Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Anthos Christofides; Carol Cao; Rinku Pal; Halil I. Aksoylar; Vassiliki  A. Boussiotis

doi:10.3791/62985

Article de méthode

Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

DOI :

10.3791/62985

⸱

16 novembre 2021

Anthos Christofides¹^,² , Carol Cao¹^,²^,³ , Rinku Pal¹^,² , Halil I. Aksoylar¹^,² , Vassiliki A. Boussiotis¹^,²

¹Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, ²Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, ³Harvard College

Dans cet article

Résumé

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Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Résumé

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Les voies respiratoires sont en contact direct avec l’environnement extérieur et nécessitent un système immunitaire régulé avec précision pour fournir une protection tout en supprimant les réactions indésirables aux antigènes environnementaux. Les poumons hébergent plusieurs populations de cellules immunitaires innées et adaptatives qui assurent la surveillance immunitaire mais interviennent également dans les réponses immunitaires protectrices. Ces cellules, qui maintiennent le système immunitaire pulmonaire sain en équilibre, participent également à plusieurs conditions pathologiques telles que l’asthme, les infections, les maladies auto-immunes et le cancer. L’expression sélective des protéines de surface et intracellulaires fournit des propriétés immunophénotypiques uniques aux cellules immunitaires du poumon. Par conséquent, la cytométrie en flux joue un rôle déterminant dans l’identification de ces populations cellulaires dans des conditions d’équilibre et pathologiques. Cet article présente un protocole qui décrit une méthode cohérente et reproductible pour identifier les cellules immunitaires qui résident dans les poumons de souris saines dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour identifier les changements dans ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie afin d’aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire.

Introduction

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Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme ^pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent ....

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Protocole

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Toutes les études et expériences décrites dans ce protocole ont été menées selon les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center. Des souris C57BL/6 âgées de six à dix semaines de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées pour développer ce protocole.

1. Excision chirurgicale et préparation des tissus

Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (préparé selon le protocole standard; Tableau des matériaux).
REMARQUE: L’asphyxie au _CO2 doit être évitée dans les études pulmonaires, car elle pour....

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Résultats

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Stratégie de contrôle
La première étape de notre stratégie de contrôle est l’exclusion des débris et des doublets (Figure 1A). Une exclusion prudente des doublets est essentielle pour éviter les populations faussement positives (figure supplémentaire S2). Ensuite, les cellules immunitaires sont identifiées à l’aide de CD45⁺, un marqueur des cellules hématopoïétiques (Figure 1B). La tache morte vivante peut être ajo.......

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Discussion

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L’identification des cellules immunitaires pulmonaires peut être difficile en raison des multiples types de cellules immunitaires résidant dans le poumon et de leurs caractéristiques immunophénotypiques uniques par rapport à leurs homologues résidant dans d’autres tissus. Dans plusieurs conditions pathologiques, des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques distinctes apparaissent dans les poumons. Par exemple, les lésions pulmonaires induites par la bléomycine entraînent le recrutement de macrophages circul.......

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Déclarations de divulgation

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V.A.B. détient des brevets sur la voie PD-1 sous licence de Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis et Dako. Les auteurs ne déclarent aucun autre intérêt financier concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01CA238263 et R01CA229784 (VAB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Piston de seringue 10 mL	EXELINT	26265
Aiguilles 18 G	Aiguille BD Precision Glide	305165
Aiguilles 21 G	Aiguille BD Precision Glide	305195
50 mL Tubes coniques	Falcon	3520
70 &mu ; Filtre à cellules m	ThermoFisher	22363548
plaques à 96 puits	Falcon/corning	3799
Tampon de lysage ACK	ThermoFisher	A10492-01
anti-souris CD11b	Biolegend	101215	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris CD11c	Biolegend	117339 / 117337	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris CD45	Biolegend	103115	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris CD64	Biolegend	139319	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris CD68	Biolegend	137009	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris GR-1	Biolegend	108433	Pour plus de détails, voir le tableau 2
anti-souris Siglec F	Biolegend	155503	plus de détails, voir le tableau 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	Pour plus de détails, voir le tableau 2
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103		Biolegend 121405 / 121419	Pour plus de détails, voir le tableau 2
CD24	Biolegend	138503	Pour plus de détails, voir le tableau 2
CD3	Biolegend	100205	Pour plus de détails, voir le tableau 2
Centrifugeuse
Collagénase de type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	Pour plus de détails, voir le tableau 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	Pour plus de détails, voir le tableau 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	Pour plus de détails, voir le tableau 2
Sérum de veau fœtal	R& D Systems
Fine Dentelle Pince Roboz	Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	Pour plus de détails, voir le tableau 2
MERTK	Biolegend	151505	Pour plus de détails, voir le tableau 2
MHC-II	Biolegend	107621	Pour plus de détails, voir le tableau 2
NK1.1	Biolegend	108705	Pour plus de détails, voir le tableau 2
Vibrateur orbital	VWR	Modèle 200
Boîte de Pétri	Falcon	351029
Centrifugeuse de paillasse réfrigérée	SORVAL ST 16R
Petit ciseau incurvé	Roboz Surgical Instrument Co

Pour

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
Tan, S. Y., Krasnow, M. A.

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Mots-clés

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Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

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