Article de méthode

Optimisation du modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne pour limiter la variabilité

DOI :

10.3791/62980

⸱

6 août 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’occlusion veineuse rétinienne à l’aide de rose bengale et un système de microscope d’imagerie rétinienne guidé par laser avec des recommandations pour maximiser sa reproductibilité dans les souches génétiquement modifiées.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modèles murins d’occlusion veineuse rétinienne (OVR) sont souvent utilisés en ophtalmologie pour étudier les lésions hypoxiques-ischémiques dans la rétine neurale. Dans ce rapport, une méthode détaillée soulignant les étapes critiques est fournie avec des recommandations d’optimisation pour atteindre des taux d’occlusion constamment réussis sur différentes souches de souris génétiquement modifiées. Le modèle murin RVO consiste principalement en l’administration intraveineuse d’un colorant photosensibilisateur suivie d’une photocoagulation au laser à l’aide d’un microscope imageur rétinien fixé à un laser guidé ophtalmique. Trois variables ont été identifiées comme déterminants de la cohérence de l’occlusion. En ajustant le temps d’attente après l’administration de rose bengal et en équilibrant la sortie laser de base et expérimentale, la variabilité entre les expériences peut être limitée et un taux de réussite plus élevé des occlusions obtenu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les maladies rétiniennes caractérisées par un œdème rétinien et une lésion hypoxique-ischémique. De plus, comme ce modèle induit des lésions vasculaires, il peut également être appliqué pour étudier la neurovascularisation, la mort neuronale et l’inflammation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’occlusion veineuse rétinienne (OVR) est une maladie vasculaire rétinienne courante qui a touché environ 28 millions de personnes dans le monde en 20151. L’OCV entraîne un déclin et une perte de vision chez les adultes et les personnes âgées en âge de travailler, ce qui représente une maladie menaçant la vue qui devrait augmenter au cours de la décennie proche. Certaines des pathologies distinctes de la RVO comprennent les lésions hypoxiques-ischémiques, l’œdème rétinien, l’inflammation et la perte neuronale2. Actuellement, la première ligne de traitement pour ce trouble est par l’administration d’inhibiteurs du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Bien que le traitement anti-VEGF ait contribué à améliorer l’œdème rétinien, de nombreux patients sont encore confrontés à un déclin de la vision3. Pour mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie et tester de nouvelles lignes de traitement potentielles, il est nécessaire de constituer un protocole modèle de souris RVO fonctionnel et détaillé pour différentes souches de souris.

Des modèles de souris ont été développés en mettant en œuvre le même dispositif laser utilisé chez les patients humains, associé à un système d’imagerie adapté à la taille correcte pour une souris. Ce modèle murin de RVO a été signalé pour la première fois en 2007 4 et établi par Ebneter et al. 4,5. Finalement, le modèle a été optimisé par Fuma et al. pour reproduire les principales manifestations cliniques de la RVO telles que l’œdèmerétinien 6. Depuis que le modèle a été rapporté pour la première fois, de nombreuses études l’ont utilisé en utilisant l’administration d’un colorant photosensibilisant suivie d’une photocoagulation des principales veines rétiniennes avec un laser. Cependant, la quantité et le type de colorant administré, la puissance laser et le temps d’exposition varient considérablement d’une étude à l’autre qui ont utilisé cette méthode. Ces différences peuvent souvent entraîner une variabilité accrue du modèle, ce qui le rend difficile à reproduire. À ce jour, il n’existe aucune étude publiée avec des détails spécifiques sur les pistes potentielles d’optimisation.

Ce rapport présente une méthodologie détaillée du modèle murin RVO dans la souche C57BL/6J et une souche de caspase-9 endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J et pertinente pour la pathologie RVO comme souche de référence pour une souris génétiquement modifiée. Une étude antérieure avait montré que l’activation non apoptotique de la caspase-9 endothéliale provoque un œdème rétinien et favorise la mort neuronale8. L’expérience d’utilisation de cette souche a permis de déterminer et de donner un aperçu des modifications potentielles pour adapter le modèle murin RVO, qui peut être applicable à d’autres souches génétiquement modifiées.

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Protocole

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Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.

NOTE: Toutes les expériences ont utilisé des souris mâles âgées de deux mois qui pesaient environ 20 g.

1. Préparation et administration de tamoxifène pour l’ablation génétique inductible de gènes floxed

REMARQUE: Le diamètre du vaisseau rétinien peut être affecté par le poids de l’animal. Assurez-vous que tous les animaux utilisés pour une expérience ont des poids similaires.

  1. Diluer le tamoxifène dans de l’huile de maïs à une concentration de 20 mg/mL.
    REMARQUE: Le tamoxifène est toxique et sensible à la lumière. Protéger de la lumière, par exemple avec du papier d’aluminium.
  2. Vortex la solution pendant quelques secondes.
  3. Laisser au four à 55 °C pendant 15 min.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tamoxifène s’est complètement dissous. Un vortex supplémentaire peut être nécessaire.
  4. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
  5. Utilisez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G pour injection de tamoxifène. Nettoyez la zone d’injection avec de l’éthanol à 70%.  Administrer 2 mg de tamoxifène (100 μL de 20 mg/mL) par voie intrapéritonéale (IP) une fois par jour pendant le temps établi selon la lignée Cre inductible spécifique.
  6. Prévoyez deux jours de repos pour les animaux avant de commencer les expériences.

2. Préparation des réactifs pour la photocoagulation au laser

  1. Rose bengale
    REMARQUE: Rose bengal est sensible à la lumière. Conserver dans l’obscurité jusqu’à utilisation et préparer frais pour de meilleurs résultats.
    1. Préparez le rose bengal en le diluant à 5 mg/mL dans une solution saline stérile et filtrez-le à travers un filtre à seringue de 0,2 μm.
    2. Préparez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G avec du rose Bengal.
  2. Kétamine/xylazine
    1. Diluer la kétamine et la xylazine dans une solution saline stérile en conséquence pour les concentrations suivantes: kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg).
  3. Carprofène
    1. Diluer le carprofène à 1 mg/mL dans une solution saline stérile.
    2. Préparez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G contenant du carprofène.
  4. Solution saline stérile
    1. Préparez une seringue de 5 mL munie d’une aiguille de 26 G avec une solution saline stérile.

3. Configuration laser

  1. Manipulez délicatement le câble à fibre optique et connectez-le au boîtier de commande laser et à l’adaptateur laser du microscope imageur rétinien.
  2. Allumez le boîtier de lampe du microscope imageur rétinien.
  3. Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie.
  4. Ajustez la balance des blancs en utilisant un morceau de papier blanc et en le plaçant devant l’oculaire de la souris et en cliquant sur Ajuster dans le programme d’imagerie.
  5. Allumez le boîtier de commande laser en tournant la clé et en suivant les instructions sur l’écran du boîtier de commande laser.
    REMARQUE: Le laser utilisé dans cette expérience est de classe 3B et peut causer des lésions oculaires. Portez des lunettes de protection lorsque vous utilisez le laser.
  6. Vérifiez la puissance laser de base.
    1. Utilisez un capteur de puissance laser.
    2. Ajustez l’écran du boîtier de commande laser aux paramètres suivants : 50 mW et 2 000 ms.
    3. Allumez le laser et placez le capteur de puissance devant l’oculaire.
      REMARQUE: Assurez-vous que la lumière du microscope est éteinte lors du test de la puissance laser de base.
    4. Appuyez sur la pédale de pédale pour activer le laser.
    5. Visez une puissance de 13 à 15 mW.
      REMARQUE: La lecture de puissance laser déterminera le taux de réussite des occlusions veineuses rétiniennes. Si la lecture de puissance laser est trop faible, des ajustements peuvent être apportés à la puissance et à la durée d’exposition au laser. Voir le tableau 1 pour les recommandations.
  7. Ajustez la puissance du laser expérimental en configurant l’écran du boîtier de commande laser pour les paramètres suivants : 100 mW, 1 000 ms.
  8. Éteignez le laser.
    REMARQUE: Pour des raisons de sécurité et pour éviter la surchauffe, il est préférable de garder le laser éteint entre les souris.

4. Injection de rose bengal dans la veine de la queue de souris

  1. Versez 300 mL d’eau dans un bécher de 500 mL.
  2. Réchauffer le bécher dans un four à micro-ondes pendant 1 min.
  3. Mettez de la gaze dans l’eau chaude du bécher.
  4. Mettez la souris dans un dispositif de retenue.
  5. Appuyez doucement sur la gaze dans la queue de la souris et recherchez les veines dilatées. Désinfectez le site d’injection à l’aide d’une lingette imbibée d’alcool après la dilatation de l’eau tiède.
  6. Insérez l’aiguille dans le site d’injection et tirez sur la seringue pour vous assurer que vous êtes dans la veine. Ensuite, injectez la veine de la queue de la souris, en administrant la quantité correcte en fonction du poids de l’animal (37,5 mg / kg). Appliquez une pression sur le site d’injection pour éviter les hématomes ou les saignements. Effacez le site.
  7. Libérez la souris de la retenue et remettez-la dans la cage.
  8. Laisser circuler 8 min pour que le rose bengal circule avant l’injection d’anesthésiques.
    REMARQUE: Cela fournira un total de 10 minutes entre l’injection de rose bengale et l’irradiation laser.

5. Occlusion des veines principales

  1. Allumez la plate-forme de la souris chauffée.
  2. Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide dans chaque œil.
  3. Injecter 150 μL d’anesthésiques, de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) IP.
    REMARQUE: Au cours de cette procédure, la souris a reçu deux injections IP. Par conséquent, les côtés ont été alternés. L’injection IP pour l’anesthésie a été administrée dans le quadrant abdominal inférieur droit, et la solution saline a été injectée dans le quadrant abdominal inférieur gauche. Il est recommandé de tirer sur la seringue avant l’injection pour s’assurer que l’aiguille est dans l’abdomen et non dans les organes.
  4. Pincez l’animal pour déterminer la profondeur de l’anesthésie et attendez qu’il ne réponde plus.
  5. Ajouter une goutte de chlorhydrate de proparacaïne par œil (analgésique).
  6. Ajouter la pommade gel aux deux yeux.
  7. Injecter 150 μL de carprofène par voie sous-cutanée entre les oreilles.
  8. Accueillez la souris sur la plate-forme.
  9. Ajustez la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette.
  10. Comptez les veines rétiniennes et prenez une image du fond d’œil.
    REMARQUE: Les veines rétiniennes sont plus foncées et plus larges que les artères. Les veines et les artères alternent; Cependant, il peut parfois y avoir une artère ramifiée près du nerf optique et, par conséquent, deux artères adjacentes.
  11. Allumez le laser et visez une veine rétinienne à environ 375 μm du disque optique.
  12. Irradiez le récipient en appuyant sur la pédale et en déplaçant légèrement le faisceau laser jusqu’à 100 μm. Répétez cette étape trois fois et déplacez le faisceau laser après chaque impulsion afin que l’irradiation ne soit pas focalisée en un seul endroit.
  13. Répéter l’irradiation sur d’autres vaisseaux principaux pour obtenir 2-3 occlusions.

6. Établir le nombre de veines obstruées au jour 0

  1. Éteignez la lampe après avoir irradié les récipients et attendez 10 min.
    REMARQUE: L’exposition à la lumière peut causer des dommages rétiniens et une inflammation; Éteignez la lampe pendant le temps d’attente pour minimiser l’exposition7.
  2. Rallumez la lampe et comptez le nombre de veines obstruées.
  3. Prenez une image du fond d’œil.

7. Suivi

  1. Injecter 1 mL de solution saline IP stérile.
    REMARQUE: Voir les détails de l’injection IP dans la section 5, étape 3.
  2. Ajouter des gouttes ophtalmiques lubrifiantes aux deux yeux.
  3. Ajouter la pommade gel aux deux yeux.
  4. Observez la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie et ne la remettez pas dans la cage avec les autres animaux avant d’être complètement rétablie. Le carprofène (5 mg / kg) peut être administré quotidiennement jusqu’à 2 jours après l’intervention. Si elle est appliquée aux humains, la douleur n’est pas un symptôme de l’OVR.
    REMARQUE : Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement de l’anesthésie.

8. Évaluation de l’œdème rétinien par tomographie par cohérence optique (TCO)

REMARQUE : Cette étape peut être effectuée au moment d’intérêt de l’investigateur. Le pic d’œdème rétinien pour une souris C57BL / 6J est de 1 jour après la procédure RVO. Ce point temporel peut varier en fonction de l’arrière-plan de la souris.

  1. Allumez le boîtier lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil OCT et la plate-forme de souris chauffée.
  2. Le lendemain de l’occlusion, suivez les étapes 5.2 à 5.7 pour préparer l’animal.
  3. Ouvrez les logiciels d’imagerie et d’OPO.
  4. Dans le programme de l’OPO, réglez le nudge à 5.
  5. Prendre OCT à 75 μm distal de la brûlure ou 4 clics.
  6. Prenez des images OCT à quatre quadrants de la rétine.
  7. Analysez les images de l’OPO à l’aide d’un logiciel de traçage.
  8. Comparez l’épaisseur rétinienne des mesures pré-irradiées à 1 jour après la RVO ou au moment d’intérêt.
    REMARQUE: Lors de l’analyse des données, prenez en considération le nombre de veines irradiées, car cela peut influencer le développement de l’œdème rétinien. Les animaux sont ensuite euthanasiés par l’administration d’anesthésique suivie d’une chirurgie de non-survie par perfusion.

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Résultats

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Le modèle murin RVO vise à obtenir avec succès des occlusions dans les veines rétiniennes, entraînant une lésion hypoxique-ischémique, une rupture de la barrière rétinienne sanguine, une mort neuronale et un œdèmerétinien 8. La figure 1 montre une chronologie des étapes pour assurer la reproductibilité, un schéma de la conception expérimentale et décrit les étapes qui peuvent être optimisées davantage en fonction des questions expérimentales. Les trois principales éta...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modèle de RVO chez la souris offre un moyen de mieux comprendre la pathologie de la RVO et de tester des traitements potentiels. Bien que le modèle RVO de souris soit largement utilisé sur le terrain, il est nécessaire de disposer d’un protocole détaillé actuel du modèle qui traite de sa variabilité et décrit l’optimisation du modèle. Ici, nous fournissons un guide avec des exemples d’expérience sur ce qui peut être modifié pour obtenir les résultats les plus cohérents dans une cohorte d’animaux de laboratoire et four...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (au CCO), le National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (à l’AMP) et le National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (à CMT).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CarprofèneRimadylNADA #141-199conserver à 4 ° ; C
Huile de maïsSigma-AldrichC8267
Câble de raccordement à fibreThor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
Chlorhydrate de kétamineHenry ScheinNDC : 11695-0702-1
LasercheckCoherent1098293
PhényléphrineAkornNDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV avec méridien,  ; StreamPix, et modules OCTPhoenix Technology Group
Chlorhydrate de proparacaïneAkornNDC : 17478-263-12maintenir à 4 ° ; C
RefreshAllergan94170
Rose BengalSigma-Aldrich330000-5G
TamoxifèneSigma-AldrichT5648-5Gà la lumière
TropicamideAkornNDC : 174478-102-12
XylazineAkornNDCL 59399-110-20
sensible

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Photocoagulation au laserBengale rosed me r tinienTomographie en coh rence optiqueL sion neurovasculaireMicroscope d imagerie r tinienneL sion vasculaireMort neuronale

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