Article de méthode

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

DOI :

10.3791/62977

⸱

7 décembre 2021

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les photorécepteurs de bâtonnets sont des neurones sensoriels hautement polarisés avec des compartiments distincts. Les bâtonnets de souris sont longs (~80 μm) et minces (~2 μm) et sont emballés latéralement dans la couche la plus externe de la rétine, la couche photoréceptrice, ce qui entraîne l’alignement de compartiments subcellulaires analogues. Traditionnellement, la section tangentielle de la rétine plate gelée a été utilisée pour étudier le mouvement et la localisation des protéines dans différents compartiments de tiges. Cependant, la courbure élevée de la rétine de souris à dominante bâtonnet rend la section tangentielle difficile. Motivés par l’étude du transport des protéines entre les compartiments, nous avons développé deux méthodes de peeling qui isolent de manière fiable le segment externe de la tige (ROS) et d’autres compartiments subcellulaires pour les transferts occidentaux. Nos techniques relativement rapides et simples fournissent des fractions enrichies et spécifiques aux subcellulaires pour mesurer quantitativement la distribution et la redistribution de protéines photoréceptrices importantes dans des bâtonnets normaux. De plus, ces techniques d’isolement peuvent également être facilement adaptées pour isoler et étudier quantitativement la composition protéique d’autres couches cellulaires dans la rétine saine et dégénérée.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules photoréceptrices en bâtonnets, étroitement emballées dans la couche la plus externe de la rétine neurale, font partie intégrante de la vision en basse lumière. Pour fonctionner comme des compteurs de photons fidèles, les bâtonnets utilisent une voie de signalisation à base de protéine G, appelée phototransduction, pour générer des réponses rapides, amplifiées et reproductibles à la capture de photons uniques. Cette réponse à la lumière déclenche finalement un changement du courant au niveau de la membrane plasmique et est ensuite signalée au reste du système visuel1. Comme leur nom l’indique, chaque cellule de bâtonnet a une forme distincte en forme de bâtonnet et présente une morphologie cellulaire hautement polarisée, composée d’un segment externe (OS), d’un segment interne (IS), d’un corps cellulaire (CB) et d’un terminal synaptique (ST). Chaque compartiment subcellulaire a une machinerie protéique spécifique (liée à la membrane et soluble), des caractéristiques biomoléculaires et des complexes protéiques qui jouent des rôles cruciaux tels que la phototransduction visuelle, l’entretien ménager général et la synthèse des protéines, et la transmission synaptique2,3.

Il y a plus de 30 ans, le mouvement réciproque dépendant de la lumière des protéines subcellulaires, en particulier la transducine (loin de l’OS) et l’arrestine (vers l’OS), a été observé pour la première fois4,5,6,7. Très tôt, ce phénomène observé a été accueilli avec scepticisme, en partie à cause de la vulnérabilité de l’immunohistochimie au masquage de l’épitope8. Au début des années 2000, la translocation des protéines dépendantes des stimuli a été confirmée à l’aide d’une technique de sectionnement physique rigoureuse et ardue9. La section tangentielle en série de la rétine de rongeurs congelée montée à plat, suivie d’une immunobuvardage, a révélé que la transducine9,10, l’arrestine11,12 et la recoverine13 subissent toutes une redistribution subcellulaire en réponse à la lumière. On pense que la translocation par la lumière de ces protéines de signalisation clés régule non seulement la sensibilité de la cascade de phototransduction9,14,15, mais peut également être neuroprotectrice contre les dommages causés par la lumière16,17,18. Parce que le transport des protéines entraîné par la lumière dans les bâtonnets semble être très important pour la biologie et la physiologie des cellules des bâtonnets, les techniques qui permettent l’isolement de différents compartiments subcellulaires pour déterminer la distribution des protéines sont des outils de recherche précieux.

Actuellement, il existe quelques méthodes visant à isoler les compartiments subcellulaires des tiges. Cependant, ces méthodes peuvent être longues et difficiles à reproduire, ou nécessiter une quantité importante d’isolat rétinien. Les préparations de segment externe de tige (ROS) par centrifugation par gradient de densité19, par exemple, sont couramment utilisées pour séparer les ROS de l’homogénat rétinien. Cette méthode est largement utilisée pour le transfert western, mais la procédure prend beaucoup de temps et nécessite un minimum de 8 à 12 rétines murines20. D’autre part, la section tangentielle en série de la rétine murine et ratie congelée a été mise en œuvre avec succès pour isoler le système d’exploitation, l’IS, le CB et le ST9,11,13. Cependant, cette méthode est techniquement difficile en raison de la nécessité d’aplatir complètement la petite rétine murine très incurvée pour aligner les couches rétiniennes avant la section tangentielle. Puisqu’il existe une pléthore de modèles murins et de souris transgéniques récapitulant les maladies du système visuel, la création d’une technique qui sépare de manière fiable, rapide et facile les compartiments individuels des tiges est prometteuse en révélant les processus physiologiques qui se produisent dans chaque compartiment spécialisé et les mécanismes qui sous-tendent les processus visuels de santé et de maladie.

Pour faciliter ces recherches, nous décrivons deux méthodes de peeling qui isolent les compartiments subcellulaires des bâtonnets plus facilement que les protocoles actuels. La première méthode de peeling, adaptée d’une technique d’exposition de cellules bipolaires marquées par fluorescence pour l’enregistrement de la pince de patch21, utilise du papier filtre de cellulose pour éliminer séquentiellement le ROS d’une rétine murine vivante et isolée (Figure 1). La deuxième méthode, adaptée d’une procédure qui isole les trois couches primaires de cellules rétiniennes d’une rétine de poussin22 et de grenouille23, utilise du ruban adhésif pour enlever le ROS et le segment interne de la tige (RIS) d’une rétine lyophilisée (Figure 2). Les deux procédures peuvent être complétées en 1 h et sont considérablement conviviales. Nous fournissons une validation de l’efficacité de ces deux protocoles de séparation pour le transfert western en utilisant des rétines adaptées à l’obscurité et exposées à la lumière de souris C57BL / 6J pour démontrer la translocation induite par la lumière de la transducine en bâtonnet (GNAT1) et de l’arrestine (ARR1). De plus, en utilisant la méthode du peeling sur bande, nous fournissons des preuves supplémentaires que notre technique peut être utilisée pour examiner et corriger les incohérences entre les données de localisation des protéines acquises par l’immunocytochimie (ICC) et les transferts de Western. Plus précisément, notre technique a montré que: 1) l’isoforme de la protéine kinase C-alpha (PKCα) est présente non seulement dans les cellules bipolaires, mais aussi dans les ROS et RIS murins, bien qu’à de faibles concentrations24,25 et 2) la rhodopsine kinase (GRK1) est présente principalement dans l’échantillon isolé de SG. Ces données démontrent l’efficacité de nos deux techniques de peeling pour séparer et quantifier des protéines spécifiques de bâtonnets et de rétine.

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Protocole

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Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles locales du comité de recherche sur les soins aux animaux de l’Université de Californie du Sud (USC).

1. Méthode de peeling de la rétine à cellules vivantes

  1. Préparation des tampons d’Ames, des papiers à peler et du plat de dissection
    1. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou d’un type de ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cellulose (grade 413) en rectangles mesurant environ 5 mm x 2,5 mm. Conservez les boutures pour une utilisation ultérieure.
    2. Préparer 1 L de tampon HEPES d’Ames en combinant une bouteille de Ames' Medium, 2,38 g de HEPES et 0,877 g de NaCl. Dissoudre les réactifs dans une bouteille en verre stérile avec de l’eau ultrapure distillée et ajuster l’osmolarité et le pH à 280 mOsm et 7,4, respectivement. Filtrer pour stériliser (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
    3. Préparer 1 L de tampon de bicarbonate d’Ames en combinant une bouteille de Ames' Medium et 1,9 g de NaHCO3. Dissoudre les réactifs dans une bouteille en verre stérile avec de l’eau ultrapure distillée et ajuster l’osmolarité et le pH à 280 mOsm et 7,4, respectivement. Filtrer pour stériliser (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Les tampons HEPES et bicarbonate d’Ames peuvent être préparés à l’avance et stockés pendant 1 semaine à 4 ° C.
    4. Au fond d’une boîte de Petri de 35 x 10 mm, créez un motif en treillis ou en damier avec un scalpel (lame n° 11, 40 mm).
      REMARQUE: Le fond texturé de la boîte de Petri maintient l’œil isolé et flottant en place pendant la dissection rétinienne.
  2. Dissection de la rétine
    REMARQUE: Pour cette procédure, le tampon doit être amené et conservé à température ambiante (RT). Rafraîchissez le tampon de bicarbonate d’Ames toutes les 15 minutes avec le tampon de bicarbonate d’Ames fraîchement carbogéné pendant la dissection. Cela maintient le pH physiologique nécessaire.
    1. Environ 15 à 20 minutes avant la dissection, oxygéner le tampon HEPES d’Ames dans un laboratoire ou une bouteille de média de 100 mL équipé d’un adaptateur de bouchon de tube et faire bouillonner le tampon bicarbonate d’Ames avec 95% d’O2 et 5% de CO2 dans une chambre d’incubation tissulaire et dans un laboratoire ou un flacon de média de 100 mL équipé d’un adaptateur de bouchon de tuyau.
    2. Euthanasier un nombre égal des deux sexes de souris C57BL/6J (âgées de 2 à 3 mois) soit par inhalation d’isoflurane, soit par dioxyde de carbone (CO2) suivie d’une luxation cervicale. Énucléez les yeux avec des ciseaux incurvés et placez les yeux dans la boîte de Petri texturée de 35 x 10 mm remplie de tampon de bicarbonate d’Ames à bulles.
    3. Créer une coupe oculaire (Figure 1A) en perforant un trou à la jonction cornée-limbe avec une aiguille de 18 G. Couper le long du périmètre de cette jonction à l’aide de ciseaux à iris à micro-dissection pour enlever la cornée de chaque œil. Séparez la lentille et l’humeur vitrée de chaque œil à l’aide d’une pince à épiler et jetez-la.
    4. Isolez la rétine de la coupe oculaire en pelant soigneusement le complexe épithélium pigmenté rétinien (EPR),scléro-choroïde loin de la rétine neurale. Jetez le complexe RPE-scléro-choroïde. Assurez-vous que la rétine n’est pas endommagée pendant la dissection en ne manipulant que les bords.
    5. Transférer la rétine isolée à l’aide d’une pipette de transfert à large alésage dans le couvercle d’un plat de 60 x 15 mm rempli de tampon de bicarbonate d’Ames à bulles.
    6. Orientez la rétine en forme d’hémisphère concave vers le haut (les photorécepteurs sont orientés vers le bas vers le bas de la boîte) et coupez en deux chaque rétine (à travers le nerf optique) à l’aide de ciseaux à iris ou d’un scalpel (lame n ° 10, 40 mm). Ajustez les bords incurvés de chaque demi-rétine pour obtenir deux rectangles (Figure 1A).
      REMARQUE: Minimiser la courbure de chaque rétine coupée en deux permet à la rétine de mieux s’aplatir lors des étapes de peeling suivantes et produit un peeling précis de la couche du segment externe de la tige (ROS).
    7. Conservez la rétine coupée en deux dans la chambre d’incubation tissulaire qui est continuellement bouillonnée de 95% d’O2 et de 5% de CO2.
      REMARQUE: Les rétines isolées peuvent être conservées dans le tampon de bicarbonate d’Ames carbogenré pendant environ 24 h.
  3. Collecte du segment extérieur de la tige (ROS) par épluchage de papier filtre
    REMARQUE: Rafraîchissez le tampon HEPES d’Ames oxygéné RT toutes les 15-20 minutes pendant le processus de peeling pour maintenir le pH physiologique nécessaire.
    1. Transférez un rectangle rétinien de la chambre tissulaire avec une pipette de transfert à large alésage et un morceau de papier filtre de 5 mm x 2,5 mm dans une boîte de Petri de 35 x 10 mm remplie de tampon HEPES d’Ames bouillonné de 100% O2.
    2. Orientez la rétine cloisonnée concave vers le haut et assurez-vous que les photorécepteurs sont orientés vers le bas vers le bas de la boîte. Saisissez légèrement les côtés de la rétine coupée en deux avec une pince à épiler et déplacez-la sur le papier filtre. Une fois que la rétine est centrée sur le papier filtre, déplacez le papier filtre vers le haut afin que la rétine coupée en deux touche le papier filtre pour créer l’adhérence ROS-papier filtre (Figure 1B).
      REMARQUE: Assurez-vous que la couche de photorécepteur entre en contact direct avec le papier filtre.
    3. Soulevez délicatement le papier filtre avec la rétine attachée hors du tampon HEPES d’Ames. Placez la face inférieure du papier filtre (le côté sans la rétine) sur une serviette en papier et tamponnez 2 à 3 fois pour sécher (Figure 1B).
    4. Ajoutez une goutte de HEPES d’Ames sur le côté du papier filtre avec la rétine. Placez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout pour le sécher, comme décrit ci-dessus. Répétez ce processus deux fois de plus.
    5. Replacez le papier filtre avec la rétine dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pince à épiler, poussez doucement tous les bords de la rétine coupée en deux vers le haut et loin du papier filtre de tous les côtés.
    6. Détachez délicatement la rétine du papier filtre. Ne touchez que le périmètre extrême de la rétine pendant le processus de peeling pour préserver l’intégrité structurelle de la rétine.
    7. Soulevez le papier filtre de la boîte de Pétri et retirez l’excès de liquide sur une serviette en papier. Assurez-vous que le côté qui était en contact avec la rétine n’entre pas en contact avec l’essuie-tout.
    8. Placez le papier filtre avec la couche ROS partielle dans un tube étiqueté sur de la glace (Figure 1B). Gardez la rétine pelée immergée dans le tampon HEPES d’Ames.
    9. Répétez le processus de peeling pour cette rétine coupée en deux environ 7 à 8 fois pour enlever toute la couche ros. Après chaque peeling, placez le papier filtre dans le même tube, qui contiendra le ROS isolé d’une rétine coupée en deux.
      REMARQUE: Veillez à ne pas déchirer la rétine coupée en deux lorsque vous la retirez du papier filtre, car la rétine devient plus mince au cours de ce processus.
    10. Placer le tube contenant tous les épluches de papier filtre du ROS isolé sur de la glace pour une utilisation immédiate ou congeler directement sur de la glace sèche et conserver à -80 °C.
    11. Utilisez une pince à épiler pour transférer les restes de rétine pelée (dépourvus de ROS) dans un tube étiqueté de manière appropriée. Placez le tube sur de la glace pour une utilisation immédiate ou congelez-le avec de la glace carbonique et conservez-le à -80 °C.
    12. Répétez le processus de peeling pour chaque rétine coupée en deux et étiquetez avec précision chaque tube.

2. Méthode de peeling de la rétine lyophilisée

  1. Tampons, milieu pelant, préparation du plat de dissection et installation du lyophilisateur
    1. Dans une bouteille de stockage de 1 L, préparez la solution de Ringer en ajoutant 500 ml d’eau distillée ultrapure. Dissoudre les réactifs pour atteindre une concentration finale de 130 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 0,02 mM d’EDTA. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH, ajoutez de l’eau ultrapure pour porter le volume final à 1 L et ajustez l’osmolarité à 313 mOsm.
    2. Avant l’utilisation, filtrer la solution de Ringer avec un filtre stérile (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
    3. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou de type ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cellulose en rectangles mesurant environ 5 mm x 2,5 mm. Utilisez un crayon pour écrire sur un côté du papier filtre afin de créer une étiquette unique.
    4. Créez un motif en treillis ou en damier dans le fond d’une boîte de Petri de 35 x 10 mm à l’aide d’un scalpel (lame n° 11, 40 mm).
    5. Allumez le lyophilisateur selon les spécifications du fabricant.
    6. Acquérir de l’azote liquide dans une fiole Dewar ou une fiole sous vide isolante similaire.
  2. Dissection rétinienne
    1. Effectuer la dissection rétinienne comme décrit à la rubrique 1 du protocole (Figure 1A). Utilisez la solution froide de Ringer au lieu du tampon d’Ames.
    2. Après la dissection, stocker la rétine rectangulaire coupée en deux dans une boîte de Petri de 35 x 10 mm remplie de solution froide de Ringer et placer sur de la glace.
  3. Préparation d’échantillons rétiniens pour la lyophilisation
    1. Placez un morceau de papier filtre de 5 x 2,5 mm et transférez une rétine coupée en deux dans la boîte de Petri texturée de 35 x 10 mm remplie de tampon froid de Ringer. Utilisez une pipette de transfert à large alésage pour déplacer chaque rétine entre les plats.
    2. Utilisez une pince à épiler pour retourner soigneusement la rétine afin qu’elle soit orientée concave vers le haut (les photorécepteurs pointent vers le haut) et déplacez-la pour qu’elle repose sur le papier filtre (Figure 2A).
      REMARQUE: Assurez-vous que les photorécepteurs n’entrent pas en contact avec le papier filtre (la couche de cellules ganglionnaires rétiniennes doit être en contact direct avec le papier filtre) et que l’étiquette unique est visible. Pour identifier facilement et rapidement l’isolat rétinien, il est recommandé que l’étiquette unique soit située sur la face inférieure du papier filtre.
    3. Soulevez le papier filtre par les bords vers le haut afin que le morceau de rétine coupé en deux touche le papier filtre et continuez à soulever le papier filtre hors de la solution de Ringer.
    4. Placez la face inférieure du papier filtre (le côté sans la rétine dessus) sur une serviette en papier et tamponnez soigneusement 2 à 3 fois pour éliminer l’excès de liquide (Figure 2A).
    5. Prenez le papier filtre avec une pince à épiler et ajoutez une goutte de Ringer froid sur le côté du papier filtre avec la rétine. Placez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide. Répétez le processus deux fois de plus.
      REMARQUE: Ces étapes alternées de mouillage et de séchage garantissent que le tissu est fermement attaché au papier filtre.
    6. Conservez chaque échantillon de rétine/papier filtre adhérent dans une boîte de Petri remplie de Ringer froids jusqu’à ce qu’ils soient prêts à congeler tous les échantillons. Répétez ce processus pour toutes les rétines réduites de moitié.
    7. Obtenez une boîte de Petri propre et sèche de 35 x 10 mm (en bas seulement) et un morceau de papier d’aluminium coupé dans un carré de 3,5 x 3,5 pouces.
    8. Soulevez chaque échantillon du tampon froid de Ringer avec une pince à épiler. Assurez-vous que la pince à épiler ne contacte que les bords du papier filtre, en évitant la rétine coupée de moitié.
    9. Placez la face inférieure de chaque papier filtre (le côté sans la rétine dessus) sur une serviette en papier et enlevez l’excès de liquide.
    10. Ajouter une goutte de PBS froid 1x (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) sur le côté du papier filtre où la rétine est collée. Tamponnez le papier filtre sur l’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’humidité du papier filtre est suffisamment éliminée avant de congeler.
    11. Placez tous les morceaux de papier filtre dans la boîte de Petri de 35 x 10 mm. Utilisez un papier de soie non pelucheux pour évacuer tout excès de liquide entourant le papier filtre.
      REMARQUE: Ne pas surcharger la boîte de Petri avec des échantillons. Si plus de quatre yeux murins sont utilisés, envisagez d’utiliser une boîte de Petri plus grande ou plusieurs boîtes de Petri plus petites pour contenir les échantillons de rétine / papier filtre.
    12. Envelopper hermétiquement le plat entier avec du papier d’aluminium. Assurez-vous que les bords de la feuille d’aluminium sont fixés et pressés en douceur dans le fond de la boîte de Pétri. Perforez une poignée de trous de 0,1 à 0,2 mm dans le couvercle en papier d’aluminium (Figure 2A).
    13. À l’aide de pinces métalliques, abaissez progressivement la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium dans l’azote liquide. Conserver les échantillons dans l’azote liquide (<10 min) jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être lyophilisés.
  4. Lyophilisation
    1. Placez la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium dans une fiole de lyophilisation et fixez-la à la machine de lyophilisation en suivant le protocole du fabricant. Lyophiliser la rétine pendant 30 min.
    2. Détachez la fiole du lyophilisateur et éteignez la machine selon le fabricant.
    3. Retirez la feuille d’aluminium et travaillez avec les échantillons lyophilisés le jour même ou conservez-les dans des tubes de microcentrifugation de 1 mL correctement étiquetés. Placez ces tubes dans un récipient (tel qu’un tube conique de 50 mL) rempli d’un dessiccant anhydre et conservez les échantillons à -80 °C.
  5. Collecte des segments extérieurs et intérieurs des tiges par épluchage de ruban adhésif.
    1. Coupez des bandes de ruban adhésif transparent (1-2 cm) et rangez les bandes sur le bord du distributeur de ruban / banc de laboratoire / etc. pour une utilisation rapide.
    2. Déplacez un échantillon rétinien sur le couvercle d’une boîte de Petri en plastique de 60 x 15 mm pour le peler. Assurez-vous de ne saisir que les bords les plus extérieurs du papier filtre et évitez de toucher la rétine.
    3. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou de type ciseau équivalent), coupez un petit morceau de ruban adhésif rectangulaire à la taille approximative du tissu (1,5 x 2,5 mm).
    4. Posez soigneusement un petit morceau de ruban adhésif sur la rétine lyophilisée (Figure 2B) et appliquez une légère pression avec la pince à épiler pour vous assurer qu’il adhère à la couche photoréceptrice (la couche supérieure teintée d’orange / rose).
    5. Retirez lentement le ruban adhésif. Le segment extérieur de la tige (ROS) et le segment intérieur de la tige (RIS) seront collés à la bande (Figure 2B).
    6. Assurez-vous qu’il y a un mince film blanc à la surface fracturée. Il s’agit RIS.To séparer le RIS, placer un autre morceau de ruban adhésif et pousser le ruban vers le bas sur la surface fracturée (Figure 2B).
      REMARQUE: Il peut prendre plus d’un morceau de ruban adhésif pour enlever toute la fine couche blanche.
    7. Placez le morceau de ruban adhésif avec seulement la couche orange/rose dans un tube de microcentrifugation étiqueté +ROS.
    8. Placez le ruban ou les morceaux de ruban adhésif avec la fine couche blanche dans un tube de microcentrifugation étiqueté +RIS.
      REMARQUE: Séparer la rétine lyophilisée avec du ruban adhésif nécessite de la pratique. La quantité de pression appliquée à la bande affectera la façon dont l’échantillon lyophilisé se fractionnera. Si trop de pression est exercée sur le ruban adhésif sur l’échantillon, toute la rétine lyophilisée se décollera du papier filtre et collera au ruban adhésif. Si trop peu de pression est ajoutée à la bande, la couche supérieure orange/rose (+ROS) ne collera pas à la bande.
    9. Recueillir les restes de tissu rétinien (dépourvu de couches ROS et RIS, -OIS) situés sur le papier filtre en décollant la couche épaisse et blanche du papier filtre à l’aide de ruban adhésif. Placez l’isolat dans un tube étiqueté -OIS.
    10. Répétez ces étapes pour chaque échantillon rétinien réduit de moitié.
    11. Conservez les couches isolées de la rétine lyophilisée soit à température ambiante si vous effectuez une quantification des protéines, une électrophorèse sur gel et des immunoblots protéiques le même jour, soit dans un récipient (tel qu’un tube conique de 50 mL) rempli de dessiccant anhydre à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

3. Préparation de l’échantillon par transfert Western pour les isolements de pelage

  1. Préparer le tampon de lyse RIPA
    1. Dans un flacon de stockage de 100 mL, ajouter des réactifs pour obtenir une concentration finale de 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de FDS et 1 mM d’EDTA. Ajouter 100 mL d’eau ultrapure désionisée et bien mélanger.
      REMARQUE: Le tampon de lyse RIPA peut être conservé à 2-8 ° C pendant 2-3 semaines. Pour un stockage plus long, aliquote et conserver dans le congélateur à -20 °C.
    2. Le jour de l’expérience, ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de la protéase (0,1 M PMSF, 1:1000 aprotinine et 1:1000 leupeptine) au tampon de lyse RIPA et restez sur la glace.
  2. Préparation de lysat de pelage de papier filtre pour le transfert western
    1. S’assurer que les tubes contenant les pelures de papier filtre et les restes de rétine pelée sont maintenus sur de la glace (pour l’expérience du même jour) ou retirés du congélateur à -80 °C et placés sur de la glace.
    2. Retirez tout excès de liquide du fond des tubes de microcentrifugation contenant les pelures de papier filtre. Faites tourner rapidement une mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s et jetez tout liquide restant.
    3. Pipette 45-55 μL de tampon RIPA froid dans des tubes contenant l’isolat de papier filtre.
    4. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon propre et autoclavé pendant 1 min. Assurez-vous que le papier filtre reste en contact avec le mélangeur de pilons. Gardez le papier filtre sur le côté de chaque tube plutôt qu’en bas.
    5. Avec une pince à épiler, déplacez les papiers filtres sur le côté de chaque tube et faites tourner la mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s. Cela supprimera le tampon RIPA du papier filtre.
    6. Retirez le papier filtre séché et répétez l’opération pour tous les papiers filtres dans chaque tube si nécessaire.
    7. Transférer l’homogénat dans un nouveau tube et l’étiqueter de manière appropriée.
      REMARQUE: C’est l’étape la plus longue, et si elle n’est pas terminée correctement, une grande partie de l’échantillon finira par être absorbée par le papier filtre.
    8. Pipette 60-80 μL de tampon RIPA froid dans les tubes individuels avec les restes de rétine pelée.
    9. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon propre et autoclavé pendant 1 min.
  3. Peeling ruban adhésif Préparation de lysat pour western blot
    1. Placer les échantillons lyophilisés RT ou les échantillons à -80 °C sur de la glace.
    2. Pipette 50-70 μL de tampon RIPA froid dans chaque tube contenant des pelures de ruban +ROS et +RIS.
    3. Pipette 60-80 μL de tampon de lyse à froid dans les tubes -OIS contenant la rétine lyophilisée restante, avec les ROS et RIS enlevés.
    4. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon mélangeur propre pendant 1 min. Assurez-vous que le ruban dans les tubes individuels reste en contact avec le mélangeur de pilon et le tampon de lyse.
    5. Avec une pince à épiler stérilisée, déplacez le ruban sur le côté des tubes et faites tourner avec une mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s. Cela enlèvera le liquide de la bande. Retirez le ruban séché des tubes.
      REMARQUE: À ce stade, vous pouvez combiner deux demi-isolats rétiniens de la même rétine pour la méthode de « peeling du papier filtre » ou du « peeling du ruban adhésif » pour vous assurer que vous avez suffisamment de volume pour effectuer un test à l’acide bicinchoninique (BCA).

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Résultats

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Les stratégies actuelles ont été développées pour fournir des méthodes relativement rapides et simples pour isoler et analyser des protéines parmi des compartiments subcellulaires de bâtonnets spécifiques pour l’analyse par transfert de Western. Nous avons appliqué deux techniques de peeling séquentiel (Figure 1 et Figure 2) suivies d’immunoblotting pour démontrer que ces méthodes pouvaient être utilisées de manière fiable pour détecter la distribution connue de...

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Discussion

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De nombreuses maladies de la rétine affectent les cellules photoréceptrices des bâtonnets, entraînant la mort des bâtonnets et, en fin de compte, une perte de vision complète37. Une partie importante des origines génétiques et mécanistes de la dégénérescence rétinienne humaine ont été récapitulées avec succès dans de nombreux modèles murins au fil des ans. Dans ce contexte, la capacité de séparer facilement et sélectivement les compartiments subcellulaires individuels des bâtonnets de la petite ré...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par NIH Grant EY12155, EY027193 et EY027387 à JC. Nous remercions le Dr Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, États-Unis) et Natalie Chen (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir relu le manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr Seth Ruffins (USC, Los Angeles, États-Unis) et le Dr Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir fourni l’équipement nécessaire pour recueillir les images fournies par l’auteur. Matériel de: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartiments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, publié [2017], [Springer Nature].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacon de laboratoire ou de milieu de 100 mL équipé d’un adaptateur de capuchon de tubeN/A/
100 % O2N/AN/A Filtre
1000 mL sur le dessus de la bouteille, matériau filtrant PES, 0,22 &mu ; mGenesee Scientific25-235
4X SDS Sample BufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon tubeFisher Scientific14-432-22
95 % O2 et 5 % CO2 réservoirN/A/A
Ames' Moyen avec L-glutamine, sans bicarbonateSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99 %, dihydraté)SigmaC-3881
Drierite (sulfate de calcium anhydre, >98 % CaSO4, >2 % CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Boîte de Petri (polystyrène, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Boîte de culture tissulaire (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Scalpel à plumes (n° 10, 40 mm)VWR100499-578
Scalpel à plumes (n° 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99 %)SigmaP-4504
Kimble Kontes pilon à granulésSigmaz359971
Flacons à congélation rapideLabconcoN/A
LN2 (azote liquide) + Fiole Dewar ou bouteille à vide similaireN/A/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/eau désioniséeEMD MilliporeN/A
Na2HPO<>4 (poudre)J.T. Baker4062-01
NaCl (cristal)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Feuilled’aluminium Reynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)Scotch-3MN/A
Désoxycholatede sodium Sigma-AldrichD67501
Spectrafuge mini centrifugeuseLabnet International, IncC1301
Chambre d’incubation de tissus (achetée ou fabriquée sur mesure)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer ou machine équivalenteSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diamètre 5,5 cm, taille des pores 5 &mu ; m)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Papier filtre qualitatif (diamètre 9 cm, taille des pores 11 &mu ; m)Whatman/GE Healthcare1001-090
Pipette de transfert à grand diamètre, Global ScientificVWR76285-362
NA réservoir de N N

Références

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