilisées ici, diluez-les 10 fois dans PBS en combinant 1 mL de la bibliothèque avec 9 mL de PBS.
      REMARQUE : La diversité des bibliothèques aurait dû être déterminée lors de la création de la bibliothèque et ne peut pas être facilement évaluée autrement. La concentration de la bibliothèque peut être déterminée en inoculant des cellules d’E. coli en phase mi-logarithmique (_OD600 0,6 - 0,8) et en plaquant sur LB / carb.
   2. Ajouter 1/5 volume de PEG/NaCl. Par exemple, pour 10 mL de la bibliothèque précédemment diluée, ajoutez 2 mL de PEG/NaCl.
   3. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
   4. Centrifuger à 11 000 x g pendant 30 min à 4 °C, jeter le surnageant et le recentrifuge pendant 2 min pour tirer vers le bas le surnageant restant.
      REMARQUE: Placez le tube dans le rotor dans la même orientation la deuxième fois que c’était la première pour garder la pastille au même endroit, ce qui la rend plus facile à voir.
   5. Resuspendez doucement la pastille de phage dans 1 mL de PBT par protéine. Pour quatre protéines, remettez en suspension la pastille dans 4 mL de PBT.
      REMARQUE: Essayez de ne pas toucher la pastille et n’introduisez pas de bulles d’air.
4. Afficher le phage à la ou aux protéines cibles.
   1. Contrôle en option : Ajoutez 100 μL de bibliothèque de phages à chaque puits revêtu dans la plaque de contrôle. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min et transférer la bibliothèque de la plaque de commande à la plaque cible. Ignorez l’étape 4.4.2.
   2. Retirez le tampon PB de la plaque cible comme à l’étape 4.2.1 et ajoutez 100 μL de la bibliothèque de phages à chaque puits revêtu.
   3. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
5. Elute autour d’un phage.
   1. Retirez la bibliothèque de phages et lavez les puits enduits quatre fois avec un tampon PT. Inversez la plaque et tapotez sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes.
      REMARQUE: Si plusieurs protéines cibles sont recouvertes sur une plaque, essayez de minimiser le flux de toutes les solutions ultérieures entre les puits.
   2. Ajouter 100 μL de 0,1 M HCl à chaque puits revêtu et incuber à température ambiante pendant 5 min avec une secousse orbitale de 300 tr/min.
   3. Neutraliser le pH en ajoutant 12,5 μL de 1 M de Tris-HCl (pH 11) à chaque puits revêtu.
   4. Regrouper le phage élué des 8 puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pipette de haut en bas pendant le transfert pour rendre les solutions homogènes et aspirer tout le liquide des puits.
   5. Ajouter 10 % de BSA au phage élué groupé à une concentration finale de 1 %. Pour un volume d’élution rond typique de 950 μL, ajoutez 95 μL de 10 % de BSA. Conserver à 4 °C. Il s’agit de la sortie du premier tour.

5. Préparation des rondes de sélection suivantes

1. Préparer une culture de semences pour la culture de l’apport de phages pour le prochain tour de sélection comme à l’étape 3.1.
2. Enduire la plaque pour le troisième tour de sélection comme à l’étape 3.2 avec les changements notés ci-dessous.
   1. Ne recouvrez que quatre puits par protéine dans une plaque de liaison de 96 puits. Utilisez la moitié du contenu des tubes « ronds 2/3 » ou « ronds 4/5 » pour le tour approprié. Diluer le contenu de ces tubes au besoin, afin d’éviter que les protéines ne se déposent hors de la solution.
3. Préparez l’entrée de phage pour le prochain tour de sélection.
   1. Utilisez la moitié de la sortie de la première ronde de l’étape 4.5.5 pour inoculer 3 mL de cellules de phase à mi-log de l’étape 4.1. Pour une sortie ronde typique, inoculez avec 500 μL de la sortie.
   2. Incuber à 37 °C pendant 30 min avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
   3. Ajouter le phage auxiliaire M13K07 à une concentration finale de 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/mL.
   4. Incuber à 37 °C pendant 1 h avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
   5. Transférer la totalité des 3 mL de culture à 30 mL de 2YT/glucides/kan. Croître pendant la nuit à 37 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
   6. Le lendemain, transférer la culture dans un tube centrifuge de 50 mL et centrifuger à 11 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour précipiter les cellules.
   7. Décanter le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 mL et mélanger avec 8 mL de PEG/NaCl et incuber sur de la glace pendant 10 min.
   8. Centrifuger à 11 000 x g pendant 10 min à 4 °C, jeter le surnageant et centrifuger à nouveau pendant 2 min.
      REMARQUE: Placez le tube dans le rotor dans la même orientation la deuxième fois que c’était la première pour garder la pastille au même endroit, ce qui la rend plus facile à voir.
   9. Remettre en suspension la pastille de phage dans 800 μL de PBT afin qu’elle soit totalement homogène et qu’aucune touffe ne soit visible.
   10. Transférer la solution de phage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 16 200 x g pendant 4 min à 4 °C pour les débris de granulés.
   11. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Il s’agit de l’entrée pour le prochain tour de sélection.
4. Facultatif : Titez les solutions d’entrée et de sortie.
   1. Utiliser 500 μL d’une culture de graines d’E. coli pour inoculer 5 mL de 2YT/tet et incuber à 37 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min jusqu’à ce que la bactérie soit en phase médiane log (_OD600 0,6 - 0,8). Cela prend approximativement 1 h.
   2. Diluer les solutions d’entrée/sortie de phages à ^10-3-10-5 dans pbS et ajouter 10 μL de chaque dilution à 90 μL de cellules cultivées.
      REMARQUE: Utilisez immédiatement des solutions de phages diluées, car les phages s’adsorbent dans le tube au fil du temps et les transformations peuvent produire des faux négatifs.
   3. Incuber à 37 °C pendant 20 min avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
   4. Plaque 5 μL sur des plaques LB/carb séparées.
      REMARQUE: La quantité plaquée est variable dépend des résultats précédents / préférence personnelle.

6. Tours de sélection ultérieurs

1. Effectuez tous les tours suivants avec la préparation comme cela a été fait aux étapes 3 et 4, respectivement, avec les différences notées ci-dessous.
   1. Utilisez l’entrée produite lors du tour précédent comme source de phage au lieu d’une bibliothèque. Enduire 4 puits par protéine cible avec 100 μL de l’apport de phages acquis lors du tour précédent. Conserver les entrées de phages restantes à 4 °C.
   2. Rendez l’étape de lavage dans 4.5.1 plus stricte à chaque tour de sélection. Le premier tour nécessite un lavage 4 fois, le deuxième tour nécessite 6 fois, le troisième tour nécessite 8 fois et les tours quatre et cinq nécessitent tous deux un lavage 10 fois.
   3. Réduisez certains volumes par rapport à ceux utilisés dans la première ronde, car les rondes suivantes ne recouvrent que quatre puits au lieu de huit. Par exemple, à l’étape 4.5.5, seulement 45 μL de 10 % de BSA sont ajoutés à la sortie du phage, et à l’étape 5.3.1, seulement 250 μL de la sortie du phage sont utilisés pour inoculer les cellules.

7. Traitement post-sélection et isolation des phages

1. Titez les solutions d’entrée et de sortie pour les rondes quatre et cinq.
   1. Si ce n’est pas déjà fait à l’étape 5.4, suivez les mêmes étapes pour filtrer les sorties de phages quatre et cinq, produisant idéalement une gamme de 30 à 300 colonies sur quelques plaques.
2. Cultiver et isoler les phages.
   1. Aliquote 450 μL de 2YT/carb/M13K07 dans chaque tube d’une boîte de culture de 96 mini tubes.
   2. Choisissez des colonies bien isolées dans l’une des plaques à partir de l’étape 7.1 pour inoculer chaque tube.
      REMARQUE: Utilisez la moitié supérieure de la boîte pour les sorties rondes quatre et la moitié inférieure pour les sorties rondes cinq.
   3. Incuber toute la nuit à 37 °C avec une secousse orbitale de 200 tr/min.
   4. Centrifuger à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
   5. Transférez autant de surnageant que possible dans une nouvelle boîte de culture de 96 mini-tubes sans déranger la pastille cellulaire et jetez l’ancienne. Conserver à 4 °C.
   6. À partir de la nouvelle boîte, transférer 100 μL de chaque tube vers une plaque non contraignante de 96 puits contenant 100 μL de glycérol à 50% dans tous les puits. Bien mélanger et conserver à -80 °C comme stock de secours.

Results

Les liants produits à partir de l’affichage des phages peuvent être vérifiés et analysés de plusieurs façons. Il est recommandé de procéder d’abord au séquençage du phage avec des amorces qui flanquent l’insert diversifié dans la bibliothèque de phagémides. Une expérience d’affichage de phages idéale montrera un biais clair vers plusieurs séquences (Figure 1). D’autres séquences seront également présentes mais avec un nombre plus faible, apparaissant davantage comme bruit de fond. Dans l’exe...

Discussion

Comme mentionné à l’étape 2.1 (préparation des protéines), une variété de méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la concentration en protéines, et chacune aura des avantages et des inconvénients uniques en fonction de la protéine cible spécifique utilisée pour l’affichage des phages. Une source de descriptions détaillées et de protocoles pour les méthodes populaires a déjà été ^fournie11.

L’utilisation du phage retenu par un affichage de phages précédent comme entr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système de mini-tubes Axygen (0,65 ml, stérile, 96/rack, 10 racks/paquet)	Fisher Scientific	14-222-198	Culture des sorties de phages après l’affichage des phages.
BD Difco Milieu de culture déshydraté : LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Préparation des plaques pour le titrage.
Albumine sérique bovine (BSA), fraction V	BioShop Canada	ALB001	Composant tampon.
Sel disodique de carbenicilline 89,0-100,5 % anhydre	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culture de cellules infectées par des phagemides.
Agitateur de microplaques numérique compact	Fisher Scientific	11-676-337	Secouer les plaques pendant l’incubation avec la bibliothèque de phages.
Ruban d’étanchéité en aluminium pour microplaques Corning	Fisher Scientific	07-200-684	Scellement des stocks de glycérol de phage.
Gélose déshydratée	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Préparation des plaques pour le titrage.
DS-11 Spectrophotomètre/Fluorimètre	DeNovix	DS-11 FX+	Mesure de la concentration en protéines.
Greiner Bio-One CellStar 96 puits, non traité, à fond en forme de U Microplaque	Fisher Scientific	7000133	Stockage des stocks de glycérol de phage.
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144-500	Élution de phage.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chimiquement compétent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Souche bactérienne pour l’infection par les phages.
Sulfate de kanamycine	Fisher	Scientific AAJ1792406	Culture de cellules infectées par des phages auxiliaires M13K07.
M13KO7 Ophage auxiliaire	New England Biolabs	; N0315S	Permettre l’empaquetage et la sécrétion de phagemides.
MaxQ 4000 Agitateur orbital de paillasse	Fisher Scientific	11-676-076	Culture cellulaire bactérienne.
Nunc MaxiSorp 96 puits, fond plat	Life Technologies	44-2404-21	Protéines immobilisantes.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10X	Fisher Scientific	BP3994	Composant tampon/milieu de remise en suspension de phage.
Films polyester pour ELISA et incubation	VWR	60941-120	Couverture des microplaques pendant l’incubation.
Polyéthylène glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Précipitation des phages.
Chlorure de sodium	Millipore-Sigma	S3014	Précipitation des phages.
Tubes de culture en plastique stériles : Polypropylène translucide	Fisher Scientific	14-956-1D	Cultures d’entrées de phages.
Chlorhydrate de tétracycline	Fisher Scientific	BP912-100	Élevage de cellules E. coli OmniMax.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Solution de phage éluée neutralisante.
Poudre de tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2	Composant de milieu de croissance cellulaire.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Composant tampon.
Extrait de levure	Fisher Scientific	BP1422-2	Composant du milieu de croissance cellulaire.