Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

Ruby Boateng; Nathaniel Boechat; Philipp P. Henrich; Ewelina Bolcun-Filas

doi:10.3791/62972

Article de méthode

Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

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DOI :

10.3791/62972

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3 septembre 2021

Ruby Boateng¹ , Nathaniel Boechat¹ , Philipp P. Henrich¹ , Ewelina Bolcun-Filas¹

¹The Jackson Laboratory

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l’imagerie d’ovaires entiers pour des analyses quantitatives et qualitatives utilisant l’immunocoloration à montage entier, la microscopie multiphotonique et la visualisation et l’analyse 3D. Ce protocole prend en charge un traitement à haut débit, fiable et reproductible applicable à la toxicologie, au diagnostic clinique et aux tests génomiques de la fonction ovarienne.

Résumé

La fertilité féminine et la durée de vie reproductive dépendent de la qualité et de la quantité de la réserve d’ovocytes ovariens. On estime que 80% des cellules germinales femelles entrant dans la prophase méiotique I sont éliminées pendant l’attrition ovocytaire fœtale (FOA) et la première semaine de vie postnatale. Trois mécanismes majeurs régulent le nombre d’ovocytes qui survivent pendant le développement et établissent la réserve ovarienne chez les femmes entrant dans la puberté. Dans la première vague de perte d’ovocytes, 30 à 50% des ovocytes sont éliminés au début de la FOA, un phénomène attribué à une expression élevée de l’élément nucléaire intercalaire long (LINE-1). La deuxième vague de perte d’ovocytes est l’élimination des ovocytes présentant des défauts méiotiques par un point de contrôle de qualité méiotique. La troisième vague de perte d’ovocytes se produit périnatalement lors de la formation de follicules primordiaux lorsque certains ovocytes ne parviennent pas à former des follicules. On ne sait toujours pas ce qui régule chacune de ces trois vagues de perte d’ovocytes et comment elles façonnent la réserve ovarienne chez la souris ou l’homme.

L’immunofluorescence et la visualisation 3D ont ouvert une nouvelle voie pour imager et analyser le développement des ovocytes dans le contexte de l’ensemble de l’ovaire plutôt que dans des sections 2D moins informatives. Cet article fournit un protocole complet pour l’immunocoloration des ovaires entiers et le nettoyage optique, produisant des préparations pour l’imagerie à l’aide de la microscopie multiphotonique et de la modélisation 3D à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce. Il montre comment cette méthode peut être utilisée pour montrer la dynamique de l’attrition ovocytaire au cours du développement ovarien chez les souris C57BL / 6J et quantifier la perte d’ovocytes au cours des trois vagues d’élimination des ovocytes. Ce protocole peut être appliqué aux ovaires prénataux et postnatals précoces pour la visualisation et la quantification des ovocytes, ainsi qu’à d’autres approches quantitatives. Il est important de noter que le protocole a été stratégiquement développé pour permettre un traitement à haut débit, fiable et reproductible qui peut répondre aux besoins en toxicologie, en diagnostic clinique et en tests génomiques de la fonction ovarienne.

Introduction

La plupart des femelles mammifères naissent avec un nombre fini d’ovocytes arrêtés méiotiquement stockés dans des follicules primordiaux, constituant la réserve ovarienne (RC)^1,2. La RO détermine la durée de vie reproductive globale et la santé des femmes³. La salle d’opération diminue normalement en taille avec le vieillissement et peut être épuisée prématurément lors de l’exposition à certains agents génotoxiques (radiothérapie / chimiothérapie) et à des stress environnementaux (malnutrition), conduisant à l’infertilité ^4,5,6<....