Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les photorécepteurs de bâtonnets sont des neurones sensoriels hautement polarisés avec des compartiments distincts. Les bâtonnets de souris sont longs (~80 μm) et minces (~2 μm) et sont emballés latéralement dans la couche la plus externe de la rétine, la couche photoréceptrice, ce qui entraîne l’alignement de compartiments subcellulaires analogues. Traditionnellement, la section tangentielle de la rétine plate gelée a été utilisée pour étudier le mouvement et la localisation des protéines dans différents compartiments de tiges. Cependant, la courbure élevée de la rétine de souris à dominante bâtonnet rend la section tangentielle difficile. Motivés par l’étude du transport des protéines entre les compartiments, nous avons développé deux méthodes de peeling qui isolent de manière fiable le segment externe de la tige (ROS) et d’autres compartiments subcellulaires pour les transferts occidentaux. Nos techniques relativement rapides et simples fournissent des fractions enrichies et spécifiques aux subcellulaires pour mesurer quantitativement la distribution et la redistribution de protéines photoréceptrices importantes dans des bâtonnets normaux. De plus, ces techniques d’isolement peuvent également être facilement adaptées pour isoler et étudier quantitativement la composition protéique d’autres couches cellulaires dans la rétine saine et dégénérée.
Introduction
Les cellules photoréceptrices en bâtonnets, étroitement emballées dans la couche la plus externe de la rétine neurale, font partie intégrante de la vision en basse lumière. Pour fonctionner comme des compteurs de photons fidèles, les bâtonnets utilisent une voie de signalisation à base de protéine G, appelée phototransduction, pour générer des réponses rapides, amplifiées et reproductibles à la capture de photons uniques. Cette réponse à la lumière déclenche finalement un changement du courant au niveau de la membrane plasmique et est ensuite signalée au reste du système visuel1. Comme leur nom l’indique, chaque cellule de bâtonnet a une forme ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles locales du comité de recherche sur les soins aux animaux de l’Université de Californie du Sud (USC).
1. Méthode de peeling de la rétine à cellules vivantes
- Préparation des tampons d’Ames, des papiers à peler et du plat de dissection
- À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou d’un type de ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cellulose (grade 413) en rectangles mesurant environ 5 mm x 2,5 mm. Conservez les boutures pour une utilisation ultérieure.
- Préparer 1 L de tampon HEPES d’Ames en combinan....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les stratégies actuelles ont été développées pour fournir des méthodes relativement rapides et simples pour isoler et analyser des protéines parmi des compartiments subcellulaires de bâtonnets spécifiques pour l’analyse par transfert de Western. Nous avons appliqué deux techniques de peeling séquentiel (Figure 1 et Figure 2) suivies d’immunoblotting pour démontrer que ces méthodes pouvaient être utilisées de manière fiable pour détecter la distribution connue de.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
De nombreuses maladies de la rétine affectent les cellules photoréceptrices des bâtonnets, entraînant la mort des bâtonnets et, en fin de compte, une perte de vision complète37. Une partie importante des origines génétiques et mécanistes de la dégénérescence rétinienne humaine ont été récapitulées avec succès dans de nombreux modèles murins au fil des ans. Dans ce contexte, la capacité de séparer facilement et sélectivement les compartiments subcellulaires individuels des bâtonnets de la petite ré.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par NIH Grant EY12155, EY027193 et EY027387 à JC. Nous remercions le Dr Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, États-Unis) et Natalie Chen (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir relu le manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr Seth Ruffins (USC, Los Angeles, États-Unis) et le Dr Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir fourni l’équipement nécessaire pour recueillir les images fournies par l’auteur. Matériel de: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartiments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, publié [2017], [Springer Nature].
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Flacon de laboratoire ou de milieu de 100 mL équipé d’un adaptateur de capuchon de tube | N/A | / | |
| 100 % O2 | N/A | N/A Filtre | |
| 1000 mL sur le dessus de la bouteille, matériau filtrant PES, 0,22 &mu ; m | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95 % O2 et 5 % CO2 réservoir | N/A | /A | |
| Ames' Moyen avec L-glutamine, sans bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99 %, dihydraté) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (sulfate de calcium anhydre, >98 % CaSO4, >2 % CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Boîte de Petri (polystyrène, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Boîte de culture tissulaire (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Scalpel à plumes (n° 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Scalpel à plumes (n° 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99 %) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pilon à granulés | Sigma | z359971 | |
| Flacons à congélation rapide | Labconco | N/A | |
| LN2 (azote liquide) + Fiole Dewar ou bouteille à vide similaire | N/A | /A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/eau désionisée | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO<>4 (poudre) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (cristal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Feuille | d’aluminium Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Désoxycholate | de sodium Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifugeuse | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Chambre d’incubation de tissus (achetée ou fabriquée sur mesure) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer ou machine équivalente | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diamètre 5,5 cm, taille des pores 5 &mu ; m) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Papier filtre qualitatif (diamètre 9 cm, taille des pores 11 &mu ; m) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Pipette de transfert à grand diamètre, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Références
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
