Interfaces d’hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries

Summary

L’utilisation d’hydrogels photodégradables pour isoler les cellules bactériennes à l’aide d’un outil de tapotement de lumière à haute résolution est rapportée. Les procédures expérimentales essentielles, les résultats et les avantages du processus sont examinés. La méthode permet l’isolement rapide et peu coûteux de bactéries ciblées présentant des fonctions rares ou uniques provenant de communautés ou de populations hétérogènes.

Abstract

Les biologistes tentent depuis longtemps de comprendre la relation entre le phénotype et le génotype. Pour mieux comprendre ce lien, il est crucial de développer des technologies pratiques qui associent le criblage cellulaire microscopique à l’isolement cellulaire à haute pureté pour l’analyse génétique en aval. Ici, l’utilisation d’hydrogels de poly(éthylène glycol) photodégradables pour le dépistage et l’isolement de bactéries avec des phénotypes de croissance uniques à partir de populations cellulaires hétérogènes est décrite. La méthode repose sur l’encapsulation ou le piégeage des cellules avec l’hydrogel, suivie d’une culture, d’un criblage microscopique, puis de l’utilisation d’un outil de modélisation lumineuse à haute résolution pour le contrôle spatio-temporel de la dégradation de l’hydrogel et la libération de cellules sélectionnées dans une solution à récupérer. L’application de différents modèles de lumière permet de contrôler la morphologie de la cellule extraite, et des motifs tels que des anneaux ou des croix peuvent être utilisés pour récupérer des cellules avec une exposition directe minimale aux rayons UV afin d’atténuer les dommages à l’ADN des isolats. De plus, l’outil de modélisation de la lumière fournit une dose de lumière réglable pour atteindre divers taux de dégradation et de libération cellulaire. Il permet la dégradation à haute résolution, permettant la récupération des cellules avec une précision spatiale à l’échelle du micron. Ici, l’utilisation de ce matériau pour filtrer et récupérer les bactéries des hydrogels en vrac et des dispositifs de laboratoire sur puce microfabriqués est démontrée. La méthode est peu coûteuse, simple et peut être utilisée pour des applications courantes et émergentes en microbiologie, y compris l’isolement de souches bactériennes avec des profils de croissance rares à partir de bibliothèques mutantes et l’isolement de consortiums bactériens avec des phénotypes émergents pour les caractérisations génomiques.

Introduction

L’isolement de cellules ayant des comportements uniques dans un environnement complexe et hétérogène est fondamental pour obtenir des informations génétiques en biologie¹. En microbiologie, la sélection et l’isolement de microbes rares ou uniques après observation deviennent importants dans de nombreuses applications qui nécessitent un lien entre l’information génomique et l’information phénotypique observable. Ces applications comprennent la sélection de souches phénotypiquement rares à partir de bibliothèques de mutants^2,la sélection de micro-organismes clés à partir de communautés microbiennes complexes^3,4et la sélection phénotypiquement rares mais importantes de bactéries à partir de populations isogéniques. L’isolement de cellules viables mais non cultivables (VBNC) d’une population bactérienne est un exemple important de cette dernière, où les cellules avec le phénotype VBNC sont souvent cachées dans des populations bactériennes à 1:10² à 1:10⁵ rapports^5,6. En raison des difficultés généralisées d’isolement des bactéries, beaucoup reste inconnu sur de nombreux micro-organismes phénotypiquement rares. Ces limitations soulignent la nécessité de techniques d’isolement cellulaire pour identifier d’abord la ou les cellules cibles à partir d’un mélange, puis les récupérer et les isoler pour une analyse moléculaire en aval⁷.

Certaines des méthodes les plus couramment établies d’isolement cellulaire comprennent la cytométrie en flux et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)^8,la séparation immunomagnétique^9,10et la microfluidique^11. Bien que ces méthodes d’isolement aient une grande valeur, elles présentent également des inconvénients qui limitent leur utilisation. Par exemple, le FACS peut fournir un isolement microbien de routine au niveau d’une seule cellule pour l’analyse génomique de suivi^3, mais il est souvent limité par sa disponibilité et son coût, ainsi que par les problèmes de contamination en aval¹¹. Les approches microfluidiques telles que la cytométrie en flux microfluidique ont suscité beaucoup d’attention, ce qui, par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle, permet une réduction significative du volume d’échantillon requis¹². Cependant, la séparation et la récupération d’une ou de petites collections de cellules à partir de dispositifs microfluidiques est souvent un problème difficile qui nécessite généralement une configuration et une conception de dispositif plus complexes¹³. De nombreuses approches microfluidiques caractérisent génétiquement les cellules avant qu’elles ne soient entrées et observées dans un dispositif^14,limitant ainsi le nombre d’espèces uniques observées lors de la réalisation d’un écran fonctionnel. Compte tenu de ces limites, d’autres innovations de méthodes et de matériaux pratiques pour le criblage et l’isolement cellulaires sont nécessaires pour une utilisation généralisée dans de nombreux laboratoires.

Cet article présente une nouvelle approche basée sur les matériaux pour le dépistage et l’isolement des bactéries. La méthode utilise des hydrogels photodégradables pour l’encapsulation cellulaire, la culture, l’observation microscopique et la libération et la récupération à la demande de bactéries ciblées avec des phénotypes uniques. Les hydrogels sont conçus pour contenir un maillage de 10 nm, où chaque réticulation contient desgroupes o-nitrobenzyle¹⁵. Le matériau encapsule ou piège les cellules pour l’observation tout en permettant la diffusion des nutriments et des déchets vers et depuis les cellules pour la culture. L’exposition du matériau à une source de lumière UV à motifs de 365 nm à travers un microscope vertical permet une dégradation locale de l’hydrogel par photodéveloppement des groupes o-nitrobenzyle^{16, 17}. La dégradation déclenche la libération sélective de cellules pour la récupération en vue d’une analyse en aval, y compris l’analyse génomique et, potentiellement, protéomique et transcriptomique. La configuration expérimentale et le protocole sont relativement simples, peu coûteux et translationnels pour les laboratoires de microbiologie. Il ne nécessite que l’encapsulation cellulaire par la formation d’hydrogel, l’observation des cellules capturées avec un microscope à champ lumineux et à fluorescence, et l’éclairage des cellules d’intérêt avec une source de lumière UV à motifs pour la récupération.

L’un des principaux avantages de cette approche du dépistage basée sur les matériaux est son adaptabilité aux différents formats de criblage. Dans son format le plus basique, le matériau peut être utilisé pour le criblage en encapsulant une collection de cellules hétérogènes dans des hydrogels en vrac. Les cellules sont ensuite observées pour le phénotype souhaité, et les cellules individuelles d’intérêt sont retirées pour la caractérisation génomique. Dans des formats plus élaborés, le matériau peut également être intégré dans des dispositifs de laboratoire sur puce pour fournir une libération et une récupération précises des cellules dans les zones souhaitées de l’appareil. Les deux formats sont décrits ici, et les deux ont permis de nouvelles applications récentes de dépistage et de sélection microbiens^17,18,19. La méthode est démontrée ici avec des organismes à Gram négatif modèles (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) et un organisme modèle à Gram positif (Bacillus subtilis) et a été facilement étendue à une variété d’autres bactéries.

Protocol

1. Souches bactériennes et protocoles de culture

1. Striers colonies de bactéries sur des plaques de gélose complétées par des milieux de croissance appropriés. Dans ce rapport, B. subtilis (souche 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) est cultivé sur ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄· H₂O, 0,125 m FeSO_4· 7H₂O, 28 mM de glucose, pH : 7 ± 0,2, 15 g/L de gélose) plaques de gélose complétées par 100 μg/mL de spectinomycine et E. coli (souche 25922, ATCC) sur des plaques d’agar ATGN complétées par 100 μg/mL d’ampicilline.
   REMARQUE: Des rapports antérieurs d’encapsulation et de libération d’hydrogel avec ces matériaux provenant de Fattahi et al.¹⁹ ont plutôt utilisé des cellules A. tumefaciens C58
2. Choisissez les colonies souhaitées dans les plaques de gélose ATGN et commencez les cultures du jour au lendemain. Pour les souches d’E. coli et de B. subtilis utilisées ici, culture à 37 °C en agitant à 215 tr/min en milieu liquide ATGN pendant 24 h. Conserver les cultures cellulaires dans du glycérol à 50 % à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
3. Cueillir les colonies des deux souches à partir de stocks de glycérol à l’aide de boucles d’inoculation stériles et incuber dans des milieux liquides ATGN pendant 24 h à 37 °C et 215 tr/min.

2. Préparation du matériel nécessaire à la formation de l’hydrogel

1. Synthèse photodégradable de PEG-o-NB-diacrylate
   NOTE: La synthèse interne du diacrylate dePEG-o-NBa été bien décrite et précédemment rapportée^16,17. Alternativement, parce que la synthèse est de routine, elle peut être externalisée à partir d’une installation de synthèse chimique.
2. Tampon de réticulation
   1. Prenez la recette du milieu sélectionné pour la souche bactérienne et préparez un milieu avec 2x nutriments. Ajouter le phosphate, par exemple NaH₂PO_4, au milieu jusqu’à une concentration finale de 100 mM. Ensuite, ajustez la valeur du pH à 8 en utilisant 5 M NaOH (aq).
   2. Stériliser la solution tampon et la conserver à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: Laissez de côté tous les métaux de transition présents dans le milieu, car ces métaux catalysent l’oxydation des thiols en disulfures.
3. Solution de diacrylate dePEG-o-NB
   1. Pour chaque mg de poudre aliquote de DIACRYLATE DEPEG-o-NB(3 400 Da de poids moléculaire), ajouter 3,08 μL d’eau ultrapure pour atteindre une concentration de 49 mM de diacrylate dePEG-o-NB(concentration d’acrylate de 98 mM).
   2. Vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conserver cette solution à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
4. Solution de PEG-thiol à 4 bras
   1. Pour la préparation de PEG-thiol à 4 bras (poids moléculaire de 10 000 Da), ajouter 4 μL d’eau ultrapure par mg de poudre pour atteindre une concentration de 20 mM (80 mM de concentration de thiol).
   2. Vortex cette solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conserver cette solution à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Préparation de couvercles perfluoroalkylés (non réactifs)

1. Placez jusqu’à 5 glissières en verre (25 mm x 75 mm x 1 mm) à l’intérieur d’un publipostage en polypropylène. Sonicer les lames avec une solution détergente à 2% (p/v)(Table des matériaux)pendant 20 min.
2. Rincez les lames trois fois à l’eau ultrapure, puis sonifiez les lames dans de l’eau pendant 20 min. Sécher les lames à l’aide d’un flux de N₂.
3. Plasma propre (voir Tableau des matériaux)des deux côtés des lames de verre selon le protocole de la section 4.1 pendant 2 min.
4. Replacez les lames nettoyées au plasma dans l’expéditeur et remplissez le récipient avec une solution à 0,5 % (v/v) de trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctyl)silane dans du toluène. Permettre à ces lames de verre d’être fonctionnalisées pendant 3 h à température ambiante (RT).
5. Une fois les lames fonctionnalisées, rincez les lames dans l’expéditeur de la lame, d’abord avec du toluène et ensuite de l’éthanol (trois fois avec chaque solvant). Ensuite, séchez chaque lame fonctionnalisée avec un flux de N₂.

4. Préparation de couvercles de thiol fonctionnalisé (base)

1. Nettoyage des couvercles de verre à l’aide d’un nettoyeur plasma
   1. Placez des couvercles de 18 mm x 18 mm dans une boîte de Pétri. Ensuite, placez la boîte de Petri dans une chambre de nettoyage à plasma et allumez la puissance du nettoyeur à plasma.
   2. Allumez la pompe à vide pour dégager l’air à l’intérieur de la chambre jusqu’à ce que le manomètre indique 400 mTorr.
   3. Ouvrez la vanne de dosage pour laisser entrer l’air dans la chambre jusqu’à ce que le manomètre atteigne une pression constante (800-1000 mTorr). Ensuite, sélectionnez RF avec le mode « Hi » et exposez les couvercles pendant 3 min.
   4. Après 3 min, désactivez le mode RF et la pompe à vide.
   5. Sortez la boîte de Petri de la chambre, retournez les couvercles et replacez-les dans la chambre pour exposer au plasma l’autre côté du couvercle en verre.
   6. Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.4 pour nettoyer au plasma le côté non traité du couvercle en verre.
   7. Une fois le processus terminé, retirez la boîte de Petri de la chambre et éteignez le nettoyeur plasma et la pompe à vide.
2. Nettoyage et hydroxylation des couvercles avec une solution de piranha
   REMARQUE: Les protocoles de nettoyage standard du piranha peuvent être utilisés pour nettoyer et hydroxyler les feuillets de verre. La solution de piranha est un mélange 30:70 (v/v) de_H2O2et_H2SO4. D’autres méthodes de nettoyage des couvercles de verre peuvent également être utilisées.
   ATTENTION: La solution de piranha est fortement corrosive et explosive avec des solvants organiques et doit être manipulée avec une extrême prudence. Des mesures de sécurité et de confinement appropriées devraient être mises en œuvre, comme l’utilisation d’un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, tablier résistant aux produits chimiques, lunettes de sécurité, écran facial, gants de butyle résistants aux acides). Toute la verrerie et les surfaces de travail en contact avec la solution de piranha doivent être propres, sèches et exemptes de résidus organiques avant utilisation. La solution de piranha ne doit jamais être stockée dans un récipient partiellement fermé ou fermé.
   1. Placez un plat en verre propre de 100 mm x 50 mm sur un agitateur magnétique à plaque chauffante avec vitesse d’agitation réglable sous une hotte et ajoutez 14 mL de H₂SO₄ au plat.
   2. Placez doucement une petite barre d’agitation magnétique recouverte de téflon à l’aide d’une pince recouverte de téflon à l’intérieur du plat. Ensuite, tournez l’agitateur lentement pour éviter les éclaboussures d’acide.
   3. Ensuite, ajoutez doucement 6 mL de_H2O₂ au plat et laissez la solution bien mélangée.
   4. Éteignez l’agitateur, puis retirez la barre de remuage du plat à l’aide de la pince. Ensuite, placez doucement les couvercles à l’intérieur du plat à l’aide de la pince et réglez la température à 60–80 °C.
   5. Après 30 min, retirez délicatement les couvercles à l’aide de la pince et immergez-les deux fois dans de l’eau désionisée (DI) pour éliminer la solution résiduelle de piranha.
   6. Après rinçage à l’eau, conserver les couvercles dans de l’eau DI à RT jusqu’à une utilisation ultérieure.
   7. Éteignez la plaque chauffante et laissez refroidir la solution de piranha.
   8. Pour éliminer la solution de piranha, placer délicatement le plat en verre de 100 mm x 50 mm contenant la solution de piranha refroidie dans un bécher en verre plus grand et vide d’au moins 1,5 L de volume. Ajoutez ensuite 1 L d’eau à diluer et ajoutez de la poudre de bicarbonate de sodium pour neutraliser. Notez que le bicarbonate de sodium provoquera des bulles et une génération de chaleur et doit être ajouté très lentement, sinon le bouillonnement peut entraîner des éclaboussures d’acide. Lorsque l’ajout supplémentaire de bicarbonate de sodium ne provoque pas de bouillonnement, vérifiez le pH avec du papier pH pour vérifier qu’il a été neutralisé. Une fois la solution neutralisée et refroidie, elle peut être versée dans l’évier.
3. Fonctionnalisation thiol des coverslips
   1. Préparer une solution à 5 % (v/v) de 269 mM de solution de triméthoxysilane (MPTS) (3-mercaptopropyl) dans du toluène sec.
   2. Ajouter 10 mL de la solution dans des tubes centrifugeux coniques individuels de 50 mL et placer un couvercle nettoyé dans chaque tube et l’immerger dans la solution.
      REMARQUE: Un couvercle par tube de 50 mL est utilisé pour assurer la thiolation des deux côtés du substrat sans être perturbé par d’autres substrats.
   3. Après 4 h, laver chaque couvercle (quatre lavages par couvercle) avec du toluène, un mélange d’éthanol 1:1 (v/v) : toluène et de l’éthanol.
      REMARQUE: Cela se fait en immergeant chaque couvercle séquentiellement dans des tubes centrifuges coniques contenant les solutions mentionnées.
   4. Après avoir rincé le substrat, immergez-le dans de l’éthanol et conservez-le à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: Selon le nombre de couvercles, cette méthode peut devenir laborieuse en raison du traitement des couvercles un à la fois. Pour plusieurs couvercles, des pots Columbia qui s’adaptent à plusieurs couvercles en même temps peuvent être utilisés.

5. Fabrication de réseaux de micropuits en silicium

1. Revêtement de parylène: Utilisez le protocole standard décrit dans les articles de recherche^{précédents 20,21} pour recouvrir les plaquettes de silicium de parylène.
2. Microfabrication : Suivez le protocole décrit par Barua et al.¹⁸ pour concevoir et fabriquer le réseau de micropuits(figure supplémentaire 1).
   REMARQUE: Les techniques photolithographiques standard décrites par Timm et al.¹⁷ ont été appliquées pour fabriquer des réseaux de micropuits sur des plaquettes de silicium revêtues de parylène.

6. Formation d’hydrogel

1. Formation d’hydrogel en vrac sur des couvercles de verre
   1. Solution de précurseur d’hydrogel : Ajouter 12,5 μL du tampon de réticulation à un tube de microcentrifugationde 0,5 mL, suivi de 5,6 μL de solution de diacrylate de PEG-o-NB. Enfin, ajouter 6,9 μL de solution de PEG-thiol à 4 bras au mélange.
      REMARQUE: L’ajout du thiol PEG à 4 bras au mélange déclenche la réaction de réticulation. Ainsi, la solution de précurseur d’hydrogel doit être utilisée immédiatement après le mélange.
   2. Pour l’encapsulation cellulaire dans la solution de précurseur d’hydrogel, suivre les étapes 6.1.3-6.1.9.
   3. Pour l’encapsulation cellulaire, avant l’étape 6.1.1, inoculez le tampon de réticulation avec la densité cellulaire souhaitée. Comme indiqué précédemment¹⁹, il a été observé que la densité cellulaire de 7,26 × 10⁷ UFC / mL dans le tampon de réticulation est corrélée à une densité de ~ 90 cellules / mm² encapsulée à travers l’hydrogel.
   4. Placez le couvercle de base thiolé sur une boîte de Petri propre. Placez deux entretoises (voir Table des matériaux)sur les deux côtés opposés de la glissière de couverture.
      REMARQUE: La fonctionnalisation thiol des couvercles est nécessaire pour la fixation covalente de l’hydrogel à la surface du couvercle. Cela se fait par la réaction des groupes thiol à la surface et des groupes acrylate présents dans la solution précurseur d’hydrogel.
   5. Fixez les entretoises sur le couvercle de base en collant les entretoises sur la boîte de Pétri.
   6. Pipeter le volume souhaité de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylée non réactive.
   7. Placez la lame de verre perfluoroalkylé sur le couvercle de base(Figure 1C). Attendez 25 min à TA pour que la formation d’hydrogel se termine.
   8. Après la gélification, retirer délicatement la lame de verre perfluoroalkylé. L’hydrogel restera attaché à la couche de couverture de base.
      REMARQUE: Pour les couvercles de 18 mm x 8 mm afin d’obtenir une membrane de 12,7 μm d’épaisseur, utilisez ~7 μL de la solution précurseur (Figure 1A, B). L’utilisation de volumes plus élevés de solution précurseur peut entraîner l’hydrogel sous le couvercle de base. Cela peut faire en sorte que le couvercle de base adhère à la boîte de Petri et se brise lors d’une tentative de retrait. En outre, les résidus d’hydrogel sous le couvercle sont problématiques pour la microscopie. L’élimination en douceur de la lame de verre perfluoroalkylé non réactif est nécessaire, car une élimination rapide peut endommager l’hydrogel.
   9. Placer le substrat dans une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm dans un milieu de culture spécifié. Ici, un milieu ATGN complété par 100 μg/mL de spectinomycine pour B. subtilis ou 100 μg/mL d’ampicilline pour E. coli à 37 °C a été utilisé pendant 24 h de culture.

Figure 1: Formation d’hydrogel sur des couvercles en verre thiolé. (A) Des entretoises d’une épaisseur de 12,7 μm sont placées sur deux côtés opposés d’un couvercle de base contenant des groupes thiol réactifs. (B) La solution précurseur d’hydrogel est pipetée sur une lame de verre fluoré non réactive. (C) La lame de verre non réactive est placée sur les entretoises pour la formation d’hydrogel de 12,7 μm d’épaisseur. (D) La lame de verre non réactive est délicatement retirée, laissant l’hydrogel attaché à la glissière de base. (E) L’hydrogel préparé peut être incubé dans des milieux pour la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Formation d’hydrogel sur des réseaux de micropuits

1. Ensemencement de bactéries dans des réseaux de micropuits
   REMARQUE: 700 μL de suspensions de cellules 0,1 OD₆₀₀ ont été ensemencées sur les substrats des réseaux de micropuits, et la méthode de décollage du parylène a été appliquée pour retirer les cellules de l’arrière-plan en utilisant le protocole décrit par Timm etal. ²².
2. Préparer la solution précurseur de l’hydrogel en ajoutant 5,6 μL du diacrylate dePEG-o-NBavec 12,5 μL de solution saline ATGN tamponnée au phosphate pH 8 et en mélangeant avec 6,9 μL de la solution de thiol PEG à quatre bras.
3. Pipette 12,5 μL de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylé non réactive et placer deux entretoises en acier de 38 μm (voir Tableau des matériaux)sur deux côtés opposés du substrat du réseau de micropuits inoculé avec des cellules.
4. Inverser la lame de verre perfluoroalkylé avec la gouttelette de solution précurseur et placer la gouttelette au milieu du substrat du micropuit. Ensuite, incuber pendant 25 min à RT pour la formation d’hydrogel.
5. Retirez délicatement la lame de verre du substrat du micropuit. La membrane d’hydrogel doit rester attachée au substrat du micropuit. Passez à l’étape 6.1.9.

8. Préparation du matériel pour l’extraction cellulaire

1. Préparation du support PDMS
   1. Collez une pile de dix couvercles de 18 x 18 mm ensemble et collez cette pile de couvercles au fond d’une boîte de Pétri.
   2. Pour fabriquer des supports PDMS, mélangez le précurseur PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de volume de 10: 1 dans un gobelet en plastique, dégaz le mélange dans un dessiccateur sous vide, puis versez le mélange dans la boîte de Pétri.
   3. Durcir le PDMS pendant 90 min à 80 °C. Ensuite, coupez autour du bloc scotché pour retirer le support PDMS et placez le support PDMS sur une lame en verre pour une manipulation plus facile pour la microscopie.
2. Préparation de microsyringes et de tubes
   1. Coupez 20 cm de tube en PTFE (0,05 po d’identification) et fixez une extrémité du tube à une seringue de microlitre de 100 μL.
      REMARQUE: Pour l’extraction, évitez d’utiliser des pipettes car le dessin des cellules libérées via une pointe de pipette peut endommager la surface de l’hydrogel et entraîner une contamination.

9. Dégradation de l’hydrogel avec l’outil d’éclairage à motifs

REMARQUE : Les étapes suivantes décrites dans cette section sont identiques pour les hydrogels en vrac et les réseaux de micropuits, à l’exception des modèles d’exposition à la lumière décrits aux étapes 9.6.4-9.6.6 et 9.6.7-9.6.10.

1. Allumez le microscope (voir Tableau des matériaux). Ensuite, activez l’outil d’éclairage à motifs (voir Tableau des matériaux).
2. Allumez le module de commande analogique et numérique de la source lumineuse LED 365 nm. Ensuite, allumez le module de contrôle de la source lumineuse LED.
3. Ouvrez le logiciel du microscope et le logiciel de l’outil d’éclairage à motifs. Lorsque la fenêtre de configuration matérielle s’ouvre, sélectionnez le bouton Charger.
   REMARQUE: Trois appareils seront chargés ici. (Caméra tierce, module de commande et outil d’éclairage à motifs)
4. Appuyez sur le bouton Démarrer. La fenêtre du logiciel de motif de lumière va maintenant s’ouvrir. Sélectionnez la première option, le bouton Contrôle de périphérique, dans la barre latérale gauche de la fenêtre.
5. Calibrez l’outil d’éclairage à motifs.
   REMARQUE: L’étalonnage doit être effectué avec le même objectif de microscope et le même filtre qui seront utilisés pour l’exposition à la lumière.
   1. Réglez l’objectif du microscope sur un grossissement de 10x.
      REMARQUE: Ce grossissement permet une distance de travail suffisante entre la lentille du microscope et la surface de l’échantillon. Il permet également de surveiller et d’enregistrer le processus de récupération en temps réel via la fenêtre d’image.
   2. Réglez la lentille et le filtre du microscope sur les paramètres utilisés pour l’exposition à la lumière et placez le miroir d’étalonnage sous le microscope.
   3. Dans la fenêtre Contrôle des périphériques, appuyez sur l’onglet Contrôle des voyants. Allumez la LED #1 et réglez l’intensité lumineuse sur le nombre souhaité. Dans les expériences d’extraction standard, ce chiffre est fixé à 60%.
   4. Appuyez sur l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs dans la fenêtre Contrôle des périphériques. Ensuite, appuyez sur le bouton Afficher la grille.
      REMARQUE: Un motif de grille sera projeté sur le miroir d’étalonnage.
   5. Ajustez la mise au point du microscope et l’exposition de l’appareil photo pour obtenir une qualité d’image élevée de la grille et faites pivoter l’appareil photo pour aligner les lignes de la grille parallèlement au cadre de la fenêtre de l’appareil photo, si nécessaire.
   6. Sélectionnez le bouton Assistant d’étalonnage sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs et suivez les instructions fournies par le logiciel dans cette fenêtre.
      REMARQUE: Une fenêtre de configuration de caméra tierce s’ouvrira.
   7. Une fenêtre de sélection du type d’étalonnage s’ouvre. Sélectionnez Calibrage automatique et appuyezsur Suivant .
   8. Lorsque la fenêtre Réglage du pré-étalonnage s’ouvre, suivez les instructions du logiciel et appuyez sur le bouton Suivant.
   9. Lorsque la fenêtre Informations de mappage s’ouvre, enregistrez cet étalonnage en conséquence dans le dossier souhaité. Cela se fait en inscrivant la date, le nom du microscope, la lentille de l’objectif et le filtre.
   10. Après l’étalonnage, appuyez sur le bouton Définition de la zone de travail situé sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs pour définir la zone de travail de l’outil d’éclairage à motifs si nécessaire.
6. Section Sequence Design pour la préparation des motifs.
   1. Appuyez sur le bouton Sequence Design (Sequence Design) dans la barre latérale gauche de la fenêtre du logiciel. Ensuite, appuyez sur le bouton Éditeur de séquence de profil.
   2. Lorsque la fenêtre Éditeur de séquence de profils s’ouvre, sélectionnez l’option Nouveau profil sous la liste des profils.
      REMARQUE: Maintenant, une fenêtre de l’éditeur de modèles va s’ouvrir.
   3. Préparez le motif souhaité pour l’exposition à la lumière en choisissant différentes formes et tailles de motif, ou dessinez manuellement le motif, si vous le souhaitez.
   4. Pour les motifs circulaires et croisés brisés pour l’hydrogel en vrac, suivez les étapes 9.6.5 à 9.6.6
   5. Pour les motifs de cercle, définissez un cercle d’un diamètre de 30 μm sur une colonie bactérienne cible pour couvrir toute la colonie. Choisissez la couleur de remplissage de forme blanche.
   6. Pour les motifs croisés brisés, choisissez la forme rectangulaire dans la fenêtre de dessin de motif avec des dimensions de 3 μm x 8 μm. Placez quatre rectangles de cette dimension sur les bords de la colonie cible, tandis que la moitié des motifs ont une superposition avec la colonie.
   7. Pour les motifs de cercle et d’anneau pour les réseaux de micropuits, suivez les étapes 9.6.8 à 9.6.10.
   8. Pour les motifs de cercle, dessinez un cercle de 10 μm de diamètre autour du périmètre du puits. Choisissez la couleur de remplissage de forme blanche.
   9. Pour le motif de l’anneau, dessinez un cercle de diamètre 20 μm, placez-le sur le puits et choisissez la couleur de remplissage de forme blanche.
   10. Dessinez un autre motif de cercle de diamètre 10 μm avec une forme de remplissage de couleur noire et placez-le autour du périmètre du puits.
7. Modifiez le motif et modifiez les formes en fonction de la méthode d’extraction souhaitée. Assurez-vous que le motif souhaité existe dans la zone de travail de l’outil d’éclairage à motifs.
8. Placez l’échantillon dans un support PDMS et pipetez le support défini sur le dessus de l’échantillon pour éviter la déshydratation de l’échantillon et fournir une solution porteuse pour les cellules libérées.
9. Ensuite, remplacez-le par le miroir d’étalonnage.
10. Ajustez la mise au point du microscope pour obtenir une image nette des colonies dans l’hydrogel. Inspectez les colonies pour identifier une colonie d’intérêt.
11. Ici, concevez les motifs lumineux tandis que la vue de la caméra montre les colonies à l’intérieur de l’échantillon pour tester différents modèles pour l’extraction cellulaire.
12. Enregistrez le modèle défini. Après avoir enregistré le modèle défini, sélectionnez la section Contrôle de session.
13. Dans cette section, sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs, ajoutez la séquence enregistrée.
14. Après avoir ajouté la séquence, choisissez l’option permettant de simuler le motif à afficher et à ajuster en fonction de l’emplacement d’exposition souhaité.
    REMARQUE: L’emplacement de l’échantillon peut être ajusté ici pour s’assurer que le motif est projeté avec précision sur la zone ciblée.
15. Ensuite, réglez l’intensité lumineuse à 60% et le temps d’exposition à 40 s sous l’onglet de contrôle LED et démarrez le processus d’exposition.
16. Surveillez la dégradation de l’hydrogel en temps réel et en mode champ lumineux pour assurer la libération des cellules.
    REMARQUE: Empêchez tout mouvement vers l’échantillon pendant l’exposition à la lumière, car cela peut entraîner la dégradation des zones indésirables de l’hydrogel entraînant une contamination croisée.

10. Récupération des cellules

REMARQUE: La procédure de récupération des cellules est identique pour les hydrogels en vrac et les réseaux de micropuits.

1. Après une exposition à la lumière de 365 nm et une libération cellulaire, prélever les cellules à l’aide d’une seringue microlitre et d’un tube microfluidique(Figure 2).
   REMARQUE: La récupération des cellules doit être effectuée immédiatement après l’exposition au modèle. Cela permet une récupération cellulaire localisée avant que les cellules libérées ne s’éloignent de la zone irradiée.
2. Changez le microscope du champ lumineux au filtre FITC ou TRITC pour permettre de visualiser la zone exposée de l’échantillon à l’œil nu.
3. Une fois la zone exposée localisée, placez l’extrémité du tube sur l’endroit irradié. Ensuite, changez le filtre du microscope en champ clair pour surveiller la récupération des cellules en temps réel.
4. Utilisez la seringue fixée à l’autre extrémité du tube pour prélever soigneusement les cellules libérées. Prélever 200 μL de la solution et insérer la solution dans un tube centrifuge de 1,5 mL pour l’analyse ou le placage de l’ADN.

Figure 2: Représentation schématique de la méthode d’extraction pour la collecte des cellules libérées par l’hydrogel. Ici, immédiatement après une exposition aux UV de 365 nm, la dégradation de l’hydrogel et la libération de cellules, le microscope est utilisé pour éclairer l’échantillon d’hydrogel avec la lumière d’un filtre TRITC, ce qui donne un point vert vif couvrant la zone où la libération cellulaire s’est produite. Cela aide l’utilisateur à identifier l’emplacement spatial du prélèvement d’échantillons. Après avoir visualisé cette zone, un tube de collecte attaché à une seringue en microlitre est placé à cet endroit et l’échantillon est prélevé. La microscopie à fond clair à un grossissement de 10x est utilisée pour surveiller l’extrémité de la surface du tube et de l’hydrogel en temps réel pour une collecte précise des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

11. Purification génomique de l’ADN et mesure de la qualité de l’ADN

1. Utilisez un kit de purification de l’ADN (voir Tableau des matériaux)pour extraire l’ADN des isolats de bactéries.
   1. Suivez les spécifications du fabricant décrites dans le manuel du kit de purification de l’ADN²³ jusqu’à la dernière étape (étape 7), nécessitant une élution avec Buffer AE.
   2. Pour l’étape d’élution, suivez les spécifications du fabricant, à la différence d’utiliser 100 μL de Buffer AE au lieu de 200 μL.
   3. Répétez l’élution une fois comme décrit à l’étape 11.1.2. Cette étape conduit à une augmentation du rendement global de l’ADN.
2. Mesurer la qualité de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis (voir Tableau des matériaux).
   1. Allumez le spectrophotomètre. Après l’initialisation de l’appareil, sur la page d’accueil, sélectionnez l’option dsDNA à l’écran.
   2. Ensuite, soulevez le bras du piédestal et nettoyez la position du piédestal avec de l’eau DI et des lingettes non pelucheuses.
   3. Pipette 2 μL d’une solution vierge, ici tampon AE, sur la position du piédestal et abaissez doucement le bras du piédestal et sélectionnez Vide sur l’écran.
   4. Ensuite, soulevez le piédestal et nettoyez la position du piédestal avec de l’eau DI pour éliminer toute matière résiduelle de la mesure précédente.
   5. Chargez l’échantillon (2 μL) sur le piédestal, abaissez le bras du piédestal et sélectionnez le bouton Mesurer à l’écran.
   6. Répétez les étapes 11.2.4 et 11.2.5 pour tous les échantillons.
   7. Une fois la mesure terminée, sélectionnez « Terminer les expériences » à l’écran. Insérez le lecteur flash dans l’appareil et appuyez sur « Exporter les données » à l’écran.

12. Détermination de la viabilité cellulaire à partir d’extraits d’hydrogel et de micropuits

1. Diluer les suspensions bactériennes par un facteur de dilution de 10⁵ à l’aide d’une plaque de 96 puits.
2. Pipette 10 μL de la suspension bactérienne diluée et repérez trois fois sur des plaques ATGN pour chaque suspension bactérienne.
3. Inclinez les plaques pour étaler les cellules sur les surfaces de gélose. Séchez à l’air libre les plaques ATGN contenant les suspensions bactériennes.
4. Incuber les plaques à 37 °C pendant 48 h. Comptez et enregistrez le nombre d’unités de formation de colonies (UFC). Comptez les trois tartinades de suspensions bactériennes sur chaque plaque.
   REMARQUE: Effectuez les étapes 12.1 à 12.4 dans une armoire de sécurité biologique pour éviter la contamination de la plaque.

Results

Pour étudier la capacité de la lumière UV à déclencher une dégradation contrôlée de l’hydrogel pour la libération cellulaire, les hydrogels ont d’abord été encapsulés sur des couvercles thiolés sans présence de bactéries. Chaque hydrogel a été exposé à trois motifs de cercle de lumière répliqués à différentes intensités et temps d’exposition. Le pourcentage de dégradation du gel a été calculé après exposition à la lumière UV à chaque intensité lumineuse, et le temps d’exposition a ensuite été quantifié en couplant des groupes thiol pendants avec un colorant fluorescéine-5-maélimide pour l’imagerie par fluorescence^19,24. Un exemple représentatif de la façon dont ces deux paramètres affectent la dégradation de l’hydrogel est illustré à la figure 3. Comme il est évident, la lumière à motifs fournie par l’outil d’éclairage à motifs fournit un contrôle spatio-temporel de la dégradation de l’hydrogel à une résolution qui ne peut permettre la libération que d’un petit nombre de cellules.

Figure 3: Contrôle de la dégradation de l’hydrogel. La dose de lumière UV et le taux de dégradation de l’hydrogel qui en résulte sont réglables via l’outil d’éclairage à motifs. (Encadré) Deux intensités lumineuses différentes ont été choisies pour la dégradation de l’hydrogel à motifs. Après une exposition aux rayons UV de 365 nm, les hydrogels ont été marqués avec de la fluorescéine-5-maléimide pour l’imagerie par fluorescence. Reproduit (adapté) avec la permission de Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour l’extraction cellulaire, différents modèles de lumière ont été utilisés pour étudier la libération cellulaire (Figure 4). Ici, les cellules bactériennes d’Agrobacterium ont été encapsulées dans des hydrogels en vrac sur des couvercles en verre thiolé, puis cultivées en colonies à micro-échelle. Les hydrogels ont ensuite été inspectés en microscopie à fond clair, et les microcolonies ciblées ont été exposées à des modèles de lumière UV variés. Il a été observé que différents modèles d’exposition influençaient la morphologie des cellules libérées. Ceci est potentiellement bénéfique pour diverses applications. Par exemple, l’exposition d’un motif d’anneau autour de la colonie cible entraîne la libération de la colonie entière encore encapsulée dans un hydrogel PEG protecteur et sans exposition directe aux rayons UV(Figure 4A),ce qui peut préserver les cellules et faciliter la purification en aval. En revanche, en exposant une partie ou la totalité de la colonie à la lumière UV, les cellules peuvent être extraites soit sous forme de grappes de cellules agrégées (Figure 4B), soit sous forme de cellules individuelles libres (Figure 4C).

Figure 4: Contrôle de la morphologie des cellules extraites. (A) Utilisation d’un motif en anneau pour libérer toute la colonie cellulaire, protégée dans une matrice PEG. (B) Utilisation d’un motif croisé brisé pour la libération de cellules dans les agrégats. (C) Utilisation d’un motif croisé pour libérer des cellules individuelles. Reproduit (adapté) avec la permission de Fattahi et al.¹⁹ Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La densité d’ensemencement cellulaire et l’épaisseur de l’hydrogel sont essentielles dans le protocole d’encapsulation, car ces deux paramètres peuvent influencer le nombre de cellules incorporées dans l’hydrogel pour l’observation. Pour le démontrer, des échantillons de cellules d’A. tumefaciens ont été encapsulés dans des hydrogels de deux épaisseurs différentes à l’aide d’espaceurs minces (12,7 μm) ou d’espaceurs épais (40 μm) cultivés et imagés selon les protocoles établis. Des hydrogels plus minces ont entraîné une densité de microcolonie de 90 colonies/mm² dans l’ensemble de l’hydrogel, où un chevauchement minimal des colonies a été observé(figure 5A). En revanche, des épaisseurs d’hydrogel supérieures à 12,7 μm ont entraîné la formation de colonies se chevauchant dans la direction verticale (Figure 5B), ce qui peut entraîner l’extraction de plusieurs colonies. Les colonies qui se chevauchent peuvent provoquer une contamination croisée pendant l’extraction en raison de la nature bidimensionnelle du motif lumineux. Par exemple, une colonie supérieure peut être ciblée, tandis qu’une colonie sous-jacente est également extraite avec elle (Figure 5C). Par conséquent, l’utilisation d’entretoises de 12,7 μm est recommandée pour la préparation de l’hydrogel.

Figure 5: L’épaisseur de l’hydrogel affecte la pureté de l’extraction. (A) En utilisant des entretoises d’une épaisseur de 12,7 μm pour la formation d’hydrogel, les colonies se forment dans un plan focal 10x. (B) La superposition de colonies peut être observée à un grossissement de 10x si des entretoises d’épaisseur supérieure à 12,7 μm sont utilisées. (C) Une contamination croisée peut se produire avec une superposition de colonies lors de la libération cellulaire: (i) un motif d’anneau est utilisé pour libérer une colonie cellulaire ciblée, (ii) la colonie cellulaire ciblée se détache de l’hydrogel et (iii) une deuxième colonie sous-jacente est observée pendant l’exposition à la lumière sous la colonie ciblée. Cette colonie est également enlevée, ce qui entraîne une contamination croisée. Reproduit (adapté) avec la permission de Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Compte tenu des dommages potentiels aux bactéries avec la lumière UV, l’effet de divers micromotifs de lumière UV sur la viabilité cellulaire a été étudié plus en détail à l’aide de modèles, bactéries à Gram positif (B. subtilis) et modèle, bactéries à Gram négatif (E. coli). Chacun a été encapsulé dans des hydrogels en vrac et cultivé dans des colonies à micro-échelle selon des protocoles standard, vérifiant leur compatibilité avec l’hydrogel. Des microcolonies ciblées de tailles équivalentes (26 ± 1 μm de diamètre) ont ensuite été exposées à une dose de lumière constante (168 mJ/mm^2),soit sous forme de motifs circulaires exposant des microcolonies entières à la lumière UV, soit sous forme de motifs croisés qui ne dégradent que les bords d’hydrogel pour minimiser l’exposition à la lumière des cellules. Les cellules ont ensuite été récupérées et plaquées pour quantifier l’UFC/mL récupérée dans chaque colonie. Aucune différence significative dans le niveau de récupération cellulaire n’a été trouvée (Figure 6A). Pour étudier plus avant la pureté des cellules extraites, l’ADN a été extrait d’échantillons d’E. coli et analysé à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Pour les deux modèles, les niveaux de qualité de l’ADN se situent dans une plage A₂₆₀/ A₂₈₀ comprise entre 1,8 et 2,0(Figure 6B),ce qui est dans la plage idéale pour le séquençage^{génomique 25}. Cela démontre que les modèles UV utilisés pour la libération dans les conditions décrites ont un effet minimal sur la quantité de cellules viables récupérées à partir des hydrogels en vrac ou sur la qualité de l’ADN génomique après extraction.

Figure 6: Impact des différents schémas d’exposition à la lumière sur la viabilité cellulaire et la qualité de l’ADN des bactéries libérées par les hydrogels en vrac. (A) Niveaux de récupération cellulaire pour E. coli et B. subtilis après extraction à l’aide de motifs croisés et de motifs circulaires. Pour cette expérience, l’extraction a été effectuée à partir de colonies sphériques de même diamètre (26 μm ± 1 μm) pour s’assurer que le nombre de cellules libérées par chaque colonie était équivalent. Les solutions extraites ont ensuite été plaquées pour calculer l’UFC/mL acquise à partir de chaque motif. L’analyse statistique n’a montré aucune différence significative dans l’UFC/mL obtenue à partir de motifs croisés et circulaires pour E. coli et B. subtilis (valeur P > 0,05, n = 6 pour les deux souches). ( B )Quantificationspectrophotométrique de la qualité de l’ADN pour les cellules isolées d’E. coli à l’aide de motifs croisés et circulaires. Ici, l’analyse statistique n’a pas montré de différence significative dans la qualité de l’ADN pour les modèles utilisés (valeur P > 0,05, n = 6) (C) Images en champ clair de colonies de diamètres égaux exposées à des motifs croisés et circulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les réseaux de micropuits fournissent une interface de criblage alternative de laboratoire sur puce qui offre des fonctionnalités de criblage plus contrôlées que les hydrogels en vrac. Par exemple, les réseaux de micropuits permettent l’ensemencement de bactéries dans des sites de culture discrets où le nombre de cellules dans l’inoculum peut être contrôlé. Les caractéristiques géométriques des micropuits telles que la profondeur et le diamètre des puits sont également contrôlées par des méthodes de microfabrication standard. Avec ces avantages, les micropuits ont été utiles pour étudier la croissance des bactéries sous confinement spatial²⁶, et plus récemment pour la découverte d’interactions symbiotiques et antagonistes entre différentes espèces bactériennes lorsqu’elles sont confinées ensemble à l’échelle microscopique¹⁸. L’extraction cellulaire à partir de puits pour l’analyse génomique telle que le séquençage amplicon 16S est essentielle pour ces applications. En utilisant le même matériau d’hydrogel, la lumière UV peut être exposée sur un puits contenant des cellules d’intérêt, soit sous forme de motifs en cercle ou enanneau. Ce dernier assure la dégradation de l’hydrogel uniquement au niveau du périmètre du micropuit pour éviter l’irradiation directe des cellules. Pour le démontrer, les cellules d’A. tumefaciens exprimant mCherry ont été ensemencées dans des puits, l’hydrogel a ensuite été attaché au réseau de micropuits. Les cellules ont été cultivées puis irradiées avec des motifs en cercle ou en anneau. La membrane a ensuite été colorée avec du colorant fluorescéine-5-maléimide. Les images de fluorescence bicolore ont révélé que la membrane et les cellules à l’intérieur des puits sont enlevées pour les deux modèles d’irradiation¹⁷. Contrairement au format hydrogel en vrac, l’extraction cellulaire ici n’a été observée que sous la forme de grappes de cellules¹⁸.

Figure 7: Images représentatives de la microscopie confocale montrant l’impact du motif lumineux sur l’isolement cellulaire des réseaux de micropuits. (A) Micropuits d’un diamètre de 40 μm contenant des bactéries (rouges) après ensemencement et culture. ( B )Expositionà la lumière à l’aide de motifs de cercle et d’anneau (bleu). (C) La diminution de la fluorescence rouge démontre que les cellules sont extraites des puits irradiés. (D) Image de fluorescence bicolore des membranes et des bactéries après irradiation, indiquant l’élimination de l’hydrogel (vert) et des bactéries (rouge) des puits cibles. (E) Z-stack, image de fluorescence bicolore des puits cibles. La ligne rouge en (D) désigne le plan xz imagé en (E), et la ligne verte en (E) désigne le plan xy imagé en (D). Les échantillons dans les images (C-E) ont été lavés pour l’élimination des cellules libérées, puis fixés et imagés. Barre d’échelle = 40 μm. Reproduit (adapté) avec la permission de van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour quantifier la viabilité des cellules bactériennes et la qualité de l’ADN après extraction dans ce format, les cellules de B. subtilis et d’E. coli ont été ensemencées, cultivées, puis libérées à partir de réseaux de micropuits à l’aide de motifs de cercles et d’anneaux(Figure 8A,B). Les cellules libérées ont ensuite été plaquées sur des plaques d’agar ATGN et la qualité de l’ADN des cellules extraites a été quantifiée. Pour s’assurer qu’un nombre constant de cellules était présent lors de chaque extraction, des micropuits avec des intensités fluorescentes similaires (~ 6000 A.U.) et donc un nombre similaire de cellules ont été ciblés pour la libération. Le nombre de cellules viables extraites à l’aide d’un motif circulaire n’était pas significativement différent du nombre de cellules viables extraites à l’aide d’un motif en anneau pour l’une ou l’autre bactérie(figure 8C). En outre, les niveaux de qualité de l’ADN n’étaient pas significativement différents entre les modèles de cercle et d’anneau pour l’une ou l’autre bactérie(Figure 8D). Par conséquent, à l’instar des résultats dans les hydrogels en vrac, l’application de lumière UV à l’intensité et à la durée spécifiées ici a eu un impact négligeable sur la viabilité et la qualité de l’ADN des cellules extraites des réseaux de micropuits. Ces résultats démontrent que les cellules bactériennes viables peuvent être récupérées sélectivement à partir de micropuits avec un minimum de dommages pour l’analyse en aval.

Figure 8: Impact des différents modèles d’exposition à la lumière sur la viabilité cellulaire et la qualité de l’ADN des bactéries libérées par les réseaux de micropuits. (A,B) Pour E. coli et B. subtilis,des motifs de cercle et d’anneau ont été utilisés pour l’extraction cellulaire à partir de micropuits de 10 μm. Un motif circulaire d’un diamètre de 10 μm et un motif d’anneau d’un diamètre intérieur de 10 μm et d’un diamètre extérieur de 20 μm ont été utilisés dans cette expérience pour l’extraction cellulaire. Des micropuits de même diamètre ont été utilisés pour s’assurer que le nombre de cellules libérées par chaque micropuit était le même. (C) Les solutions extraites ont ensuite été plaquées pour calculer l’UFC/mL acquise à partir de chaque modèle d’exposition. L’analyse statistique n’a montré aucune différence significative dans l’UFC/mL obtenue à partir du cercle et de l’anneau pour E. coli et B. subtilis (valeur P > 0,05, n = 6 pour les deux souches). (D) La spectrophotométrie a été utilisée pour mesurer la qualité de l’ADN des cellules d’E. coli et de B. subtilis à l’aide de motifs en cercle et en anneau. Ici, l’analyse statistique n’a pas montré de différence significative dans la qualité de l’ADN pour les modèles utilisés (valeur P > 0,05, n = 6 pour les deux souches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Conception et fabrication de réseaux de micropuits. (A) Des techniques standard de microfabrication ont été appliquées pour fabriquer des réseaux de micropuits sur des plaquettes de silicium. (B) Chaque substrat était constitué de 7 x 7 réseaux de puits de 10 μm de diamètre avec une profondeur de 20 μm et un pas de 30 μm. (C) Chaque réseau se composait de 225 micropuits. Ce chiffre a été modifié à partir de Barua et al.¹⁸. Droits d’auteur 2021 Frontiers Media. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce manuscrit démontre l’utilisation d’hydrogels photodégradables pour le dépistage et l’isolement des bactéries. Le matériau et l’approche permettent une culture à haut débit, le contrôle des milieux de croissance et des conditions de croissance, ainsi qu’une extraction cellulaire propre et précise de manière simple et rentable. L’extraction ne nécessite qu’un microscope fluorescent couplé à l’outil d’éclairage à motifs et peut être effectuée de manière séquentielle pour isoler plusieurs cibles cellulaires. Chaque extraction prend 5 à 10 minutes et jusqu’à 30 colonies ciblées ont été retirées d’un seul hydrogel. L’un des principaux avantages de l’approche est son adaptabilité à une variété de formats de dosage différents, comme démontré ici avec le criblage à partir d’hydrogels en vrac et de réseaux de micropuits. Le processus de séparation dans les deux formats a été utilisé avec succès pour isoler les bactéries qui présentent un comportement de croissance unique pour le génotypage en aval après la culture et l’observation microscopique, une capacité essentielle pour connecter le génotype cellulaire au phénotype. À ce jour, les caractérisations génomiques des bactéries extraites de ces interfaces ont inclus le séquençage amplicon 16S pour identifier les collections multi-espèces de bactéries à partir de microbiomes environnementaux qui génèrent un comportement de croissance émergent¹⁸, et pour le séquençage du génome entier afin d’identifier avec succès les mutations génétiques qui provoquent des profils de croissance rares dans les cellules présentes dans les bibliothèques mutantes¹⁹.

L’utilisation d’hydrogels en vrac pour le criblage et l’isolement cellulaires est le format le plus simple et le plus simple. Les hydrogels photodégradables en vrac se forment rapidement (25 min) après avoir mélangé les précurseurs sur des couvercles en verre transparent pour encapsuler les cellules dans une matrice de culture cellulaire 3D imagée avec un microscope à fluorescence vertical ou inversé standard. Ainsi, la méthode a le potentiel d’être translationnelle pour les laboratoires de microbiologie courants qui ne disposent pas de ressources ou d’expertise en microfabrication. Un inconvénient de ce format est que les cellules sont orientées de manière aléatoire dans l’hydrogel tridimensionnel. Par conséquent, les cellules peuvent apparaître hors du plan focal lors de l’imagerie avec des objectifs de grossissement plus élevés et l’extraction peut être difficile si les colonies cellulaires sont orientées trop près les unes des autres ou s’il y a une superposition verticale de colonies. Le dépôt d’un hydrogel mince (<13 μm) tel que décrit est essentiel pour atténuer cet inconvénient. L’exposition à des motifs de lumière croisée brisée(Figure 4B)est préférable ici, car ce motif donne des cellules exemptes de l’hydrogel qui ont une exposition minimale à la lumière UV et peuvent être facilement récupérées par placage.

En revanche, le format de réseau de micropuits fournit une interface plus bien contrôlée, car les cellules bactériennes sont divisées en micropuits discrets qui servent de petits sites de culture ou de co-cultures^17,18,26. La dimension, le pas et la densité des micropuits sont fabriqués avec précision à l’aide de techniques photolithographiques standard. Par rapport aux hydrogels en vrac, les bactéries peuvent être extraites de réseaux de micropuits avec un degré de spécificité plus élevé et un risque plus faible de contamination croisée, car les cellules ne sont présentes qu’à des endroits prédéfinis, et non dispersées au hasard dans l’hydrogel. La concentration et les ratios des cellules bactériennes dans la solution d’ensemencement peuvent également être modifiés pour contrôler la quantité et la composition de l’inoculum de micropuit grâce à un processus d’ensemencement caractérisé dans les rapports précédents²⁶, donnant à l’utilisateur une flexibilité dans la conception expérimentale de l’écran. Le principal inconvénient du criblage avec le format de réseau de micropuits est le temps et l’expertise supplémentaires requis pour la microfabrication. La fabrication de micropuits a été estimée à environ 10 $ par réseau, ce qui comprend les coûts des matériaux et les dépenses en salle blanche. De plus, les réseaux de micropuits sont traditionnellement fabriqués à partir de silicium, ce qui peut causer des difficultés d’imagerie puisque les substrats ne sont pas transparents. De plus, une grande quantité de diffusion de la lumière à partir de la surface du silicium peut limiter l’imagerie dans les micropuits et peut diminuer la résolution du motif pendant l’exposition à l’hydrogel avec la lumière UV de l’outil d’éclairage à motifs (vu à la figure 8A,B). Des micropuits similaires ont été fabriqués sur des substrats de quartz transparents pour répondre à ces types de limitations²⁷; cependant, cette fabrication est considérablement plus difficile. L’exposition à des motifs d’anneaux qui éclairent le périmètre du puits est préférable ici pour libérer les cellules libres des puits tout en minimisant l’exposition aux UV.

Le problème le plus courant qui se produit dans l’un ou l’autre format est le détachement de l’hydrogel du substrat sous-jacent pendant la culture en raison d’un gonflement de l’hydrogel. S’il s’agit d’un problème pour les hydrogels en vrac, la présence, la densité et l’uniformité des groupes thiol dans la couche de fixation chimique (MTPS) sur la surface du couvercle en verre de base doivent être vérifiées à l’aide d’une technique de caractérisation de surface appropriée (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). De faibles densités de groupes thiols de surface dus à une fonctionnalisation de surface inefficace peuvent entraîner une faible interaction entre le substrat et l’hydrogel. Si un faible niveau de thiolation de surface se produit, la stabilité de la solution MTPS doit être vérifiée. Lors du nettoyage initial de la lame de verre, il faut veiller à assurer une surface propre avant le traitement MTPS, et veiller à ce que le toluène anhydre soit utilisé pendant la réaction de surface MTPS (section 4 du protocole). Dans le cas des réseaux de micropuits, les surfaces ne sont pas thiolées et les hydrogels se fixent plutôt par le remplissage partiel des puits avec l’hydrogel, qui ancre l’hydrogel au substrat de^{silicium 17}. Si le détachement d’hydrogel est un problème dans ce système, plus de micropuits ou d’autres caractéristiques à l’échelle microscopique peuvent être gravés dans le réseau pour ancrer davantage l’hydrogel au substrat afin de favoriser une fixation plus forte.

Une limitation de la technique dans l’un ou l’autre format est la stabilité limitée des hydrogels en présence de bactéries. Il a été noté que certaines bactéries, telles que A. tumefaciens, peuvent dégrader l’hydrogel au cours de 5-7 jours^17,19, ce qui limite le temps de l’expérience. Des recherches sont en cours sur les mécanismes de dégradation bactérienne; on suppose que les groupes esters présents à partir des monomères de diacrylate sont soumis à une hydrolyse médiée par les bactéries et/ou à une dégradation enzymatique, comme indiqué dans d’autres systèmes^17. Le développement de chimies d’hydrogel plus stables prolongera le temps pendant lequel les bactéries peuvent rester dans l’hydrogel et étendra l’écran aux micro-organismes ayant des taux de croissance plus lents. Une deuxième limite est que dans les deux formats, la récupération et l’extraction cellulaires se produisent dans un environnement ouvert, ce qui entraîne des volumes d’extraction relativement élevés (30-100 μL), qui peuvent être sensibles à la contamination extérieure. Ainsi, il faut veiller à ce que suffisamment de cellules soient présentes dans les colonies cibles tout en minimisant le volume de la solution d’extraction. Pour obtenir suffisamment de cellules pour le placage et la récupération ou pour l’extraction de matériel ADN, il a été observé que dans les hydrogels en vrac, les cellules doivent être cultivées assez longtemps pour atteindre des diamètres de colonies d’au moins 10 μm. Pour réduire le volume requis pour l’extraction cellulaire, il a été observé que l’utilisation d’une seringue et d’un tube en microlitre (figure 2) était plus efficace que le pipetage. Le tube a permis de tirer les isolats du point de libération avec plus de précision, ce qui a nécessité moins de volume de solution et réduit le risque de contamination.

Les travaux futurs impliquent de comprendre l’effet des propriétés mécaniques de l’hydrogel sur la croissance cellulaire, car les caractéristiques mécaniques de ces hydrogels sont bien contrôlées par la sélection de précurseurs monomères appropriés à base de PEG de divers poids moléculaires²⁸, et les interactions mécaniques jouent probablement un rôle important dans le comportement des bactéries²⁹. Comme les matériaux d’hydrogel peuvent être facilement incorporés dans une variété de systèmes et de dispositifs différents, le développement ultérieur est également axé sur l’intégration de ce matériau dans les systèmes microfluidiques. Cela réduirait la solution d’extraction aux volumes femtoliter à picoliter, par rapport aux volumes traditionnels de 30 à 100 μL actuellement requis dans le format de collecte ouverte. Des volumes de solution plus faibles réduiraient considérablement la contamination potentielle et déplaceraient l’approche vers l’isolement et la caractérisation unicellulaires.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95 %
Détergent en poudre Alconox	1104
Sulfate d’ammonium	Fisher Chemical	A702-500	Certifié ACS Autoclave granulaire
SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Centre de stock génétique de Bacillus	1A1135
Microscope droit à fond clair	Olympus Corporation	BX51
Chlorure de calcium, anhydre	Fisher Chemical	C614-500	Pour dessiccateurs Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Acide citrique monohydraté	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Réactif ACS, > 99,0 %
D-Glucose ( Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Kit de mouchoirs	Qiagen	69504	Kit de purification de l’ADN
DOWSIL 184 base en élastomère de silicone	Dow Silicones Corporation		Température de stockage : -30-60 ° ; C
DOWSIL 184 agent de durcissement de l’élastomère de silicone	Dow Silicones Corporation		Température de stockage : < 32 C
Spectrophotomètre de microplaques EPOCH2	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Éthanol anhydre	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand verre de protection de microscope	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest lames de microscope premium uni	Fisher Scientific	12-544-4
Solution de peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contient un inhibiteur, 30 % en poids dans H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Sulfate de magnésium, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Méthanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Réactif ACS, > 99,8 %
Spectrophotomètre NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Azote, comprimé	Matheson	UN1066
Nettoyeur plasma d’oxygène	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaérythritol tétra(mercaptoéthyl) polyoxyéthylène (4 bras-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Stocker entre 15 ° ; C&ndash ; 30 ° ; C
Polydiméthylsiloxane (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Lames de microscope haut de gamme	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Chlorure de sodium	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioréactif, adapté à la culture cellulaire
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98 %, granulés (anhydre)
Phosphate de sodium monobasique dihydraté	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, pour la biologie moléculaire, > 99,0 % (T)
Jauge d’épaisseur en acier inoxydable	Precision Brand Products	77739
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluène, anhydre, 99.8 %	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anhydre, > 99.8 %
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97 %	Sigma-Aldrich	448931-10G
Bouillon de soja tryptique	Sigma-Aldrich	22092-500G	Pour la microbiologie
Agitateur numérique à plaque chauffante Super Nuova	Thermo Scientific	S131825
Sonicateur à ultrasons	Fischer Scientific	FS-110H