Une concentration optimale de saccharose a été déterminée pour l’extraction du glycogène hépatique à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité de saccharose. L’ajout d’une étape d’ébullition de 10 minutes pour inhiber les enzymes dégradant le glycogène s’est avéré bénéfique.
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Article de méthode
L’extraction des molécules de glycogène hépatique pour la détermination de la structure du glycogène
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le glycogène hépatique est un polymère de glucose hyperramifié qui est impliqué dans le maintien du taux de sucre dans le sang chez les animaux. Les propriétés du glycogène sont influencées par sa structure. Par conséquent, une méthode d’extraction appropriée qui isole des échantillons représentatifs de glycogène est cruciale pour l’étude de cette macromolécule. Par rapport à d’autres méthodes d’extraction, une méthode qui utilise une étape de centrifugation à gradient de densité de saccharose peut minimiser les dommages moléculaires. Sur la base de cette méthode, une publication récente décrit comment la densité de la solution de saccharose utilisée lors de la centrifugation a été modifiée (30%, 50%, 72,5%) pour trouver la concentration la plus appropriée pour extraire des particules de glycogène de tailles très variées, limitant ainsi la perte de particules plus petites. Une étape d’ébullition de 10 minutes a été introduite pour tester sa capacité à dénaturer les enzymes dégradant le glycogène, préservant ainsi le glycogène. Il a été démontré que la concentration de saccharose la plus faible (30 %) et l’ajout de l’étape d’ébullition permettent d’extraire les échantillons de glycogène les plus représentatifs.
Introduction
Le glycogène est un polymère complexe et hyperramifié de glucose présent chez les animaux, les champignons et les bactéries1. Chez les mammifères, le glycogène hépatique fonctionne comme un tampon de glucose sanguin, préservant l’homéostasie, tandis que le glycogène musculaire agit comme un réservoir de glucose à court terme pour fournir directement de l’énergie2. La structure du glycogène est souvent décrite par trois niveaux (illustrés à la figure 1) : 1. Les chaînes linéaires sont formées par des monomères de glucose via des liaisons glycosidiques (1→4)-α, les points de ramification étant....
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Protocole
Les foies de souris utilisés pour optimiser cette procédure21 provenaient de 12 souris mâles de fond BKS-DB/Nju (âgées de 7,2 semaines, voir le tableau des matériaux). L’utilisation d’animaux a été approuvée par le Comité d’éthique et de protection des animaux de l’hôpital Renmin de l’Université de Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Mouchoirs en papier
- Peser le foie de souris (1 à 1,8 g de foie entier de chaque souris).
- Congelez rapidement le foie de souris dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C.
2. Préparation du tampon et des réacti....
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Résultats
Bien que la procédure décrite ci-dessus soit la méthode la plus optimale (30 % de saccharose avec l’ajout d’une étape d’ébullition de 10 minutes), des données sont fournies ici pour le glycogène extrait par trois concentrations de saccharose (30 %, 50 %, 72,5 %), avec et sans étape d’ébullition, comme décrit précédemment21. Conformément au protocole, la pureté, le rendement brut et le rendement en glycogène du glycogène sec extrait par différentes conditions sont donnés dans le tableau 1
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Discussion
Des études antérieures ont montré que la structure du glycogène est importante pour ses propriétés ; Par exemple, la taille moléculaire affecte le taux de dégradation du glycogène10 et la distribution de la longueur de la chaîne affecte sa solubilité26. Pour bien comprendre ces relations, il est important d’extraire le glycogène avec une procédure qui isole, autant que possible, un échantillon représentatif et non endommagé. Les méthodes traditionnelles d’extraction utilisa.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à M. Gaosheng Wu et Mlle Yunwen Zhu pour l’assistance technique avec FACE et à M. Zhenxia Hu et M. Dengbin pour l’assistance technique avec la SEC. MAS est soutenu par une bourse de recherche avancée de l’industrie du Queensland, la Fondation Mater, Equity Trustees et les fiducies L G McCallam Est et George Weaber. Ce travail a été soutenu par le programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu, une subvention de la Fondation des sciences naturelles de Chine C1304013151101138 et le programme 2017 des talents d’innovation et d’entrepreneuriat du Jiangsu. Les figures 1 à 5
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonate (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | solution 0,1 M |
| Acide acétique | SIGMA Aldrich | 695092 | 0,1 M, solution pH 3,5 |
| Agilent 1260 Infinity Système SEC | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Chromatographie d’exclusion stérique (SEC) | |
| BKS-DB/Nju souris de fond | Institution de recherche biomédicale de l’Université de Nanjing | ||
| Kit de dosage D-Glucose (format GOPOD) | Megazyme | K-GLUC | |
| Acide éthylènedinitrilotétraacétique (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogénéisateur | IKA | T 25 | |
| 0,1 M solution | |||
| Acide chlorhydrique | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 M |
| Système P/ACE MDQ plus | Ab Sciex, US | Électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE) | |
| Détecteur d’indice de réfraction | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Chromatographie d’exclusion stérique (SEC) | |
| Acétate de sodium | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, solution de pH 4,5 |
| Azoture de sodium | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Chlorure de sodium | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Cyanoborohydrure de sodium | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M solution |
| Fluorure de sodium | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Hydroxyde de sodium | SIGMA Aldrich | 43617 | Solution 0,1 M |
| Nitrate de sodium | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Pyrophosphate de sodium | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pré-colonne, 1 000 et 10 000 colonnes | Polymer Standards Services, Mayence, Allemagne | Chromatographie d’exclusion stérique (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Tubes ultracentrifuges | Beckman | 4 mL, Tube ultra-transparent à paroi mince à toit ouvert, 11 x 60 mm |
Références
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
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Réimpressions et autorisations
