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Article de méthode

Affaissement des virus de l’herpès simplex

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DOI :

10.3791/62962

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5 novembre 2021

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1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le plaquage est une méthode de routine utilisée pour quantifier les virus vivants dans une population. Bien que le plaquage soit fréquemment enseigné dans divers programmes de microbiologie avec des bactéries et des bactériophages, l’affaissement des virus des mammifères est plus complexe et prend plus de temps. Ce protocole décrit les procédures qui fonctionnent de manière fiable pour le travail régulier avec les virus de l’herpès simplex.

Résumé

Il existe de nombreux protocoles publiés pour apposer les virus, y compris des références dans la littérature primaire pour la méthodologie. Cependant, l’affaissement des virus peut être difficile à effectuer, nécessitant de se concentrer sur ses spécifications et son raffinement. C’est une méthode incroyablement difficile à maîtriser pour les nouveaux étudiants, principalement parce qu’elle nécessite une attention méticuleuse aux détails les plus infimes. Cette démonstration d’affaissement des virus de l’herpès simplex devrait aider ceux qui ont eu du mal à visualiser la méthode, en particulier ses nuances, au fil des ans. Bien que ce manuscrit soit basé sur les mêmes principes de la méthodologie de plaquage standard, il diffère en ce qu’il contient une description détaillée de (1) la meilleure façon de manipuler les cellules hôtes pour éviter toute perturbation pendant le processus, (2) un milieu visqueux plus utile que l’agarose pour limiter la diffusion des virions, et (3) une procédure simple de fixation et de coloration qui produit des résultats reproductibles de manière fiable. En outre, la vidéo d’accompagnement aide à démontrer les distinctions les plus fines dans le processus, qui sont souvent manquées lors de l’instruction des autres sur la réalisation des tests de plaque.

Introduction

Les débuts des tests de plaque virale remontent aux premières découvertes de virus dans les années 18901. Le virus de la mosaïque du tabac a d’abord été isolé et transmis sur les feuilles de tabac, où des taches individuelles d’infection ont pu être reconnues et quantifiées comme provenant d’une seule entité virale vivante2, identifiée plus tard comme un virion2. Des études séminales ultérieures avec des bactéries et des bactériophages ont perfectionné les techniques utilisées pour plaquer ces virus, y compris les bactéries à la phase médiane de croissance logarithmique, la dilution en série d’échantillons de bactériophages et la gélose supérieure avec visualisation ultérieure de trous littéraux (plaques) dans la pelouse bactérienne3.

L’affaissement des virus animaux a pris du retard par rapport aux recherches passionnantes menées avec les bactériophages, principalement parce que les méthodes requises pour la culture de cellules de mammifères n’ont pas été développées avant les années 19404. Cependant, l’avènement de la croissance des cellules murines en l’absence de l’organisme hôte entier4 a engendré une nouvelle ère dans la capacité de cultiver et de compter les virus. Ces travaux ont été étendus pour la propagation et la quantification du virus de l’encéphalomyélite équine occidentale dans les cellules de poulet et du poliovirus dans les cellules humaines5,6. Au fur et à mesure que le domaine des cellules de mammifères cultivables s’est élargi, la multitude de cellules hôtes différentes pour diverses infections virales a donné au monde une corne d’abondance de possibilités d’étudier toutes sortes de virus7. Cela comprenait la propagation et la quantification des herpèsvirus humains, en particulier les virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1) et -2 (HSV-2), qui causent des lésions muco-cutanées8. Il est important de noter que tous les tests de plaque dépendent de l’existence de virions vivants, qui peuvent pénétrer dans les cellules hôtes de manière médiée par les récepteurs dans un échantillon9. Indépendamment de l’omniprésence et de la multitude de publications sur l’exécution des tests de plaque5,10,11,12,13,14,15,16, ces méthodes pour HSV-1/-2 sont un mélange d’art et de science; on ne peut pas effectuer le test sans une attention appropriée à chaque détail du protocole, ni exécuter un test réussi sans un œil crticial pour la subtilité dans le processus. Ce manuscrit décrit l’une des méthodes les plus reproductibles pour les tests de plaque HSV-1/-2, avec des détails précis sur l’art du test qui sont rarement discutés.

Ce protocole actuel permet d’obtenir de manière fiable le nombre d’unités formant de la plaque vivante (PFU) pour le HSV-1 et le -2. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide de cellules Vero (cellules épithéliales rénal de singe vert africain transformées) à faible passage (sous le numéro de passage 155) et couramment cultivées en alpha-MEM17 complété par 10% de sérum de veau fœtal (FCS), L-alanyl-L-glutamine et un mélange antibiotique/antimycotique18. Les cellules Vero sont propagées de manière standard dans ce milieu deux à trois fois par semaine à une dilution de 1/5 à chaque fois.

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Protocole

Toutes les procédures avec les cellules Vero et les herpèsvirus vivants ont été approuvées par le Comité de biosécurité institutionnelle de l’Université Towson. Un schéma généralisé de ces procédures est représenté à la figure 1.

1. Ensemencement des cellules Vero

  1. La veille du début du test de la plaque, essayez les cellules Vero et remettez-les en suspension dans le milieu Modifié Eagles (DMEM) de Dulbecco et complétez selon la méthodologie de culture cellulaire standard19. Remettre en suspension les cellules trypsinisées dans 10 mL de DMEM par flacon T-75 des cellules Vero confluentes (~107 cellules).
    REMARQUE: Le DMEM est utilisé pour les tests de plaque au lieu de l’alpha-MEM car il ralentit légèrement le taux de croissance cellulaire et favorise de meilleurs résultats de dosage de la plaque.
  2. Compter les cellules selon la méthode préférée (p. ex., un hémocytomètre standard avec exclusion de Trypan Blue)19.
  3. Ensemencer les cellules à 4 x 106 cellules/plaque; pour le HSV-2, utiliser des plaques à 6 puits avec 2,5 mL de DMEM (avec suppléments) par puits; et pour le HSV-1, utiliser des plaques de 12 puits avec 1,25 mL de DMEM (avec suppléments) par puits.
    REMARQUE: Le nombre de cellules doit être constant quelle que soit la plaque utilisée, bien que la taille des puits soit importante pour la précision du dosage de la plaque. Il est essentiel d’obtenir des cellules réparties uniformément, ce qui peut être accompli plus efficacement en déplaçant la plaque d’avant en arrière, et non de manière circulaire.
  4. Laisser les cellules se développer pendant la nuit à 37 °C/5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
    REMARQUE: L’humidité est maintenue avec une casserole d’eau distillée contenant un algicide dans le fond de l’incubateur.

2. Dilution de l’échantillon

  1. Terminer la dilution de l’échantillon et l’ajout de virus aux cellules en une seule séance de laboratoire.
    ATTENTION : Les HSV-1 et -2 sont infectieux pour les humains et doivent être manipulés sous un confinement approprié de biosécurité (BSL-2). Conservez tous les matériaux qui entrent en contact avec le virus séparément et désinfectez-les avec un agent quaternaire à une dilution de 1/256 (voir tableau des matériaux), de l’iodophore, de l’eau de Javel ou un détergent ionique fort (p. ex. FDS) avant de les retirer de l’armoire de biosécurité.
  2. Le lendemain de l’ensemencement des cellules Vero, diluer en série chaque échantillon de virus à plaquer dans 1x PBS; utilisez généralement des dilutions 10 fois pour un suivi plus précis.
  3. Faites ces dilutions par 10-4 (pour les faibles concentrations de virus) ou par 10-9 (pour les attentes d’échantillons de titre plus élevé) avec au moins 1 mL de chaque échantillon restant pour le dosage de la plaque elle-même.
  4. Conservez toutes les dilutions virales sur de la glace (pas plus de 1 h) jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à ajouter ces échantillons de virus dilués aux cellules.

3. Ajout de virus aux cellules

  1. Retirer le milieu de culture cellulaire d’un ou deux puits à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE: N’utilisez pas d’aspirateur car il élimine trop de liquide de la monocouche cellulaire et assèche les cellules. Une considération cruciale est de s’assurer que la monocouche cellulaire reste hydratée tout au long de l’expérience. Si les cellules se dessèchent, elles lavent la plaque dans la dernière étape et génèrent des données inutilisables. Par conséquent, ne traitez qu’un ou deux puits à la fois pour réduire cette possibilité.
  2. Ajouter soigneusement l’échantillon de virus dilué (100-400 μL et 50-200 μL d’échantillon de virus sont utilisés pour les plaques de 6 puits et 12 puits, respectivement) goutte à goutte à chaque monocouche, en ajoutant les gouttes sur le côté de chaque puits. Répétez le processus pour un ou deux puits jusqu’à ce que toute la plaque soit remplie avec les échantillons de virus en cours de plaque.
    REMARQUE: L’ajout des gouttes au centre du puits peut par inadvertance éliminer les cellules du substrat.
  3. Bercez doucement toute la plaque à la main pour vous assurer que le PBS qui contient le virus recouvre toute la monocouche de cellules dans chaque puits, puis placez la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pour permettre au virus de s’adsorber.
  4. Toutes les 10 minutes en 1 h, retirez la plaque de l’incubateur, secouez-la doucement à nouveau pour propager le virus plus uniformément dans chaque puits, puis replacez-la dans l’incubateur.
    NOTE: Chaque expérience dictera le nombre de répétitions et les dilutions utilisées; la préférence du lecteur dicte cette décision.
  5. Pour diminuer la possibilité de compter par inadvertance l’inoculum non absorbé, retirez l’échantillon de virus des puits avec des embouts de pipette de 1000 μL et placez-le dans un bécher à déchets.
    REMARQUE: Encore une fois, cette procédure est effectuée avec seulement un ou deux puits à la fois pour maintenir l’hydratation de la monocouche cellulaire.
  6. Placer 2,5 mL d’une superposition de méthylcellulose (dissoudre 5 % de méthylcellulose p/p dans 100 mL de PBS, autoclaver pendant 15 min à 121 °C et 15 psi sur un cycle liquide, puis ajouter 375 mL de DMEM plus 25 mL de FBS).
  7. Une fois qu’une plaque entière contient une superposition, replacez la plaque dans l’incubateur pour permettre la croissance pendant deux jours.
    REMARQUE: Si le virus et les cellules sont autorisés à se développer pendant trois jours, même dans le DMEM plus les suppléments, une perte substantielle de cellules dans la monocouche peut en résulter, compromettant ainsi les données finales.
  8. Désinfectez le bécher à déchets, généralement avec l’ajout d’eau de Javel, d’un iodophore ou d’un virucide similaire, avant de le retirer de l’armoire de biosécurité.

4. Coloration des plaques

  1. Après l’incubation de deux jours, retirez la couche de méthylcellulose par une pipette, encore une fois un ou deux puits à la fois, et placez-la dans un bécher à déchets.
  2. Ajouter ~2 mL de violet cristallin à 1 % (voir tableau des matériaux) dans 50 % d’éthanol à chaque puits pour tacher les plaques.
    REMARQUE: Il n’est pas essentiel de supprimer chaque goutte de la superposition.
  3. Incuber la plaque avec tous les puits remplis de la tache pendant 30 min à 37 °C. À ce stade, désinfectez le bécher à déchets comme ci-dessus à l’étape 3.8.
  4. Lavez vigoureusement les assiettes à l’eau du robinet jusqu’à ce que le ruissellement soit clair.
    REMARQUE: Un doux jet d’eau n’est pas assez vigoureux; la pression maximale d’un appareil d’évier de laboratoire est requise.
  5. À ce stade, assurez-vous qu’il y a environ 10 fois plus de différences dans le nombre de plaques dans chaque série de dilution.
  6. Laissez les plaques sécher pendant la nuit à l’envers, après quoi les plaques individuelles peuvent être comptées.

5. Compter les plaques et déterminer le titre du virus

  1. Quelle que soit l’approche (voir note ci-dessous), multipliez le nombre de plaques par le facteur de dilution (par exemple, si les plaques étaient comptées dans le puits 10-4, le nombre de plaques serait multiplié par 104).
    REMARQUE: Bien que le comptage dans une plage de 10 à 100 plaques soit utile5, le comptage des puits avec 30 à 300 plaques est un peu plus fiable et prend en compte environ 1/2 log dilutions au lieu de dilutions complètes.
  2. Divisez ce nombre par le volume d’inoculum (comme ci-dessus à l’étape 3.2) et faites la moyenne de tous les puits qui ont des plaques dans la plage indiquée pour obtenir le titre le plus précis de HSV dans l’échantillon original.
  3. Effectuer les calculs des étapes 5.3.1 à 5.3.5, en tenant compte de l’utilisation de données fictives dans le tableau 1.
    1. Ne considérez que les puits avec 30 à 300 plaques (étape 5.1). Par conséquent, dans le tableau 1, utilisez uniquement la colonne 10-5 pour les répliques 1, 2 et 3.
    2. Prenez le nombre de plaques à la dilution donnée et multipliez par la réciproque du facteur de dilution. Par conséquent, la colonne 10-5 de l’échantillon 1 va de 81 plaques à la dilution 10-5 à 81 plaques fois 105.
    3. Divisez ensuite ce nombre par le volume (en mL) de la dilution virale ajoutée aux cellules de ce puits. En supposant que les données sur le HSV-1 du tableau 1 proviennent d’une plaque de 12 puits, 0,2 mL serait la mesure la plus appropriée. Par conséquent, le calcul de l’étape 5.3.2 devient 81 x 105 divisé par 0,2 mL, ou 4,0 x 107 PFU / mL de HSV-1.
    4. Répétez ce processus pour toutes les données utiles et la moyenne. Par conséquent, effectuez le calcul en 5.3.2-5.3.3 sur tous les échantillons de la colonne 10-5 , en supposant qu’ils proviennent du même échantillon de virus et que les répliques biologiques ont été effectuées pour obtenir la mesure de titre la plus précise. Dans le cas du tableau 1, une moyenne de 4,0 x 107, 2,1 x 107 et 2,6 x 107 PFU/mL pour obtenir un titre moyen final de 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/mL pour cet échantillon.

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Résultats

Le tableau 1 montre une expérience qui a des résultats optimaux. Toutes les dilutions 10 fois suivent une diminution d’environ 10 fois du nombre de plaques. Ces types de données peuvent également être vus dans la figure 2, un test de plaque réel où le nombre dénombrable de plaques se situait entre 10 et 4 pour les trois répliques. La même chose peut être vue à la figure 3, la rangée du haut, où le nombre dénombrable de plaques était d...

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Discussion

Bien que les tests de plaque soient presque aussi vieux que la culture cellulaire de mammifères elle-même, il semble que chaque laboratoire ait son propre ensemble de protocoles pour exécuter ce test de base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions les innombrables étudiants de nos laboratoires (PJD et BJM) qui ont travaillé avec nous au fil des ans pour affiner ces méthodes. Un merci spécial à Stan Person, sous la tutelle duquel cette méthodologie a été développée pour la première fois. Ce travail a été partiellement soutenu par le Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund et NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 12 puitsCorning3512
Plaques 6 puitsCorning3516
Alpha-MEMLonza12169F
Antibiotique/antimycosiqueGibco15240096
Cristal violetAlfa AesarB2193214
DMEMGibco11965092
PBS de Dulbecco (sans Mg++ ou Ca++)Gibco14190144
Sérum de veau fœtalMillipore-SigmaTMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)GibcoGS07F161BA
HemacytometerThermo Fisher02-671-54
MéthylcelluloseMillipore-Sigma27-441-0
Agent quaternaire (Lysol I.C.)Thermo FisherNC9645698
Trypan BlueCorning25900CI
TrypsineCytivaSH30042.01
Vero cellulesATCCCCL-81

Références

  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
  3. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  4. Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
  5. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  6. Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
  7. Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
  8. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
  9. Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).
  10. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
  11. Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
  12. Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
  13. Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
  14. Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
  15. Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
  16. Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
  17. Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
  18. Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).
  19. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
  21. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).
  22. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63(2006).
  23. Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201(2016).
  24. Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
  25. Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
  26. Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
  27. Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
  28. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  29. Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
  30. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  31. Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
  32. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
  33. Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
  34. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
  35. Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
  36. Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).

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