Micromodélisation de microscopie électronique à transmission pour diriger le positionnement des cellules dans les flux de travail de cryo-tomographie électronique à cellules entières

Summary

L’objectif de ce protocole est de diriger l’adhésion et la croissance des cellules vers des zones ciblées de grilles pour la cryo-microscopie électronique. Ceci est réalisé en appliquant une couche antisalissure qui est ablation dans des modèles spécifiés par l’utilisateur, suivie d’un dépôt de protéines de matrice extracellulaire dans les zones à motifs avant l’ensemencement cellulaire.

Abstract

La cryo-tomographie électronique à cellules entières (cryo-ET) est une technologie puissante utilisée pour produire des structures de résolution nanométrique de macromolécules présentes dans le contexte cellulaire et conservées dans un état quasi natif congelé-hydraté. Cependant, il existe des défis associés à la culture et / ou à l’adhésion des cellules sur des grilles TEM d’une manière qui convient à la tomographie tout en maintenant les cellules dans leur état physiologique. Ici, un protocole détaillé étape par étape est présenté sur l’utilisation du micromodèlement pour diriger et promouvoir la croissance cellulaire eucaryote sur les grilles TEM. Au cours du micromodèlement, la croissance cellulaire est dirigée en déposant des protéines de matrice extracellulaire (ECM) dans des motifs et des positions spécifiés sur la feuille de la grille TEM tandis que les autres zones restent recouvertes d’une couche antisalissure. La flexibilité dans le choix du revêtement de surface et de la conception des motifs rend le micromodèlement largement applicable à un large éventail de types de cellules. Le micromodèlement est utile pour l’étude des structures au sein de cellules individuelles ainsi que pour des systèmes expérimentaux plus complexes tels que les interactions hôte-pathogène ou les communautés multicellulaires différenciées. Le micromodèlement peut également être intégré dans de nombreux flux de travail cryo-ET à cellules entières en aval, y compris la microscopie électronique et à lumière corrélative (cryo-CLEM) et le fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB).

Introduction

Avec le développement, l’expansion et la polyvalence de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), les chercheurs ont examiné un large éventail d’échantillons biologiques dans un état quasi natif allant de la résolution macromoléculaire (~1 nm) à la résolution élevée (~2 Å). Les techniques de cryo-EM et de diffraction d’électrons à particule unique sont mieux appliquées aux macromolécules purifiées en solution ou à l’état cristallin, ^{respectivement1,2}. Alors que la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est particulièrement adaptée aux études structurelles et ultrastructurales quasi natives de grands objets hétérologues tels que des bactéries, des virus pléomorphes et des cellules eucaryotes3. En cryo-ET, l’information tridimensionnelle (3D) est obtenue en inclinant physiquement l’échantillon sur la scène du microscope et en acquérant une série d’images à travers l’échantillon sous différents angles. Ces images, ou séries d’inclinaison, couvrent souvent une plage de +60/-60 degrés par incréments d’un à trois degrés. La série d’inclinaison peut ensuite être reconstruite par calcul en un volume 3D, également appelé tomogramme4.

Toutes les techniques cryo-EM nécessitent que l’échantillon soit incorporé dans une fine couche de glace vitreuse amorphe, non cristalline. L’une des techniques de cryofixation les plus couramment utilisées est la congélation par immersion, où l’échantillon est appliqué sur la grille EM, effacé et rapidement plongé dans de l’éthane liquide ou un mélange d’éthane liquide et de propane. Cette technique est suffisante pour la vitrification d’échantillons de <100 nm à ~10 μm d’épaisseur, y compris les cellules humaines cultivées, telles que les cellules ^HeLa5,6. Des échantillons plus épais, tels que des mini-organoïdes ou des biopsies tissulaires, jusqu’à 200 μm d’épaisseur, peuvent être vitrifiés par congélation à haute ^pression7. Cependant, en raison de la diffusion accrue des électrons d’échantillons plus épais, l’épaisseur de l’échantillon et de la glace pour le cryo-ET est limitée à ~ 0,5 - 1 μm dans les microscopes électroniques à transmission de 300 kV. Par conséquent, la cryo-ET à cellules entières de nombreuses cellules eucaryotes est limitée à la périphérie cellulaire ou aux extensions des cellules, à moins que des étapes supplémentaires de préparation de l’échantillon ne soient utilisées, telles que la cryo-sectionnement8 ou le broyage par faisceau d’ions focalisés9,10,11.

Une limitation de nombreuses expériences d’imagerie cryo-ET à cellules entières est le débit de collecte de ^données12. Contrairement à la cryo-EM à particule unique, où des milliers de particules isolées peuvent souvent être imagées à partir d’un seul carré de grille TEM, les cellules sont grandes, étalées et doivent être cultivées à une densité suffisamment faible pour permettre aux cellules d’être préservées dans une fine couche de glace vitreuse. Souvent, la région d’intérêt est limitée à une caractéristique ou à une sous-zone particulière de la cellule. La propension des cellules à se développer sur des zones qui ne se prêtent pas à l’imagerie TEM, telles que sur ou à proximité des barres de grille TEM, limite encore plus le débit. En raison de facteurs imprévisibles associés à la culture cellulaire sur les réseaux TEM, des développements technologiques sont nécessaires pour améliorer l’accessibilité des échantillons et le débit pour l’acquisition de données.

Le micromodèlement de substrat avec des protéines de matrice extracellulaire adhérente (ECM) est une technique bien établie pour la microscopie optique à cellules vivantes pour diriger la croissance des cellules sur des surfaces rigides, durables et optiquement transparentes telles que le verre et d’autres substrats de culture ^{tissulaire13,14}. Le micromodèlement a également été effectué sur des surfaces souples et/ou tridimensionnelles (3D). De telles techniques n’ont pas seulement permis le positionnement précis des cellules; ils ont également soutenu la création de réseaux multicellulaires, tels que des circuits de cellules neurales à ^motifs15. L’introduction du micromodèlement dans le cryo-ET augmentera non seulement le débit, mais elle peut également ouvrir la voie à de nouvelles études pour explorer des microenvironnements cellulaires complexes et dynamiques.

Récemment, plusieurs groupes ont commencé à utiliser des techniques de micromodélisme sur des grilles TEM par le biais de multiples ^{approches16,17}. Ici, l’utilisation d’une technique de photomodèlement sans masque pour les grilles TEM est décrite à l’aide du système de micromotifs Alvéole PRIMO, qui présente des motifs haute résolution et sans contact. Avec ce système de micromodèlement, une couche antisalissure est appliquée sur le dessus du substrat, suivie de l’application d’un photocatalyseur et de l’ablation de la couche antisalissure dans des motifs définis par l’utilisateur avec un laser UV. Les protéines ECM peuvent ensuite être ajoutées aux modèles pour la culture cellulaire appropriée. Cette méthode a été utilisée par plusieurs groupes pour des études cryo-ET de pigments rétiniens épithéliaux-1 (RPE1), de reins canins Madin-Darby II (MDCKII), de fibroblastes du prépuce humain (HFF) et de lignées cellulaires endothéliales16,17,18. Ce système de micromodélisme est compatible avec plusieurs substrats de couche antisalissure ainsi qu’avec un réactif photocatalyseur liquide ou en gel. Une variété de protéines ECM peut être sélectionnée et adaptée à la spécificité de la lignée cellulaire, conférant une polyvalence à l’utilisateur.

Le micromodèlement a été appliqué avec succès à un certain nombre de projets au sein du ^{laboratoire19}. Ici, un protocole de micromodélisation est présenté, y compris des adaptations spécifiques pour étudier les cellules HeLa cultivées, les cellules BEAS-2B infectées par le virus respiratoire syncytial (VRS) et les neurones larvaires primaires de Drosophila melanogaster20.

Protocol

Le protocole décrit ici est une compilation des méthodes de culture cellulaire, de micromodélisme et d’imagerie utilisées par le laboratoire Wright et le Cryo-EM Research Center de l’Université du Wisconsin, à Madison. Le flux de travail est présenté à la figure 1. Du matériel de formation et d’instruction supplémentaire est disponible aux sites suivants : https://cryoem.wisc.edu ou https://wrightlab.wisc.edu

1. Préparation des grilles pour le modelage

1. Transférez les grilles TEM sur une lame de verre propre, côté carbone vers le haut (l’épaisseur standard de la feuille de carbone est de 12 nm). À l’aide d’un évaporateur en carbone, ACE600, évaporez 5 à 8 nm de carbone supplémentaire sur les grilles pour augmenter la durabilité globale du film de carbone.
   REMARQUE : cette étape n’est pas nécessaire pour les grilles _SiO2 . Cette étape peut également être effectuée à l’avance; stocker les grilles revêtues dans un environnement peu humide tel qu’un dessiccateur à vide.
2. Transférez les grilles sur un support de préparation de grille et déchargez les grilles côté carbone vers le haut. À l’aide d’un système de décharge luminescente, déchargez les grilles pendant 60 s à 10 mA avec une distance de travail de 80 mm et une pression de vide de 1,0 x ^10-3 mbar. Faites-le dans les 15-30 minutes de l’étape suivante.
   REMARQUE: Les supports de préparation de grille peuvent être achetés dans le commerce ou faits maison avec un morceau de papier filtre sur une petite boîte de Pétri.

2. Application de la couche antisalissure

REMARQUE: Une technique stérile appropriée doit être utilisée lors de la manipulation des grilles, et toutes les solutions doivent être stériles et / ou stérilisées par filtre.

1. Transférez les grilles (côté carbone vers le haut) sur une glissière en verre propre ou un couvercle avec au moins 1 cm de séparation entre les grilles. Pipette 10 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,05 % sur chaque grille. Incuber les grilles dans une chambre humide, telle qu’une boîte en plastique fermée avec des serviettes en papier humides, pendant au moins 30 minutes.
   REMARQUE: Cette étape peut être étendue à la nuit. Assurez-vous que le niveau d’humidité dans la chambre est suffisant pour empêcher les grilles de se dessécher.
2. Lavez chaque grille trois fois avec 15 μL de 0,1 M HEPES pH 8,5. Pour chaque lavage, retirez la majeure partie du liquide de la grille avec une pipette sans laisser sécher la grille. Ajouter 15 μL de tampon frais, incuber pendant au moins 30 s et répéter. Laisser chaque grille dans 15 μL de 0,1 M HEPES après le lavage final.
   REMARQUE: Dans cette étape et les étapes futures, il est important de garder la grille humide et d’éviter tout contact entre la pipette et la grille.
3. Préparer 10 μL de 100 mg/mL de valérate de polyéthylène glycol-succinimidyle (PEG-SVA) dans 0,1 M HEPES pH 8,5 pour chaque grille. Le PEG-SVA se dissout rapidement avec un mélange doux, ce qui donne une solution claire.
   REMARQUE: Ne préparez pas la solution PEG-SVA à l’avance. PEG-SVA a une demi-vie de 10 min à pH 8,5. Évitez d’exposer le stock de PEG-SVA à une humidité excessive en le stockant dans un dessiccateur ou un environnement sec à -20 °C et en le réchauffant à la température ambiante avant ouverture.
4. Immédiatement après avoir préparé la solution peg-SVA, retirer la goutte de 15 μL de HEPES pH 8,5 de chaque grille (en prenant soin de ne pas sécher la grille) et ajouter une goutte de 10 μL de la solution PEG-SVA. Incuber les grilles dans une chambre humide pendant au moins 1 h.
   REMARQUE: Cette étape peut être étendue à la nuit. Assurez-vous que l’humidité dans la chambre est suffisante pour empêcher les grilles de se dessécher.
5. Lavez chaque grille trois fois avec 15 μL d’eau stérile. Pour chaque lavage, retirez la majeure partie du liquide de la grille avec une pipette sans laisser sécher la grille, ajoutez 15 μL d’eau douce, incubez pendant au moins 30 s et répétez. Laissez chaque grille dans 15 μL d’eau après le lavage final.

3. Application du gel PLPP

1. Préparez un couvercle de microscope propre pour chaque grille. Effectuez les étapes suivantes pour chaque grille, une grille à la fois, afin de minimiser le risque de dessèchement de la grille.
2. Placez une goutte d’eau de 1,0 μL au centre du couvercle pour aider à placer la grille sur le couvercle et à garder la grille humide. Transférez soigneusement la grille de la goutte d’eau de 15 μL à la goutte d’eau de 1,0 μL sur le couvercle. Assurez-vous de placer le côté carbone de la grille vers le haut.
3. Placez soigneusement un pochoir en polydiméthylsiloxane (PDMS) sur la grille, en prenant soin de garder la grille centrée et de minimiser le contact du pochoir avec la feuille de carbone de la grille.
4. Ajouter 1,0 μL de gel de chlorure de 4-benzoylbenzyl-triméthylammonium (PLPP) sur la grille. Pipette douce pour mélanger (ne touchez pas la grille avec la pointe de la pipette).
5. Déplacez le couvercle avec la grille vers un endroit sombre pour sécher. Le gel séchera en environ 15-30 min.

4. Étalonnage et conception du micromodèle

1. Colorez un côté d’un couvercle en verre avec un surligneur. Ajoutez des lignes noires à partir d’un marqueur permanent à pointe fine pour faciliter la mise au point. Placez le couvercle sur le microscope de manière à ce que le côté coloré fasse face à la lentille de l’objectif. En utilisant le mode champ lumineux, concentrez-vous sur le surligneur.
2. Assurez-vous que le microscope et le système de micromoptrie sont sous tension et que le trajet de lumière correct est défini. Ouvrez Micromanager et le logiciel Leonardo (Plugins > Leonardo) sur l’ordinateur du microscope.
3. Sélectionnez calibrer et suivez les instructions à l’écran. Ajustez la mise au point du microscope pour que l’image projetée sur la diapositive soit mise au point. Le temps d’exposition peut devoir être réduit. Après l’étalonnage, sélectionnez Modèle maintenant.
4. Enregistrez le rapport micromètre/pixel (μm/px) indiqué sous les données d’étalonnage dans la fenêtre supérieure gauche du programme (Figure 2, zone 1). Utilisez ce rapport pour déterminer le nombre de pixels à utiliser par micromètre lors de la conception d’un motif.
5. Après l’étalonnage, assurez-vous que le logiciel est maintenant ouvert avec une vue en direct en champ clair du microscope. Chargez une grille préparée sur un couvercle (section 3) sur la scène avec la grille faisant face à l’objectif de l’objectif. Positionnez la scène et ajustez la mise au point pour que la grille soit visible dans la fenêtre du logiciel.
6. Mesurez la taille des carrés de grille et des barres de grille en micromètres. Le logiciel comprend une règle activée par le bouton situé dans le coin inférieur gauche pour mesurer la grille (Figure 2, zone 2). Par exemple, les motifs utilisés ici pour une grille de 200 mailles correspondent à ~87 × carrés de grille de 87 μm et à ~36 barres de grille μm.
   REMARQUE: Le logiciel offre une flexibilité dans le redimensionnement des modèles à la volée, de sorte que les inexactitudes mineures dans la mesure peuvent être tolérées.
7. Sur la base des mesures et des ratios ci-dessus, créez des motifs avec n’importe quel logiciel de création d’images. La taille minimale de la caractéristique avec un objectif de 20 × est de 1,2 μm. Les modèles doivent être enregistrés en tant que fichiers .tiff 8 bits non compressés.
   1. Assurez-vous que le logiciel ne redimensionne pas les images à une taille de pixel différente lors de l’enregistrement. Le motif doit tenir dans une boîte de 800 × 800 pixels, suffisante pour couvrir quatre carrés de grille.
      REMARQUE: Les pixels d’une valeur de 255 (blanc) seront modelés à l’intensité la plus élevée (dose totale du laser) et les pixels avec une valeur de zéro (noir) ne seront pas modelés. Tous les pixels ayant une valeur intermédiaire seront modelés avec une dose d’environ (X/255)*dose totale. Dans la figure 3A, des valeurs de pixels de 255 et 129 ont été utilisées pour les motifs en niveaux de gris. Une fois le motif conçu, il peut être enregistré et réutilisé sans modification.

5. Micromodèlement

1. Après l’étalonnage, assurez-vous que le logiciel est maintenant ouvert avec une vue en direct en champ clair du microscope. Chargez une grille préparée sur un couvercle (section 3) sur la scène avec la grille faisant face à l’objectif de l’objectif. Positionnez la scène et ajustez la mise au point pour voir la grille dans le logiciel.
2. Pour une première exécution, concevez un nouveau modèle. Dans le logiciel, sélectionnez Ajouter un retour sur investissement (non affiché, à l’emplacement de la zone 3 de la figure 2 ) et choisissez un cercle de 3 000 μm. Positionnez le roi du cercle sur la grille en utilisant l’image en fond clair à l’écran comme guide. Appuyez sur verrouiller pour sécuriser le retour sur investissement.
3. Après avoir verrouillé le retour sur investissement en place, sélectionnez Ajouter un modèle (non affiché, à l’emplacement de la zone 3 de la figure 2 ). Choisissez le motif conçu dans la section 4. Divisez la grille en six régions pour permettre une focalisation et un positionnement indépendants dans chaque région afin de prendre en compte les grilles inégales. Une région carrée de grille de 8 × 8 pour chaque coin de la grille et une région carrée de grille de 2 × 8 de chaque côté du centre, laissant le centre quatre carrés de grille sans motif (Figure 2, image centrale).
4. Utilisez les options de réplication (Figure 2, zone 4) pour générer des copies du modèle initial afin d’atteindre le nombre total souhaité de copies du modèle. Ajustez l’espacement entre les copies pour qu’il corresponde à l’espacement entre les carrés de la grille si nécessaire.
5. Définissez la dose totale pour le modèle. 30 mJ/^mm2 est un bon point de départ. Voir la section de discussion pour plus de détails.
6. Sous Options expert (Figure 2, zone 4), ajustez l’angle de la région pour qu’il corresponde à celui des carrés de la grille. Les régions peuvent être repositionnées à l’aide de la souris. Le rapport (taille) des motifs peut également être ajusté. Itérez en ajustant l’angle, la position, l’espace entre et le rapport du motif jusqu’à ce que les motifs s’alignent avec les carrés de la grille. Déplacez l’étage du microscope pour modifier la région de la grille dans l’affichage en champ lumineux en direct.
7. Appuyez sur Verrouiller pour enregistrer les modifications apportées à la région.
8. Pour copier une région, cliquez sur le bouton Dupliquer (Figure 2, zone 5, icône de deux feuilles de papier) en regard de son nom dans le panneau Actions à gauche. Pour repositionner, renommer ou modifier la copie, cliquez sur son nom dans le panneau Action.
9. Répétez les étapes 5.4 à 5.9 si nécessaire pour remplir toutes les régions souhaitées.
10. Une fois le modèle complet conçu et positionné, enregistrez le fichier de modèle dans le logiciel (Figure 2, zone 6, barre avec icône de flèche vers le haut dans la barre d’outils supérieure).
11. Lors du chargement d’un modèle précédemment enregistré (barre avec icône en forme de flèche vers le bas), centrez le retour sur investissement sur la grille et appuyez sur Verrouiller. Cliquez sur chaque région du panneau d’action pour modifier l’angle, la position, la dose et/ou le fichier de motif.
12. Une fois le modèle et les modèles positionnés, décochez toutes les régions sauf une dans le panneau d’action du logiciel.
13. Utilisez l’étage du microscope pour naviguer vers cette région et vous concentrer sur la feuille de carbone. Cliquez sur l’icône Globe oculaire dans le panneau Action (Figure 2, zone 5) pour activer ou désactiver l’affichage de la superposition de motifs.
14. Une fois que la grille est mise au point, fermez l’obturateur de champ lumineux et appuyez sur l’icône Lecture dans le coin inférieur droit du logiciel pour commencer le processus de modelage, qui peut être surveillé en direct.
15. Dans le panneau d’action, cochez la case correspondant à la région suivante. Ouvrez l’obturateur à fond clair pour que la grille soit visible et centrez cette région à l’aide de l’étage du microscope. Répétez les étapes 5.13 à 5.14 pour chaque région du Panneau d’action.
16. Retirez le couvercle avec la grille du microscope et pipetez immédiatement 10 μL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) sur la grille.
17. Après 10 min, retirez le pochoir avec une pince à épiler, puis lavez la grille 3x avec 15 μL de PBS. Après le lavage final, placez chaque grille dans 15 μL de PBS et déplacez les grilles dans un endroit sombre.

6. Dépôt de protéines ECM

1. Pour les cellules cultivées, suivez les étapes 6.2 à 6.5; pour les neurones primaires de la drosophile , suivez les étapes 6.6-6.10.
2. Préparez au moins 15 μL d’ECM pour chaque grille. Pour les cellules BEAS-2B, préparer une concentration finale de 0,01 mg/mL de fibronectine bovine et de 0,01 mg/mL de fibrinogène conjugué au fluorophore dans du PBS stérile. Pour les cellules HeLa, préparer 0,01 mg/mL de collagène bovin I et 0,1 mg/mL de fibrinogène conjugué au fluorophore dans du PBS stérile.
3. Retirez la majeure partie du PBS de chaque grille et appliquez 15 μL de l’ECM. Incuber la grille dans une chambre humide à température ambiante pendant au moins 1 h.
   REMARQUE: Cette étape peut être prolongée jusqu’à la nuit à 4 ° C.
4. Après incubation en ECM, lavez chaque grille 5x avec du PBS stérile. Pour chaque lavage, retirez la majeure partie du liquide avec une pipette sans laisser sécher la grille, ajoutez 15 μL de PBS frais, incubez pendant au moins 30 s et répétez. Laissez chaque grille dans PBS après le lavage final.
   REMARQUE: Les grilles peuvent être stockées jusqu’à une semaine dans PBS à 4 ° C sans détérioration observée de la qualité.
5. Utilisez un microscope à fluorescence pour détecter le fluorophore dans l’ECM afin de confirmer le motif et que la feuille de carbone est restée intacte. Quelques carrés cassés sont généralement tolérables.
6. Pour les neurones primaires de la drosophile , déplacez les grilles à motifs vers un plat en verre de 30 mm contenant du PBS stérile.
7. Aspirer le PBS de la boîte et appliquer 2 mL de concanavaline A conjuguée au fluorophore de 0,5 mg/mL. Incuber pendant la nuit à 25 °C dans un environnement stérile.
8. Retirez la solution de concanlarine A du plat (sans sécher les grilles) et lavez les grilles 3x avec du PBS. Pour chaque lavage, ajoutez et retirez 2 mL de PBS du plat.
9. Utilisez un microscope à fluorescence pour détecter le fluorophore dans l’ECM afin de confirmer le motif et que la feuille de carbone est restée intacte. Quelques carrés cassés sont généralement tolérables.
10. Après le lavage final, retirer le PBS de la cuvette inférieure en verre et ajouter 2 mL de milieux de drosophila de Schneider fraîchement préparés et filtrés ^stériles21, contenant 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 5 μg/mL d’insuline, 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 10 μg/mL de tétracycline. Incuber à 25 °C dans un environnement stérile jusqu’à ce que les neurones soient prêts à être plaqués.

7. Préparation des cellules primaires de la drosophile avant l’ensemencement

1. Stériliser une boîte de dissection de 55 mm avec 70 % d’EtOH, puis ajouter à la parabole 2-3 mL de solution saline de dissection stérile 1× filtrée (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM _NaH2PO4, 0,22 mM _KH2PO4, 3,3 mM de glucose, 43,8 mM de saccharose)²¹.
2. Cueillez doucement 30 à 40 larves du ^3e stade dans la nourriture à l’aide d’une pince à épiler.
3. Placez les larves dans le tube avec 1× PBS, puis transférez-les dans le deuxième tube avec 1× PBS pour laver les larves.
4. Transférez les larves dans le tube avec 70% d’EtOH pour laver le PBS, puis transférez-les dans le deuxième tube avec 70% d’EtOH. Laissez les larves dans le deuxième tube pendant 2-3 min pour stériliser les larves.
5. Transférer les larves dans un tube avec une solution saline de dissection 1× puis les transférer immédiatement dans le deuxième tube avec une solution saline de dissection 1×.
6. Transférer les larves individuelles sur le plat de dissection contenant 1 × solution saline de dissection. Avec une paire de pinces et un microscope à dissection, déchirez rapidement chaque larve pour extraire le cerveau et transférez-le dans le troisième tube avec une solution saline à dissection 1×. Répétez jusqu’à ce que tous les cerveaux soient extraits.
7. Centrifuger le tube contenant les cerveaux à 300 x g pendant 1 min.
8. Jeter le surnageant, laver avec 1 mL de solution saline de dissection de 1× et centrifuger le tube à 300 x g pendant 1 min. Répétez cette étape une fois de plus.
9. Jeter le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 200-250 μL dans le tube et ajouter 20 μL de 2,5 mg/mL de libérase dans 1x solution saline de dissection.
10. Faire pivoter le tube sur un rotateur pendant 1 h à température ambiante; pendant cette heure, pipettez la solution 25 à 30 fois toutes les 10 minutes. À la fin, la solution doit être légèrement opaque.
11. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min.
12. Jetez le surnageant, puis ajoutez 1 mL de support de Schneider complété. Pipette la solution 30 fois pour mélanger.
13. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min.
14. Jetez le surnageant et lavez la pastille cellulaire en ajoutant 1 mL de support Schneider supplémenté. Pipette la solution 30 fois pour mélanger.
15. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min.
16. Jetez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire avec 300 μL de support de Schneider supplémenté. Pipette la solution 30-40 fois pour mélanger.

8. Culture et infection par le VRS des cellules BEAS-2B et HeLa

1. Maintenir les cellules HeLa et les cellules BEAS-2B dans des flacons T75 à 37 °C et 5 % de _CO2. Cellules de passage tous les 3-4 jours une fois atteignant environ 80% de confluence. Maintenir les cellules HeLa dans DMEM + 10% FBS + 1× Antibiotique-Antimycotique. Maintenir BEAS-2B dans RPMI + 10% FBS + 1× Antibiotique-Antimycotique6,22,23.
2. Pour l’ensemencement des cellules non infectées, passez à la section 9. Les cellules BEAS-2B et HeLa sont sensibles à l’infection par le VRS; Les cellules BEAS-2B ont été utilisées pour toutes les expériences impliquant le VRS présentées ici.
   REMARQUE : Effectuer toutes les étapes BSL-2 conformément aux protocoles institutionnels à l’aide d’une armoire de biosécurité (BSC) et d’un équipement de protection individuelle (EPI) appropriés.
3. Avant l’infection des cellules par le VRS, le passage 5 × ¹⁰⁴ cellules par puits dans une plaque de 6 puits (surface ~ 9,6 ^cm2) avec 2 mL de milieu de croissance et incuber pendant la nuit.
4. Trypsiniser et compter un puits de cellules. Pour essayer, aspirer le milieu d’un puits et laver avec 2 mL de PBS stérile sans ^Mg2+ et ^Ca2+ pour éliminer le milieu résiduel. Ajouter 500 μL de solution de trypsine à 0,25 %. Incuber à 37 °C pendant 5-10 min. Vérifiez périodiquement les cellules pour voir si elles sont libérées de la surface. Une fois les cellules libérées, ajoutez 1,5 mL de milieu de culture.
5. Mélanger 100 μL de cellules trypsinisées avec 100 μL de bleu de trypan. Pipette 10 μL de mélange cellulaire dilué dans un hémocytomètre. Comptez les cellules et calculez le nombre de cellules par puits. Utilisez ce nombre pour calculer le MOI ci-dessous.
6. Préparer une dilution du VRS-A2mK+²⁴ dans les milieux de croissance pour obtenir un MOI de 10 par puits dans 750 μL de milieux. Le MOI du RSV-A2mK+ peut être calculé à partir des titres d’unités de focalisation fluorescente (FFU) du stock (par exemple: pour 1,0 × ¹⁰⁵ cellules par puits et un stock de VRS de 1,0 × ¹⁰⁸ FFU / mL, diluer le stock viral 1: 75 à 1 × ¹⁰⁶ FFU / 750 μL ou 1,33 × ¹⁰⁶ FFU / mL).
7. Aspirer le milieu des cellules dans la boîte à 6 puits et ajouter 750 μL de la solution virale par le haut à chaque puits.
8. Faire basculer la plaque à température ambiante pendant 1 h.
9. Après 1 h, porter le volume total par puits à 2 mL avec un milieu de croissance préchauffé à 37 °C et placer la plaque dans un incubateur réglé à 37 °C avec 5 % de _CO2 pendant 6 h.
10. Trypsiniser les cellules pour les libérer et procéder à l’ensemencement comme décrit ci-dessous. Après l’ensemencement, incuber les grilles pendant 18 heures supplémentaires avant de geler à plonger (pour un total de 24 heures après l’infection).

9. Ensemencement cellulaire sur des grilles à micromotifs

1. Pour les cellules cultivées, suivez les étapes 9.2 à 9.8; pour les neurones primaires de la drosophile , suivre 9.9-9.11.
2. Trypsiniser les cellules pour les libérer (voir étape 4 de la rubrique 8 ci-dessus). Pour réduire l’agrégation cellulaire, trypsiniser les cellules à 60 % ou moins de confluence.
3. Mélanger 100 μL de cellules trypsinisées avec 100 μL de bleu de trypan. Pipette 10 μL du mélange cellulaire dilué dans un hémocytomètre et compter les cellules.
4. Diluer les cellules dans un milieu à 2 × ¹⁰⁴ cellules/mL.
5. Ajouter 1 μL de média au centre d’un plat inférieur en verre de 30 mm pour aider à placer la grille et l’empêcher de sécher. Transférez la grille du PBS sur le couvercle au centre de la parabole inférieure en verre. Ajouter 10 μL de solution cellulaire à la grille.
6. À l’aide d’un microscope à fond clair, observez l’adhérence des cellules à la grille après 5 minutes. Si la majorité des motifs restent inoccupés, ajoutez une goutte supplémentaire de 10 μL de la solution cellulaire. Maintenir les grilles et la solution cellulaire à 37 °C pendant les incubations.
7. Répétez l’étape 9.6 jusqu’à ce que la plupart des modèles soient occupés ou que de nombreux modèles occupés commencent à avoir plusieurs cellules. Incuber la grille pendant 2 h dans l’incubateur (37 °C, 5% de _CO2).
8. Inonder le plat avec 2 mL de milieu préchauffé et incuber toute la nuit (37 °C, 5 % de _CO2).
9. Pour les neurones primaires de la drosophile , retirez le milieu de la boîte contenant une grille et plaquez les cellules sur la boîte.
10. Attendez 30 à 60 minutes que les cellules se fixent, puis ajoutez 2 mL de support de Schneider supplémenté.
11. Cultivez les neurones dans un incubateur à 25 °C pendant au moins 2 à 3 jours avant de geler.

10. Imagerie et vitrification de grilles à motifs

1. Placez la parabole inférieure en verre contenant la grille à motifs et les cellules cultivées sur le microscope à fluorescence.
2. Acquérir des images de la grille en utilisant le champ lumineux et les canaux fluorescents appropriés pour détecter le motif et tout autre marquage dans les cellules. Assurez-vous que la densité et le positionnement des cellules conviennent à l’imagerie et à l’analyse en aval.
   REMARQUE: Les images en champ clair et fluorescentes ont été traitées dans le progiciel ^FIJI25.
3. Préparer un congélateur cryo-plongeur; le type de dispositif de congélation dépendra de la disponibilité, du coût et des caractéristiques les plus appropriées pour l’échantillon.
   REMARQUE: Les neurones primaires de la drosophile ont été préparés sur un congélateur à piston automatisé et les cellules BEAS-2B ont été préparées à l’aide d’un congélateur semi-automatisé.
4. Appliquez des fiducials en or sur les échantillons pour un alignement correct de la série d’inclinaison. Épongez les échantillons pour éliminer l’excès de milieu, puis plongez-congelez les échantillons dans un cryogène, tel que l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide. Pour les neurones primaires de la drosophile , éponger pendant 4 s à partir de l’arrière. Pour les cellules HeLa et BEAS-2B, épongez des deux côtés pendant 4 à 6 s. Les grilles congelées peuvent ensuite être stockées dans de l’azote liquide jusqu’à une utilisation ultérieure.
5. Imagez des cellules vitrifiées dans un cryomicroscope électronique, fonctionnant à 300 kV avec une caméra à détecteur d’électrons direct. Configurez la collecte de séries d’inclinaison pour chaque région d’intérêt avec un logiciel tel que ^SerialEM26 pour la collecte de données cryo-EM/cryo-ET.
   REMARQUE: Des séries d’inclinaison de neurones primaires de la drosophile ont été collectées sur un détecteur d’électrons direct de -60 ° à 60 ° bidirectionnellement à des incréments de 2 ° à -8 μm de mise au point avec une taille de pixel de 4,628 Å pour une dose totale de 70-75 e^-/^Å2. Des séries d’inclinaisons de BEAS-2B infectés par le VRS ont été collectées sur un détecteur d’électrons direct avec un filtre d’énergie (fente de 20 eV) à -5 μm de mise au point avec une taille de pixel de 4,603 Å et une dose totale d’environ 80 e^-/^Å2.
6. Traitez la série d’inclinaison pour reconstruire les tomogrammes.
   REMARQUE: Les tomogrammes présentés ici ont été reconstruits à l’aide du package ^IMOD27; Le filtrage passe-bas a été effectué à l’aide du progiciel ^EMAN228.

Results

Cette procédure a été utilisée pour modéliser des grilles EM pour des expériences de cryo-ET à cellules entières. L’ensemble du flux de travail présenté dans cette étude, y compris les préparations initiales de culture cellulaire, le micromodèlement (Figure 1) et l’imagerie, comprend de 3 à 7 jours. Une procédure en deux étapes a été utilisée pour générer la couche antisalissure en appliquant du PLL sur la grille et en reliant ensuite le PEG par l’ajout du PEG-SVA réactif. La couche antisalissure peut également être appliquée en une seule étape en ajoutant du PLL-g-PEG en une seule incubation. Le gel PLPP est un catalyseur pour le micromodèlement UV, qui est également disponible sous forme de liquide moins concentré. Le gel permet de modeler à une dose significativement réduite par rapport au liquide, ce qui se traduit par un modelage beaucoup plus rapide. Avec ce système, le temps de modélisation réel d’une grille TEM complète était d’environ 2 minutes. Le flux de travail de micromodèlement à lui seul s’étend généralement sur 5 à 6 heures et permet à un individu de modeler huit grilles pour la culture cellulaire standard sur des grilles TEM.

Un certain nombre d’étapes du processus de micromodélisation nécessitent de longs temps d’incubation (voir les étapes 2.1, 2.3, 6.4). De manière pratique, certaines de ces étapes, telles que la passivation PLL (2.1) ou la passivation PEG-SVA (2.3), peuvent être étendues à une incubation de nuit. De plus, les grilles peuvent être modelées à l’avance et stockées dans une solution de la protéine ECM ou PBS pour une utilisation ultérieure. Dans notre étude, ces options étaient précieuses dans les cas où le moment de la préparation et de l’ensemencement des cellules est critique, tels que les neurones primaires de la drosophile et l’infection par le VRS des cellules BEAS-2B.

Les grilles ont été préparées dans un laboratoire général de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) à l’aide d’outils propres, de solutions stériles et incluaient des antibiotiques / antimycotiques dans les milieux de croissance6,22,29,30. Pour les échantillons particulièrement sensibles à la contamination microbienne, la couche antisalissure et l’ECM peuvent être appliqués dans une hotte de culture tissulaire ou dans un autre environnement stérile. De plus, la grille pourrait être lavée à l’éthanol entre le modelage et l’application ECM. Si vous travaillez avec des agents infectieux, il est important d’adapter la procédure pour se conformer aux protocoles de biosécurité appropriés.

Ce flux de travail et les procédures présentées (Figure 1) ont permis aux cellules HeLa (Figure 4), aux cellules BEAS-2B infectées par le VRS (Figure 3, Figure 5) et aux neurones larvaires primaires de la drosophile (Figure 6, Figure 7) d’être ensemencés sur des grilles EM à motifs pour une collecte optimale de données cryo-ET.

Les cellules HeLa ensemencées sur des grilles TEM à micromotifs restent viables, telles que déterminées par coloration fluorescente à l’aide d’un test de viabilité cellulaire à base de vélcéine-AM et d’homodimère-1 à base d’éthidium (figure 4A, B). En utilisant un ECM mixte de collagène et de fibrinogène, les cellules HeLa adhèrent facilement à des motifs à travers la grille (Figure 4A, C). La morphologie globale des cellules qui se dilatent le long du motif est similaire à celle des cellules cultivées sur des grilles non modelées (Figure 4C,D). Dans le cas des cellules HeLa, l’épaisseur totale de la cellule reste ~< 10 μm avec des zones significativement plus minces ~< 1 μm d’épaisseur près de la périphérie de la cellule (Figure 4E,F).

Pour les études sur le VRS, nous avons modelé des carrés de grille entiers à l’aide d’un gradient, avec une exposition à faible dose sur les bords et un modèle de dose plus élevée vers le centre (Figure 3A). Les modèles de gradient ont donné de meilleurs résultats lors de la recherche de virus libérés présents près de la périphérie des cellules. Avec ces modèles, il a été constaté que les cellules adhèrent préférentiellement à la concentration d’ECM plus élevée, mais sont également capables d’adhérer et de se développer sur les concentrations d’ECM plus faibles. La dose relative entre les zones devra être optimisée lors de l’utilisation de modèles nécessitant plusieurs doses. Si les doses et donc les concentrations d’ECM sont trop similaires ou trop disparates les unes aux autres, l’effet de l’utilisation de doses multiples sera perdu.

Dans la figure 3, une grille TEM a été modelée puis ensemencée avec des cellules BEAS-2B infectées par le VRS et utilisée pour la collecte de données cryo-EM. La figure 4A est une image fluorescente d’ECM modelée sur une grille TEM à l’aide d’un motif de gradient. L’adhésion et la croissance des cellules le long de la région centrale du motif peuvent être vues à la figure 3B comme une image en champ clair des cellules 18 heures après l’ensemencement. Dans la figure 3C, le signal fluorescent (rouge) de la réplication du RSV-A2mK+ est superposé au signal de l’ECM. La majorité des cellules infectées sont positionnées le long de la région centrale de densité plus élevée du modèle de gradient. Une carte TEM à faible mag de la grille après cryofixation révèle un certain nombre de cellules, y compris des cellules infectées par le VRS, positionnées sur la feuille de carbone près du centre des carrés de la grille. Comme on l’a vu précédemment pour les cellules cultivées sur des grilles TEM ^standard22, des séries d’inclinaisons ont été localisées et collectées de virions VRS à proximité immédiate de la périphérie de cellules BEAS-2B infectées cultivées sur des grilles à micromotifs (Figure 5A, B). De nombreuses protéines structurelles du VRS peuvent être identifiées dans les tomogrammes, y compris la nucléocapside (N) et la protéine de fusion virale (F) (figure 5C, flèches bleues et rouges respectivement).

Pour les études primaires sur les neurones de la drosophile, il a été constaté que le motif étroit, proche de la limite de résolution offerte par le logiciel (où l’épaisseur du motif était de 2 μm), permettait d’isoler d’une à quelques cellules dans un carré de grille (Figure 6). Le soma neuronal a pu étendre ses neurites sur une période de plusieurs jours dans le schéma. Cela a permis d’identifier facilement et d’acquérir des séries d’inclinaison des neurites par rapport aux neurones cultivés sur des grilles non modélisées (Figure 7). Il a également été constaté que la concanavaline A marquée par fluorescence, une lectine qui a été utilisée comme ECM pour les cultures neuronales in vitro de drosophiles20,21, se prête à la modélisation.

Les neurones de la drosophile des larves du troisième stade ont été isolés selon des protocoles précédemment publiés20,21,31. Les préparations neuronales ont été appliquées à des grilles cryo-EM à micromoptries où la concanovarine A a été déposée sur le motif pour réguler le placement, la propagation et l’organisation des cellules. Les neurones sur des grilles à motifs ou sans motifs ont été autorisés à incuber pendant au moins 48 à 72 heures, et les grilles ont ensuite été gelées. Une image représentative d’une grille EM à micromotifs avec plusieurs neurones de drosophile répartis dans les régions à motifs est montrée à la figure 6A. Ces neurones, dérivés d’une souche de mouche transgénique qui a une expression GFP pan-neuronale dans la membrane, peuvent être facilement suivis par microscopie optique non seulement en raison de son marquage fluorescent, mais aussi en raison de son emplacement dans les micromotifs. Alors que les neurones cultivés sur des grilles non modelées peuvent également être suivis grâce à sa signalisation GFP par microscopie optique (Figure 7A, cercle jaune), leur localisation dans cryo-EM est devenue beaucoup plus difficile en raison de la présence de débris cellulaires et de la contamination par le milieu (Figure 7B, cercle jaune). Une telle présence a été réduite pour les neurones sur des grilles à motifs, probablement en raison du PEG dans la couche antisalissure des régions non modelées repoussant les débris cellulaires à adhérer. En raison des dimensions du corps cellulaire des neurones et des neurites étendues (Figure 6A, B, cercle jaune), des séries d’inclinaison cryo-ET ont été collectées le long de régions plus minces des cellules (Figure 6C, D, cercle rouge). La membrane cellulaire neuronale, une mitochondrie (cyan), des microtubules (violet), des filaments d’actine (bleu), des structures vésiculaires (orange et vert) et des macromolécules telles que les ribosomes (rouge) ont été bien résolues dans des montages d’images et des tranches à grossissement plus élevé à travers le tomogramme 3D (Figure 6E). Bien que des caractéristiques subcellulaires similaires puissent être observées à partir de tomogrammes 3D de neurones non modélisés (figure 7E), la difficulté de localiser des cibles cellulaires viables pour la collecte de données a considérablement réduit le débit.

Dans la figure 8, des images représentatives de grilles présentant certains de ces problèmes ont été assemblées pour faciliter leur identification et leur dépannage. Une fois les conditions optimales déterminées, le micromodèlement est une méthode fiable et reproductible pour le positionnement des cellules sur des grilles pour cryo-TEM.

Figure 1 : Flux de travail général du micromodèlement pour cryo-EM. Le flux de travail peut être grossièrement divisé en quatre parties: préparation de la grille, micromodélisation, ECM et ensemencement cellulaire, et cryo-préparation et collecte de données. Les principales étapes de chaque section sont énumérées sous les titres et le temps approximatif pour terminer chaque section est indiqué à gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Capture d’écran du logiciel avec motif positionné sur la grille. La zone 1 contient le rapport μm/pix pour la conception de motifs. La zone 2 est la règle de mesure d’une grille. La zone 3 est l’endroit où ajouter ou modifier des modèles et des rois. La zone 4 contient toutes les informations pour le positionnement du motif et la dose. La zone 5 contient des options pour les modèles, notamment le basculement des superpositions, la copie ou la suppression de motifs et la sélection de modèles pour le micromodèlement. La zone 6 est l’endroit où les modèles peuvent être enregistrés et chargés. Des vues plus grandes des zones 4 et 5 sont présentées ci-dessous pour plus de clarté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Cellules BEAS-2B infectées par le VRS sur la grille cryo-TEM à motifs. (A) Image fluorescente de la grille à motifs après ajout d’ECM marqué par fluorescence. Le modèle d’entrée est affiché dans le coin inférieur gauche. (B) Image en champ clair de cellules BEAS-2B cultivées sur la grille en A. (C) Fusion de l’image en A (cyan) et B (gris) avec l’image fluorescente de cellules infectées par le VRS (rouge) immédiatement avant le gel à piston; les cellules infectées expriment mKate-2. Les barres d’échelle sont de 500 μm. (D) Carte cryo-TEM à faible grossissement de la grille en B après congélation. Les images fluorescentes sont pseudocolores. Les barres d’échelle sont de 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Coloration vivante/morte de cellules à motifs et sans motifs. (A) Image fluorescente de cellules HeLa cultivées sur une grille à motifs et colorées avec de la calcéine-AM (coloration des cellules vivantes, vert) et de l’homodimère d’éthidium-1 (coloration des cellules mortes, rouge). (B) Cellules HeLa cultivées sur une grille non modelée et colorées comme dans A. (C) Projection de piles z confocales d’une cellule HeLa sur une grille Quantifoil R2/2 à motifs avec 0,01 mg/mL de collagène et fibrinogène 647 ECM (rouge). La cellule a été colorée avec de la calcéine-AM (vert) et hoechst-33342 (bleu). (D) Cellules HeLa sur grille non modelée incubées avec 0,01 mg/mL de collagène et de fibrinogène 647 ECM, incubées et colorées avec de la calcéine-AM et du Hoecsht-33342. Les images fluorescentes ont été fusionnées avec la lumière transmise (niveaux de gris). (E) Projection X,Z de C. (F) X,Z projection de D. Les images sont pseudocolores. Les barres d’échelle en (A) et (B) sont de 500 μm; les barres d’échelle en (C) - (F) sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Cryo-ET de la cellule BEAS-2B infectée par le VRS sur la grille cryo-TEM à motifs. (A) Carte carrée de la grille Cryo-EM de la cellule BEAS-2B infectée par le VRS. La limite approximative de la cellule est indiquée par la ligne verte pointillée. (B) Image de plus haute résolution de la zone encadrée en rouge en (A). La limite approximative de la cellule est indiquée par une ligne verte pointillée. Les virions du VRS peuvent être vus près de la périphérie de la cellule (flèche blanche et boîte jaune). (C) Tranche z unique à partir du tomogramme collecté dans la zone de la boîte jaune en (B). Les flèches rouges pointent vers la protéine de fusion RSV F, les flèches bleues pointent vers le complexe ribonucléoprotéique (RNP). Les barres d’échelle en (A)-(C) sont incorporées dans l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Neurones primaires dérivés du cerveau des larves de Drosophila melanogaster de la 3e étoile sur la grille cryo-TEM à motifs. (A) Montage superposé de grille de microscopie à fluorescence de cellules vivantes de neurones de drosophiles exprimant une GFP ciblée sur membrane sur des carrés de grille à motifs avec une concanavaline fluorescente de 0,5 mg / mL A. Green: neurones de la drosophile. Bleu : Photomoulus. (B) Montage d’image cryo-EM de la grille en (A) après cryo-conservation. Le cercle jaune note le même carré de grille que dans (A). (C) Montage d’image Cryo-EM du carré mis en évidence par le cercle jaune en (A) et (B). (D) Image à grossissement plus élevé de la zone délimitée par le cercle rouge en (C), où une série d’inclinaison a été recueillie sur les neurites de la cellule. E. Tranche de 25 nm d’épaisseur d’un tomogramme reconstruit à partir de la série d’inclinaison acquise à partir du cercle rouge en (C). Divers organites peuvent être vus dans ce tomogramme, tels que les mitochondries (cyan), les microtubules (violet), les vésicules centrales denses (orange), les vésicules claires (vert), le réticulum endoplasmique (jaune) et l’actine (bleu). Des macromolécules, telles que les ribosomes (rouges), peuvent également être vues dans le coin supérieur droit. Les images fluorescentes sont pseudocolores. Les barres d’échelle en (A)-(E) sont incorporées dans l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Neurones primaires dérivés du cerveau des larves de Drosophila melanogaster de la 3e étoile sur des grilles non modelées. (A) Montage en grille de microscopie à fluorescence de cellules vivantes de neurones de drosophiles exprimant une GFP ciblée par membrane sur des carrés de grille avec 0,5 mg / mL de concanavaline A. Green: neurones de la drosophile. (B) Montage de grille cryo-EM de la même grille en (A) après congélation par immersion. Le cercle jaune montre le même carré de grille que dans (A). Notez la présence de débris cellulaires et la contamination des milieux, ce qui a rendu l’identification de la cible difficile par rapport aux grilles à motifs. (C) Montage d’images Cryo-EM du carré mis en évidence par les cercles jaunes dans les cartes (A) et (B). (D) Image à grossissement plus élevé de la zone délimitée par le cercle rouge en (C), où une série d’inclinaison a été recueillie sur les neurites de la cellule. (E) tranche de 25 nm d’épaisseur du tomogramme reconstruit à partir de la série d’inclinaison de (C) et (D). Un certain nombre d’organites sont visibles dans ce tomogramme, tels que les microtubules (violet), l’actine (bleu), le réticulum endoplasmique (jaune) et les vésicules centrales denses (orange). Des macromolécules, telles que les ribosomes (rouges), peuvent également être vues. Les images fluorescentes sont pseudocolores. Les barres d’échelle en (A)-(E) sont incorporées dans l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Exemples de problèmes possibles avec les modèles. Images fluorescentes d’ECM marqués déposés sur des grilles à micromotifs. (A) Motifs inégaux sur le réseau en raison de la distribution inégale du gel PLPP. (B) L’ECM ne peut pas adhérer aux zones couvertes par le pochoir PDMS pendant le modelage. (C) Motif de gradient saturé (côté droit) ou inversé (gauche) sur une grille à motif avec une dose totale trop élevée. (D) L’ECM adhère aux zones des barres de grille ainsi qu’à la zone à motifs en raison des réflexions du laser UV pendant le modelage. Les images sont pseudocolores; le modèle d’entrée est indiqué en bas à gauche; les barres d’échelle sont de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Émettre	Cause(s) potentielle(s)	Dépannage
Micromodèlement
Impossible de voir l’éclairage du laser PRIMO	• Le chemin de la lumière n’est pas configuré correctement	• Vérifiez que le chemin de la lumière du microscope est correctement configuré
	• Le laser PRIMO n’est pas allumé ou le laser est imbriqué
De nombreux carrés de grille cassés	• Toucher une feuille de grille avec une pince à épiler ou une pipette lors de la manipulation	• Manipulez les grilles avec soin
	• Grille séchée pendant les incubations ou le lavage	• Ne laissez pas la grille sécher pendant les lavages et les incubations
Grandes zones non protégées	• Couverture gel insuffisante	• Assurez-vous que le gel se propage uniformément sur la grille tout en ajoutant
	• Feuille de grille floue pendant le modelage	• Ajouter un microlitre de gel supplémentaire
	•Surface couverte par un pochoir	• Vérifiez le focus avant de modéliser chaque région
		• Grille soigneusement centrée au pochoir
Motif saturé ou inversé	• Dose incorrecte	• Essayez une gamme de doses totales pour le modèle
	• Couverture gel insuffisante	• S’assurer que la grille est uniformément recouverte de gel
		• Essayez différentes valeurs pour les motifs en niveaux de gris
Motif flou	• Mauvaise mise au point pendant la modélisation	• Répétez l’étalonnage PRIMO à la même hauteur que l’échantillon
	• Calibrage incorrect	• Concentrez-vous sur la feuille de grille avant le motif
		• Diviser le modèle en régions supplémentaires pour le modèle
ECM adhérant en dehors du modèle	• Reflets du gel ou de la poussière	• Assurez-vous que le gel est sec avant le modelage
		• Assurez-vous que le couvercle et l’objectif sont propres
ECM non visible après le modelage	• Blanchiment photo	• Minimiser l’exposition à la lumière à l’ECM avant l’imagerie
	• Dose incorrecte pendant le modelage	• Essayez une gamme de valeurs de dose totale pour le modèle
	• Temps d’incubation ECM insuffisant	• Augmenter le temps d’incubation pour l’ECM
Ensemencement cellulaire
Cellules qui s’agglutinent	• Sur digestion	• Utiliser un pourcentage plus faible de trypsine ou le temps de libération des cellules adhérentes
	• Haute densité cellulaire	• Cellules de passage et/ou de digestion à faible confluence
		• Ne pas agiter les cellules pendant la libération
		• Pipeter doucement la solution de cellules ou utiliser des passoires à cellules
Cellules n’adhérant pas aux zones à motifs	• L’ECM ne convient pas au type de cellule	• Essayez différentes concentrations et compositions ECM
	• La viabilité des cellules est diminuée avant l’ensemencement	• S’assurer que les conditions de culture cellulaire et de libération cellulaire n’endommagent pas les cellules
Cellules ne se dilatant pas après l’adhésion	• ECM ou modèle ne convient pas au type de cellule	• Essayez différents modèles et ECM
		• Dans certains cas, une feuille plus continue (R1.2/20 vs R2/1) peut favoriser l’expansion cellulaire

Tableau 1 : Problèmes potentiels lors du micromodèlement. Ce tableau décrit certains problèmes qu’un utilisateur peut rencontrer lors du micromodèlement ou de l’ensemencement cellulaire. Les causes potentielles et le dépannage sont fournis pour chaque problème. Des images représentatives de certains problèmes peuvent être vues à la figure 8.

Discussion

Les microscopes électroniques et les progiciels modernes et avancés prennent désormais en charge la collecte automatisée de données cryo-EM et cryo-ET rationalisées où des centaines à des milliers de positions peuvent être ciblées et imagées en quelques ^{jours32,33,34,35}. Un facteur limitant important pour les flux de travail cryo-ET à cellules entières a été l’obtention d’un nombre suffisant de cibles collectables par grille. Récemment, un certain nombre de groupes ont développé des protocoles pour les grilles de micromoptulation pour la cryo-EM, l’un des avantages étant l’amélioration de l’efficacité de la collecte de données16,17,18. Ici, un protocole est présenté pour l’utilisation d’un système de micromoptrie disponible dans le commerce pour micromotifs tem grilles pour les études cryo-ET des neurones primaires de la drosophile et des lignées cellulaires humaines cultivées (non infectées ou infectées par le VRS). Ce système de micromodèlement est polyvalent et de nombreuses étapes peuvent être optimisées et adaptées pour répondre à des objectifs expérimentaux spécifiques. Un utilisateur ayant une expérience de la TEM et de la microscopie à fluorescence peut rapidement acquérir des compétences en préparation de grille et en micromodèlement. Avec une pratique minutieuse, de bons résultats devraient être réalisables après quelques itérations. Ci-dessous, certaines des options disponibles, les considérations de l’utilisateur, les avantages potentiels et les applications futures du micromodèle pour cryo-EM sont discutés.

L’une des considérations importantes pour la cryo-ET à cellules entières est la sélection de la grille EM. Les grilles EM sont composées de deux parties: un cadre en maille (ou support structurel) et la feuille (ou film), qui est la surface du film continu ou troué sur lequel les cellules vont se développer. Les grilles de mailles de cuivre sont couramment utilisées pour la cryo-EM de protéines et de complexes isolés. Cependant, ils ne conviennent pas à la cryo-ET à cellules entières en raison de la cytotoxicité du cuivre. Au lieu de cela, un maillage d’or est couramment utilisé pour la tomographie cellulaire. D’autres options incluent le nickel ou le titane, qui peuvent offrir des avantages par rapport à l’or, tels qu’une rigidité ^accrue16. Les grilles EM sont disponibles avec différentes dimensions de maillage pour prendre en charge une gamme d’applications. Des maillages plus grands offrent plus d’espace aux cellules pour se développer entre les barres de grille et plus de zones qui se prêtent à la collecte de séries d’inclinaison, mais au prix d’une fragilité globale accrue des spécimens. La feuille la plus couramment utilisée est le carbone amorphe perforé ou troué, tel que les Quantifoils ou les grilles C-flat. Les cibles biologiques peuvent être imagées soit à travers les trous dans le carbone, soit à travers le carbone translucide électronique. Les grilles telles que R 2/1 ou R 2/2, où les trous ont une largeur de 2 μm et sont espacés respectivement de 1 et 2 μm, fournissent un grand nombre de trous et donc un grand nombre de zones potentielles pour la collecte de données. Cependant, certaines cellules peuvent se développer et se développer mieux sur des surfaces plus uniformes telles que les grilles R 1.2/20 ou le carbone continu. Pour le traitement des échantillons en aval par broyage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB), la feuille est retirée par fraisage, ce qui réduit les inquiétudes quant à la présence continue du film sous-jacent. Comme pour le maillage, des feuilles d’autres matériaux sont également disponibles, le protocole de motif présenté ici étant également adapté aux grilles _SiO2 . Les grilles couramment utilisées comprennent le Quantifoil d’or, le carbone continu ou les grilles à 200 mailles à film _SiO2 (espacement d’environ 90 μm entre les barres de grille) pour le cryo-ET à cellules entières.

Il existe un certain nombre de considérations lors de la conception d’un modèle. La majorité de ces décisions sont guidées par le type de cellule et le but de l’expérience. Un bon point de départ est de choisir un motif qui se rapproche de la forme et des dimensions des cellules en culture. De nombreuses études ont démontré des effets significatifs de la forme du motif sur la croissance cellulaire et l’arrangement du cytosquelette13,36,37. Une attention particulière doit être prise lors de la conception du modèle si cela pourrait modifier la cible d’intérêt. Plusieurs modèles pour chaque type de cellule ont été testés pour déterminer quels modèles favorisaient l’adhésion et la croissance cellulaires. La flexibilité du système de micromotilage permet de tester plusieurs modèles sur une seule grille et de modifier les modèles pour différentes grilles au sein d’une même expérience. Des motifs plus grands (~ 50-90 μm), tels que ceux utilisés ici, augmentent la probabilité que plusieurs cellules adhèrent à une seule région du motif et permettent aux cellules de se dilater et de s’étendre après l’adhésion. Des modèles plus contraints (20-30 μm) peuvent être appropriés dans les expériences où l’isolement cellulaire est plus critique que l’expansion cellulaire, comme pour les expériences de fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB). Pour les applications de tomographie, il peut être nécessaire de tenir compte de l’impact de l’axe d’inclinaison. Si un motif est positionné de telle sorte que toutes les cellules se développent parallèlement les unes aux autres dans une seule direction, il est possible que toutes les cellules soient perpendiculaires à l’axe d’inclinaison lorsqu’elles sont chargées sur l’étage du microscope, ce qui entraîne une qualité inférieure des données.

Sur les grilles non modélisées, les cellules adhèrent souvent préférentiellement aux barres de grille, où elles ne peuvent pas être imagées par TEM. Même sur les grilles à motifs, on observe souvent que les cellules sont positionnées dans les coins des carrés de grille partiellement sur la feuille de carbone à motifs et la barre de grille. Récemment, le micromodèlement a été utilisé pour positionner intentionnellement une partie de la cellule sur la barre de ^grille18. Cela pourrait être envisagé pour les expériences où il n’est pas essentiel d’avoir toute la périphérie de la cellule sur la feuille. Cela peut être particulièrement important pour les cellules qui peuvent devenir plus grandes qu’un seul carré de grille, comme les neurones primaires qui se développent sur plusieurs jours.

Il existe de nombreux outils qui peuvent être utilisés pour concevoir un motif. Ici, le motif a été limité à moins de 800 pixels dans n’importe quelle dimension, de sorte que le motif peut être tourné à n’importe quel angle tout en s’adaptant à la zone maximale pouvant être modelée en une seule projection par ce système de micromotifs. Cela permet à l’utilisateur de faire pivoter le motif pour qu’il soit correctement orienté avec la grille, quelle que soit l’orientation de la grille sur le microscope. Ici, la grille a été divisée en six zones de motifs. Principalement, cela permet l’ajustement de la mise au point entre différentes régions de la grille. Les grilles d’or, en particulier, sont très malléables et peuvent ne pas se poser complètement à plat sur le verre. Une bonne concentration est essentielle pour des résultats de motifs propres et raffinés. En utilisant des motifs segmentés, seuls des ajustements mineurs de la position du motif doivent être effectués si la grille se déplace légèrement pendant le processus de motif, bien que ce ne soit généralement pas un problème lors de l’utilisation du gel PLPP avec les pochoirs PDMS. Enfin, les quatre carrés centraux de la grille sont restés sans motif. Cela permet à un utilisateur d’identifier clairement le centre de la grille, ce qui est très utile pour les expériences d’imagerie corrélative.

Le logiciel de modélisation de ce système de micromotège, Leonardo, possède également des fonctionnalités plus avancées telles que l’assemblage et la possibilité d’importer des motifs au format PDF, qui dépassent le cadre de ce protocole. Ce logiciel comprend également la détection de microstructures et le positionnement automatisé des motifs qui peuvent être utilisés sur les grilles TEM. Cette fonctionnalité est particulièrement utile lorsque la grille est très plate et peut être modelée sans qu’il soit nécessaire d’ajuster la mise au point entre différentes zones.

La sélection d’une protéine ECM peut avoir un impact significatif sur l’adhésion et l’expansion cellulaires. Certaines cellules sont connues pour subir des changements physiologiques lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats ^{spécifiques38}. Plusieurs protéines et concentrations ECM ont été testées pour tout nouveau type de cellule sur la base de travaux antérieurs rapportés dans la littérature. La laminine, le fibrinogène, la fibronectine et le collagène sont largement utilisés pour les cellules cultivées et peuvent être utilisés comme point de départ si d’autres données ne sont pas disponibles. Cependant, d’autres protéines ECM doivent également être envisagées si les protéines ECM couramment utilisées ne confèrent pas les propriétés d’adhérence appropriées aux cellules. Cela était particulièrement vrai pour les neurones primaires de la drosophile , car une forte concentration de la lectine végétale concanavaline A était nécessaire pour une bonne adhérence cellulaire. La compatibilité de l’adhésion et de la croissance cellulaires avec l’ECM peut être testée en modelant sur des plats en verre ou des lames avant la transition vers les grilles TEM. Cette approche de présélection est rapide et rentable si un grand nombre de combinaisons doivent être examinées. L’inclusion d’une protéine ECM conjuguée par fluorescence est précieuse pour évaluer le succès et la qualité du motif.

L’ensemencement cellulaire est l’une des étapes les plus importantes pour la cryo-ET de cellules entières, avec ou sans micromotif6,16,39. Pour la drosophile primaire ou d’autres neurones, qui sont fragiles, instables en suspension et peuvent être limités en quantité, les approches d’ensemencement unique sont préférées à l’ensemencement cellulaire séquentiel surveillé. Une seule étape d’ensemencement à une densité cellulaire optimisée, comme décrit dans le protocole pour les neurones de la drosophile, est une option viable pour la plupart des types de cellules. Cependant, il est également possible d’ensemencer des cellules sur le substrat à une concentration initiale plus faible et d’ajouter plus de cellules de manière surveillée, comme décrit ici et dans d’autres ^{publications18}. Cet ensemencement séquentiel peut fournir des résultats plus cohérents dans certains cas. Comme pour la culture cellulaire standard, il faut toujours veiller à maintenir la viabilité cellulaire et à minimiser l’agglutination cellulaire pendant l’isolement.

Lorsque vous commencez avec le micromodèlement, il y a quelques pièges potentiels qui nuisent au résultat final. Une manipulation minutieuse de la grille et une technique stérile, une distribution uniforme du gel PLPP, une dose et une concentration appropriées pendant le modelage et le maintien de la viabilité cellulaire avant l’ensemencement sont parmi les considérations les plus importantes pour le succès. Une liste de certains des problèmes potentiels ainsi que des solutions a été dressée dans le tableau 1.

Les grilles à micromotifs peuvent être utilisées pour aider à positionner les cellules afin d’établir une densité cellulaire cohérente sur l’ensemble de la grille et de positionner les régions d’intérêt dans des zones adaptées à la collecte de séries ^{d’inclinaison16,18}. Le placement et le positionnement des cellules peuvent être utilisés comme marqueurs fiducaux pour la corrélation dans les expériences cryo-CLEM, réduisant ainsi le besoin de grilles de recherche fragiles et de marqueurs fiducaux fluorescents. Cependant, il convient de noter que de tels marqueurs fiduciels peuvent encore être utiles pour la corrélation de précision inférieure au ^{micromètre29,40}. En outre, une distribution uniforme des cellules isolées est également très bénéfique pour les expériences de fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB) afin de maximiser le nombre de cellules à partir desquelles la lamelle peut être ^coupée16.

L’ajout de micromotifs aux flux de travail cryo-EM entraînera des améliorations mesurables du débit de données et permettra potentiellement de nouvelles expériences. Au fur et à mesure que la technique sera adoptée et développée, des applications plus avancées du micromodèlement, y compris les gradients ECM, les dépôts ECM multiples et l’assemblage de microstructures, élargiront encore les capacités du cryo-ET pour étudier les cibles et les processus biologiques dans un contexte cellulaire complet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 % (p/v) Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML
0,22 & micro ; m filtres pour seringues membrane PVDF	Genesee	25-240
22x60-1 Couvercle en verre	Fisher	12545F
5/15 Pince à épiler	EMS (Dumont)	0203-5/15-PO
Antibiotique-antimycosique (100X)	ThermoFisher (Gibco)	15240096
BEAS-2B cellules	ATCC	CRL-9609
Collagène I, bovin	ThermoFisher ( Gibco)	A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugué	ThermoFisher (Invitrogen)	C11254
DMEM	Fisher (Lonza)	BW12-604F
EtOH	Fisher (Decon Labs)	22-032-600
Sérum fœtal bovin	ATCC	30-2020
Fibrinogène du plasma humain, Alexa Fluor 647 Conjugué	ThermoFisher ( Invitrogen)	F35200
Fibronectine Protéine bovine, Plasma	ThermoFisher (Gibco)	33010018
Plat à fond en verre	MatTek	P35G-1.5-20-C
Glucose	VWR	0643-1KG
Grille de préparation	Support EMS	71175-01
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Hémacytomètre	Fisher (SKC, Inc.)
HEPES	Fisher (ACROS Organics)	AC172572500
Hoechst 33342	ThermoFisher (Invitrogen)	H3570
Insulin	Fisher (Sigma Aldrich)	NC0520015
KCl	MP Bio	194844
KH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC212595000
Leica-DMi8	Leica Microsystems		Peut être personnalisé avec des accessoires de caméra, de platine et d’objectif Leonardo
	Alvé ; ole		https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade	Fisher (Supply Solutions)	50-100-3280
LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité	ThermoFisher (Invitrogen)	L3224
Caméra microscope	Hammamatsu	C13440-20CU
Platine motorisée	Mä ; rzhä ; utilisateur Wetzlar	00-24-599-0000
NaCl	Fisher (Fisher BioReagents)	BP358-1
NaH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC207802500
NaOH	Fisher (Alfa Aesar)	AAA1603736
PBS	Corning	21-040-CV
Pochoirs PDMS	nanoscaleLABS	PDMS_STENCILS_EM	https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA	à l’échelle nanométriqueLABS	PEG-SVA-1GR	mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Pénicilline	Fisher (Research Products International Corp)	50-213-641
bandelettes de pH	Fisher (Millipore Sigma)	M1095350001	sonde de pH peut également être utilisée
gel PLPP	à l’échelle nanométriqueLABS	PLPP-GEL-300UL	https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO	Alvé ; ole		https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC contenant de l’ADNc antigénomique RSV A2-mK+ )	Ressources	BEI NR-36460	https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grilles	EMS (Quantifoil)	Q2100AR1	2 µ ; m trous espacés de 1 & micro ; m mis à part, d’autres dimensions sont disponibles
RPMI	Fisher (Lonza)	BW12-702F
RSV A2-mK+	voir l’entrée pour pSynkRSV-19F-Décrit		dans Hotard et al. [22]. Peut être généré à partir de pSynkRSV-ll9F
Média de Schneider	ThermoFisher (Gibco)	21720-024
SerialEM	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Pince à épiler droite	EMS (Dumont)	72812-D
Streptomycine	Fisher (Fisher BioReagents)	BP910-50
Sucrose	Avantor	4097-04
Tetracycline	Sigma	T8032-10MG
Microscope électronique Titan Krios	ThermoFisher		300kV, avec caméra détecteur d’électrons directs et filtre d’énergie
Trypsin	ThermoFisher (Gibco	15090046
Revolver/Rotator	Fisher (Thermo Scientific)	11676341
UAS :mcD8 :GFP Souche de mouche drosophile	Bloomington Drosophila Stock Center	5146	http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html