Affaissement des virus de l’herpès simplex

Résumé

Le plaquage est une méthode de routine utilisée pour quantifier les virus vivants dans une population. Bien que le plaquage soit fréquemment enseigné dans divers programmes de microbiologie avec des bactéries et des bactériophages, l’affaissement des virus des mammifères est plus complexe et prend plus de temps. Ce protocole décrit les procédures qui fonctionnent de manière fiable pour le travail régulier avec les virus de l’herpès simplex.

Résumé

Il existe de nombreux protocoles publiés pour apposer les virus, y compris des références dans la littérature primaire pour la méthodologie. Cependant, l’affaissement des virus peut être difficile à effectuer, nécessitant de se concentrer sur ses spécifications et son raffinement. C’est une méthode incroyablement difficile à maîtriser pour les nouveaux étudiants, principalement parce qu’elle nécessite une attention méticuleuse aux détails les plus infimes. Cette démonstration d’affaissement des virus de l’herpès simplex devrait aider ceux qui ont eu du mal à visualiser la méthode, en particulier ses nuances, au fil des ans. Bien que ce manuscrit soit basé sur les mêmes principes de la méthodologie de plaquage standard, il diffère en ce qu’il contient une description détaillée de (1) la meilleure façon de manipuler les cellules hôtes pour éviter toute perturbation pendant le processus, (2) un milieu visqueux plus utile que l’agarose pour limiter la diffusion des virions, et (3) une procédure simple de fixation et de coloration qui produit des résultats reproductibles de manière fiable. En outre, la vidéo d’accompagnement aide à démontrer les distinctions les plus fines dans le processus, qui sont souvent manquées lors de l’instruction des autres sur la réalisation des tests de plaque.

Introduction

Les débuts des tests de plaque virale remontent aux premières découvertes de virus dans les années 18901. Le virus de la mosaïque du tabac a d’abord été isolé et transmis sur les feuilles de tabac, où des taches individuelles d’infection ont pu être reconnues et quantifiées comme provenant d’une seule entité virale ^vivante2, identifiée plus tard comme un ^virion2. Des études séminales ultérieures avec des bactéries et des bactériophages ont perfectionné les techniques utilisées pour plaquer ces virus, y compris les bactéries à la phase médiane de croissance logarithmique, la dilution en série d’éch....

Protocole

Toutes les procédures avec les cellules Vero et les herpèsvirus vivants ont été approuvées par le Comité de biosécurité institutionnelle de l’Université Towson. Un schéma généralisé de ces procédures est représenté à la figure 1.

1. Ensemencement des cellules Vero

1. La veille du début du test de la plaque, essayez les cellules Vero et remettez-les en suspension dans le milieu Modifié Eagles (DMEM) de Dulbecco et complétez selon la méthodologie de culture cellulaire ^standard19. Remettre en suspension les cellules trypsinisées dans 10 mL de DMEM par flacon T-75 des....

Résultats

Le tableau 1 montre une expérience qui a des résultats optimaux. Toutes les dilutions 10 fois suivent une diminution d’environ 10 fois du nombre de plaques. Ces types de données peuvent également être vus dans la figure 2, un test de plaque réel où le nombre dénombrable de plaques se situait entre 10 ^{et 4} pour les trois répliques. La même chose peut être vue à la figure 3, la rangée du haut, où le nombre dénombrable de plaques était d.......

Discussion

Bien que les tests de plaque soient presque aussi vieux que la culture cellulaire de mammifères elle-même, il semble que chaque laboratoire ait son propre ensemble de protocoles pour exécuter ce test de base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques 12 puits	Corning	3512
Plaques 6 puits	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotique/antimycosique	Gibco	15240096
Cristal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
PBS de Dulbecco (sans Mg++ ou Ca++)	Gibco	14190144
Sérum de veau fœtal	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Méthylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Agent quaternaire (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsine	Cytiva	SH30042.01
Vero cellules	ATCC	CCL-81