Method Article

Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques

DOI:

10.3791/63015

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Center for Applied Structural Discovery, Biodesign Institute, Arizona State University, 3Eyring Materials Center, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les monocouches lipidiques sont utilisées comme base pour former des cristaux de protéines bidimensionnelles (2D) pour des études structurelles depuis des décennies. Ils sont stables à l’interface air-eau et peuvent servir de matériau de support mince pour l’imagerie électronique. Nous présentons ici les étapes éprouvées de la préparation des monocouches lipidiques pour les études biologiques.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallographie électronique est un outil puissant pour la détermination de structures à haute résolution. Les macromolécules telles que les protéines solubles ou membranaires peuvent être cultivées en cristaux bidimensionnels (2D) hautement ordonnés dans des conditions favorables. La qualité des cristaux 2D cultivés est cruciale pour la résolution de la reconstruction finale via le traitement d’image 2D. Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D de protéines membranaires intégrales, mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser le partage avec la monocouche. Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau de telle sorte que les groupes de tête lipidique polaire restent hydratés dans la phase aqueuse et que les chaînes acyles non polaires se divisent dans l’air, brisant la tension superficielle et aplatissant la surface de l’eau. La nature chargée ou les fractions chimiques distinctives des groupes de tête fournissent une affinité pour les protéines en solution, favorisant la liaison pour la formation de réseaux 2D. Une monocouche nouvellement formée avec le réseau 2D peut être facilement transférée dans un microscope électronique (EM) sur une grille de cuivre recouverte de carbone utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin. Dans ce travail, nous décrivons une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie cryogénique au microscope électronique (cryo-EM).

Introduction

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La diffraction d’électrons à travers des cristaux 2D ou des réseaux hélicoïdaux de protéines peut atteindre des résolutions inférieures au nanomètre dans des cas favorables1,2,3. Les réseaux de protéines membranaires 2D reconstitués ou les cristaux dans leur environnement quasi natif sont particulièrement intéressants1. Parce qu’un cristal agit comme un amplificateur de signal améliorant les intensités des facteurs structurels à des fréquences spatiales spécifiques, la cristallographie électronique permet de sonder une cible de taille plus petite à haute résolution, telle que de petites molécules, que celles de cryo-EM à particule unique. Le faisceau d’électrons peut être diffracté par un réseau ordonné de protéines 2D, générant un motif de diffraction ou une image en treillis selon l’endroit où le plan d’image est enregistré sur le détecteur4. Les intensités diffractées peuvent ensuite être extraites et traitées pour reconstruire une structure de projection 2D du cristal. Les électrons ont une plus grande section de diffusion que les rayons X et sa diffusion suit principalement le modèle de Rutherford basé sur l’interaction de Coulomb entre les électrons et les atomes chargés dans la molécule5. Les épaisseurs des cristaux de membrane 2D sont généralement inférieures à 100 nm, adaptées à la transmission d’électrons sans diffusion dynamique se produisant dans l’échantillon6. Les études cristallographiques électroniques se sont révélées être un outil puissant pour sonder l’information structurelle à haute résolution des protéines membranaires et des interactions lipide-protéine7,8,9,10 , 11,12, 13,14,15,16,17.

Une monocouche lipidique est une seule couche lipidique composée de phospholipides densément emballés à une interface air-eau6, qui peut aider à la formation du réseau 2D pour les protéines solubles ou les protéines de la membrane périphérique18. En fonction de la densité des lipides et de leur pression latérale, les molécules lipidiques peuvent former un réseau ordonné 2D sur l’interface air-eau avec leurs chaînes acyl étendues à l’air et aux groupes de tête hydrophiles exposés dans la solution aqueuse1,6,19. Le groupe de tête lipidique peut interagir avec les protéines via une interaction électrostatique ou peut être modifié pour fournir une balise d’affinité pour lier un domaine protéique spécifique. Par exemple, le DOGS-NTA-Ni (acide 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)acide iminodiacétique)succinyl]2-Ni2+) est souvent utilisé pour former une monocouche lipidique pour lier les protéines avec une étiquette poly-histidine20,21,22. En outre, la toxine B du choléra peut lier un pentasaccharide particulier de ganglioside GM1 dans une monocouche lipidique pour les études structurelles23,24. En ancrant les protéines sur les groupes de tête lipidiques, la monocouche lipidique peut aider à la formation des réseaux 2D qui sont minces pour les études cristallographiques électroniques à haute résolution. La technique de la monocouche lipidique a été utilisée en cristallographie électronique pour des études structurales de protéines, telles que la streptavidine2,25, l’annexine V26, la toxine cholérique27, la sous-unité B e. coli gyraseB 28, l’ARN polymérase E. coli 25,29,30, les protéines de la coquille de carboxysomes31 et les protéines de capside du VIH-132 et du virus de la leucémie murine Moloney 33. En raison de la stabilité et des propriétés chimiques de la monocouche lipidique, différentes applications pour la préparation des échantillons ont été explorées pour l’imagerie cryo-EM34. Cependant, une optimisation sera nécessaire pour la formation de réseaux de protéines.

Ici, nous fournissons des détails détaillés sur la préparation générale des monocouches lipidiques pour l’imagerie cryo-EM et quelques considérations qui pourraient affecter la qualité des monocouches formées.

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Protocol

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1. Préparation des blocs de téflon

  1. Préparez le bloc de téflon à partir de résine PTFE (polytétrafluoroéthylène) résistante aux produits chimiques. Faites des trous sur le bloc à l’aide d’une perceuse générale suivie des dimensions indiquées à la figure 1.

2. Préparation lipidique monocouche

REMARQUE: Durée de fonctionnement estimée: 30-45 minutes

  1. Préparation du stock lipidique
    1. Préparer un mélange lipidique de 0,01 mg/mL dans du chloroforme/méthanol 9:1 (v/v) en utilisant 8,91 mL de chloroforme, 0,99 mL de méthanol et 0,01 mL de lipides de 10 mg/mL.
  2. Préparation de plaques de téflon
    1. Sonicate une plaque de téflon dans un bain de méthanol pendant 5 minutes.
    2. Laver à l’eau chaude pendant 15 minutes.
    3. Rincer à l’eau distillée.
    4. Sécher la plaque de téflon dans un dessiccateur pendant 30 minutes et la garder sous vide lorsqu’elle n’est pas utilisée (Figure 1).

3. Formation d’une monocouche lipidique sur un réservoir tampon

REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1,5 heures

  1. Préparer fraîchement un mélange lipidique de 0,01 mg/mL dans un mélange 9:1 de chloroforme/méthanol le jour de l’expérience.
  2. Placez un papier filtre de type 1 dans une boîte de Petri et disposez le bloc de téflon sur le dessus du papier filtre.
  3. Remplissez les puits de la plaque de téflon avec 60 μL de tampon.
  4. Ajouter soigneusement le mélange lipidique sur le dessus de la surface tampon goutte par goutte (idéalement 1 μL par goutte) à l’aide d’une seringue Hamilton.
  5. Mouillez le papier filtre avec de l’eau distillée pour maintenir l’humidité dans la boîte de Pétri.
  6. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes. Le chloroforme devrait s’évaporer et une monocouche de lipides à la surface du tampon devrait être formée.

4. Application d’une grille EM sur une monocouche lipidique

REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1,5 heures

  1. Placez doucement une grille EM recouverte de carbone trouée sans décharge de carbone, côté carbone vers le bas, sur le dessus de chaque réservoir tampon.
  2. Injectez soigneusement des protéines dans le puits d’injection latérale. Utilisez les concentrations finales de protéines dans le puits autour de 1 μM de protéines comme point de départ. Pré-optimiser la concentration en protéines avant l’expérience.
  3. Incuber pendant 60 minutes à température ambiante.
  4. Injectez doucement environ 20 à 30 μL de tampon dans l’aissent l’aissé du côté. Cela élèvera la grille au-dessus de la surface du bloc de téflon.
  5. Ramassez immédiatement la grille avec une pince à épiler et soulevez-la verticalement de la gouttelette.
  6. Préparer des échantillons monocouches pour la coloration négative ou l’imagerie cryo-TEM (Figure 2). Si les protéines forment un réseau 2D, le spectre de puissance de l’image ou le périogramme de Fourier montrera les intensités de diffraction aux fréquences spatiales en fonction de la symétrie cristalline. Si aucune tache de diffraction n’est montrée dans le spectre de puissance, il est peu probable que les protéines forment un cristal 2D.
  7. Vérifiez la couverture de la monocouche lipidique sur la grille EM à l’aide d’un microscope électronique à transmission (TEM). Une image électronique plus faiblement agrandie est utile pour identifier la morphologie de la monocouche couverte. Habituellement, le contraste d’image de la zone couverte de monocouche sera légèrement inférieur à celui des zones non couvertes. De plus, le spectre de puissance d’image 2D calculé aidera à identifier l’emplacement du cristal 2D.

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Results

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Une monocouche lipidique déposée sur la grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission (TEM) sans coloration. La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans aucun spécimen dans la trajectoire du faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste local plus faible que celles qui n’ont pas de couverture, car le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion et montre un éclairage plus lumineu...

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Discussion

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Une monocouche lipidique est un outil puissant qui facilite la croissance de gros cristaux 2D pour les études structurales de macromolécules biologiques. Pour préparer avec succès une monocouche lipidique intacte à l’interface air-eau, il est fortement recommandé que les lipides soient préparés fraîchement le jour de l’expérience, car l’oxydation de la chaîne lipidique acyle pourrait entraîner une perturbation de l’emballage dans la monocouche et nuire à la formation de cristaux qui en résulte. Les lipides achetés sous f...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La préparation de ce manuscrit a été partiellement soutenue par le US Army Research Office (W911NF2010321) et les fonds de démarrage de l’Arizona State University à P.-L.C.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Ampoule pour petits pipettesFisher Scientific03-448-21
ChloroformeSigma-AldrichC2432
Aspirateur à dessiccateurSouthern Labware55207
EM gridsMicroscopie électronique SciencesCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 & micro ; trou M, 1,3 & micro ; m space
Papier filtreGE Healthcare Life Sciences1001-090Diamètre 90 mm
Verre Pipettes PasteurFisher Scientific13-678-20A
Seringue Hamilton (25 µ ; L)Hamilton Company80465
Seringue Hamilton (250 µ ; L)Hamilton Company81165
Seringue Hamilton (5 & micro ; L)Hamilton Company87930
Seringue Hamilton (500 µ ; L)Hamilton Company203080
MéthanolSigma-AldrichM1775-1GA
Boîte de PétriVWR25384-342100 mm × ; 15 mm
Bloc de téflonGrainger55UK0560 µ ; Puits en L avec orifices d’injection latéraux, pince
épilerMicroscopie électronique Sciences78325Différents styles
Nettoyeur à ultrasons
à manuelle à eau ultra-pure VWR 97043-996

References

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