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Article de méthode

Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

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DOI :

10.3791/63092

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28 octobre 2021

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1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.

Résumé

Les expériences de protéomique au fusil de chasse basées sur la spectrométrie de masse nécessitent plusieurs étapes de préparation des échantillons, y compris la digestion et le nettoyage des protéines enzymatiques, ce qui peut prendre des heures importantes de travail de laboratoire et présenter une source de variabilité de lot à lot. L’automatisation des laboratoires avec des robots de pipetage peut réduire le travail manuel, maximiser le débit et augmenter la reproductibilité de la recherche. Pourtant, les prix de départ élevés des stations d’automatisation standard les rendent inabordables pour de nombreux laboratoires universitaires. Cet article décrit un flux de travail de préparation d’échantillons protéomiques à l’aide d’un système d’automatisation open source abordable (The Opentrons OT-2), y compris des instructions pour mettre en place des étapes semi-automatisées de réduction des protéines, d’alkylation, de digestion et de nettoyage; ainsi que des scripts Python open source pour programmer le système OT-2 via son interface de programmation d’applications.

Introduction

La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échantillons cliniques sans avoir besoin de s’appuyer sur des anticorps1,2.

Pour préparer des échantillons de protéines pour l’analyse protéomique au fusil de chasse, les protéines extraites d’échantillons biologiques (par exemple, les cellules et les tissus) doivent généralement d’abord être traitées à l’aide de longs protocoles, y compris la mesure de la concentration en protéines de l’échantillon, la réduction des protéines et l’alkylation, et la digestion enzymatique en peptides. De plus, les protéines extraites dans des tampons de lyse courants contenant des détergents nécessitent souvent des étapes supplémentaires d’échange de tampon ou d’élimination du détergent avant l’analyse, car le détergent peut interférer avec la digestion de la trypsine et dégrader considérablement les performances de l’analyse en aval par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)3. Les peptides sont généralement dessalés, séchés et reconstitués dans des solvants compatibles LC-MS/MS après digestion enzymatique. Ces procédures de biochimie des protéines peuvent être laborieuses et prendre beaucoup de temps. Ainsi, ils continuent de limiter le débit des flux de travail protéomiques et contribuent à la variabilité des données acquises4,5. Les erreurs et les biais humains ont été reconnus comme des facteurs cruciaux affectant la variance et la reproductibilité des données6,7. Pour minimiser les erreurs humaines dans les flux de travail de préparation des échantillons par spectrométrie de masse, des systèmes robotiques de pipetage automatisés ont été utilisés pour améliorer le débit et la reproductibilité de l’identification et de la quantification des protéines à partir de la protéomique au fusil de chasse et de l’analyse ciblée par spectrométrie de masse, où de telles avancées ont été saluées comme essentielles pour poursuivre la poussée en faveur de l’adoption généralisée des technologies protéomiques dans les domaines critiques de la recherche et des milieux cliniques8, 9,10,11,12,13. Cependant, la plupart des protocoles existants utilisent des plates-formes robotiques de manipulation de liquides qui nécessitent des investissements et une formation substantiels, ce qui limite leur utilité dans de nombreux laboratoires dans l’environnement universitaire ou autrement avec un budget limité.

Cet article décrit un protocole qui utilise un système de manipulation robotique de liquides à faible coût et open source, l’OT-2, pour semi-automatiser un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse. L’OT-2 a un coût inférieur à celui de nombreux autres systèmes robotiques de manipulation de liquides et, au moment de la rédaction de cet article, coûte environ 5 000 dollars américains. Si l’on tient compte des prix des différents modules et logiciels de laboratoire, le coût total de la mise en place d’expériences dans ce protocole au moment de la rédaction est d’environ 10 000 $, ce qui le rend plus abordable pour un ensemble considérablement plus large de laboratoires par rapport à des options plus coûteuses. L’OT-2 est compatible avec la programmation open-source via des scripts Python et offre une grande flexibilité dans la conception de protocoles DIY définis par l’utilisateur. À l’aide de trois scripts développés en interne, les protocoles ci-dessous couvrent l’exécution d’un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse sur la station OT-2 avec un étalon protéique archétypique (albumine sérique bovine; BSA) et un échantillon de protéine complexe d’un lysat cardiaque humain normal (Figure 1). Les procédures de traitement (1) d’un échantillon de BSA et (2) d’un échantillon de lysat cardiaque complexe sont détaillées dans les sections 1, 2, 5, 6 et 3, 4, 5, 6 du Protocole, respectivement. Les billes magnétiques modifiées par le carboxylate sera-Mag sont utilisées dans la préparation d’échantillons améliorés en phase solide (SP3) pour éliminer les détergents et les sels dans les échantillons de protéines et de peptides. Les digestions tryptiques de l’albumine sérique bovine et des protéines cardiaques humaines sont ensuite nettoyées par des billes SP3 et soumises à l’analyse LC-MS/MS. Les spectres de masse sont ensuite analysés à l’aide du logiciel MaxQuant pour l’identification des peptides et des protéines. Les résultats représentatifs que nous avons réalisés montrent que le protocole atteint d’excellents coefficients techniques de variation (CV) tout en économisant du temps de banc et n’est pas inférieur à la digestion à la main.

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Protocole

Les scripts Python développés ont été déposés sur GitHub à l’adresse : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Une copie des scripts est remise dans le dossier supplémentaire 1. Veuillez vous référer au référentiel GitHub pour les dernières versions.

1. Préparations expérimentales

  1. Vérifiez le matériel requis avant de démarrer le protocole.
    REMARQUE: Les composants matériels suivants sont requis: pipettes OT-2, embouts de pipette, ensemble de racks de tubes 4-en-1, ensemble de blocs en aluminium, module magnétique, module de température, plaques de puits de 96 puits de 2 mL de profondeur (voir tableau des matériaux).

2. Préparation d’échantillons par spectrométrie de masse (SEP) avec une seule protéine d’albumine sérique bovine (BSA)

  1. Ouvrez le script NoSP3_digestion.py dans un éditeur de texte et spécifiez les variables spécifiques à l’expérience selon vos besoins dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT.
    REMARQUE: Les variables spécifiques à l’expérience comprennent le nombre d’échantillons et de réplication; la concentration de l’échantillon; le volume des réactifs dithiothréitol - TNT, iodoacétamide - IAA et trypsine; le temps d’incubation TNT et IAA, et la pointe de départ pour la pipette P20/P50 et P300).
    1. Ouvrez l’application Opentrons et téléchargez le script dans l’onglet PROTOCOL de l’application Opentrons.
      REMARQUE: L’application Opentrons peut être téléchargée à partir de Reference14 sur un ordinateur local. Au moment de la rédaction de cet article, la pipette électronique Opentrons P50 n’est pas disponible à l’achat dans la boutique Opentrons. Il a été remplacé par la pipette électronique monocanal P20 compatible avec les volumes spécifiés dans le protocole. Des notes et des instructions ont été faites dans le script pour remplacer la pipette P50 par la pipette P20. Les utilisateurs peuvent avoir besoin de tester et de vérifier la compatibilité de la pipette particulière avec ce protocole en suivant les instructions de l’API Opentrons.
  2. Ouvrez l’onglet ROBOT et effectuez l’étalonnage du pont robot calibrater le pont dans l’onglet ROBOT en suivant les instructions étape par étape à l’écran dans l’application Opentrons.
    REMARQUE: Cette étape n’est requise que si elle n’a pas été précédemment implémentée ou si le robot a récemment été transféré.
  3. Cliquez sur le bouton MANAGE PIPETTES pour effectuer l’étalonnage de la longueur de la pointe, suivi de l’étalonnage du décalage de la pipette pour calibrer la position par défaut de la combinaison de la pointe et de la pipette.
    REMARQUE : cette étape est requise si une pipette est utilisée pour la première fois.
  4. Placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT-2 spécifié dans le script Python (Figure 2).
    REMARQUE: Assurez-vous que le module de température est connecté et sous tension, et le bloc d’aluminium est placé sur le dessus du module de température.
  5. Ouvrez l’onglet CALIBRER et effectuez l’étalonnage pour la combinaison de labware et de pipettes requise dans ce script python.
    REMARQUE: L’application Opentrons enregistrera les paramètres d’étalonnage, ce qui n’est pas nécessaire pour les applications futures avec le même matériel de laboratoire et les mêmes pipettes.
  6. Préparer 5 mL de solution de bicarbonate d’ammonium (ABC) de 100 mM (pH ~ 8,0) en dissolvant 39,53 mg d’ABC dans de l’eau de qualité spectrométrie de masse pour un volume total de 5 mL dans un tube conique de 15 mL. Placez le tampon de bicarbonate d’ammonium dans le puits A1 du rack à tubes 4-en-1 avec le dessus du porte-tube de 15 mL + 50 mL.
  7. Préparer 1 mL de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tube de protéines à faible liaison de 2,0 mL (voir tableau des matériaux). Placez l’échantillon dans le puits A1 du porte-tubes 4 en 1 avec le dessus du porte-tube de 2 mL.
  8. Placez manuellement des tubes à faible liaison de protéines de 2,0 mL dans les puits de A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, etc. dans le bloc d’aluminium au-dessus du module de température.
    REMARQUE: La pipette robotisée distribuera les échantillons dans l’ordre vertical à partir de A1 (premier échantillon) jusqu’au dernier échantillon par défaut. La distribution horizontale peut être spécifiée. Reportez-vous à 15 pour plus de détails. Le nombre total de tubes qui doivent être préparés devrait être égal au nombre total d’échantillons (c.-à-d. le nombre d’échantillons biologiques multiplié par le nombre de répétitions techniques par échantillon).
  9. Préparer 1 mL de TNT de 60 mM en dissolvant 9,26 mg de solides TNT dans de l’eau de qualité spectrométrie de masse pour un volume total de 1 mL. Placez le DTT dans le puits A6 du porte-tubes 4 en 1 avec le support de tube de 2 mL sur le dessus.
    ATTENTION : La TNT est nocive pour les yeux, la peau et le système respiratoire humains. Portez un EPI et manipulez-le sous une hotte chimique. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité du fabricant pour connaître les procédures appropriées.
  10. Observez pendant que le robot transfère un volume approprié de tampon ABC aux tubes d’échantillonnage dans le bloc d’aluminium.
    REMARQUE: Le volume total d’ABC et de mélange de protéines dans chaque tube est de 100 μL, et le volume de tampon ABC est calculé dans le script (V = 100 μL moins le volume de 100 μg d’échantillon de protéines).
  11. Assurez-vous que le robot transfère 100 μg de protéine BSA dans chaque tube avec tampon ABC.
    REMARQUE: Une expérience typique peut utiliser jusqu’à 100 μg de protéines pour la digestion des protéines, soit 50 μL de 2,0 μg / μL pour cet échantillon de BSA.
  12. Vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que la TNT a été chargée dans A6 du rack de tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant de reprendre le protocole. Assurez-vous qu’un tube TNT est placé dans le puits A6 et ouvrez son capuchon. Cliquez sur le bouton Reprendre dans l’application Opentrons pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 10 μL de solution TNT à chaque puits d’échantillonnage, suivi de cinq cycles de mélange.
  13. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous de fermer les bouchons sur les tubes d’échantillonnage. Fermez manuellement les capuchons des tubes et cliquez sur Reprendre pour continuer. Attendez que le module de température du robot commence à chauffer le bloc d’aluminium jusqu’à ce que la température atteigne 55 ° C, suivie d’une incubation de 5 minutes pour permettre aux échantillons d’atteindre 55 ° C.
    REMARQUE: Le robot maintiendra la température à 55 ° C pendant 30 minutes pour permettre la réduction des protéines par DTT pendant l’incubation.
  14. Pendant les 30 minutes d’incubation de la TNT, préparer 1 mL de 187,5 mM d’iodoacétamide (IAA) en dissolvant 34,68 mg d’AIA dans le tampon ABC pour un volume total de 1 mL. Enveloppez manuellement la solution IAA avec du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.
    ATTENTION : L’AAI peut causer une irritation oculaire et respiratoire grave. Manipulez-le sous une hotte chimique en portant un EPI approprié.
  15. Assurez-vous que le module de température du robot refroidit à la fin de l’étape d’incubation TNT de 30 minutes.
    REMARQUE: Une fois que la température du module atteint 22 ° C, le module maintient la température pendant 5 minutes pour permettre aux échantillons de refroidir complètement.
  16. Décapsulez les tubes d’échantillonnage lorsque le programme du robot est en pause et affichez le message d’avertissement : Assurez-vous d’ouvrir les bouchons sur les tubes d’échantillonnage. Cliquez sur Reprendre pour continuer.
  17. Vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause avec un message d’avertissement : Assurez-vous que l’IAA a été chargé dans B6 du rack à tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant de reprendre le protocole. Confirmez l’emplacement du rack du tube IAA et ouvrez le capuchon du tube. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 10 μL d’IAA à chaque tube d’échantillon, suivi de cinq cycles de mélange.
  18. Boucher les tubes d’échantillonnage lorsque le programme du robot est mis en pause et afficher le message suivant : Fermez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage et recouvrez les tubes d’échantillonnage avec du papier d’aluminium. Couvrez tout le bloc d’aluminium avec un morceau de papier d’aluminium propre. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Attendez que les échantillons soient incubés à 22 °C pendant 30 min. Assurez-vous que le module de température du robot se désactive à la fin de l’incubation iaa.
  19. Préparer un mélange de solution de trypsine pendant l’incubation de l’IAA (étape 2.19) à la concentration finale de 0,2 μg/μL : dissoudre 20 μg de spectrométrie de masse/trypsine de qualité séquençage dans 100 μL d’eau de qualité MS.
  20. Placez la solution de trypsine dans le puits C6 du rack de tubes de 2 mL avec le bouchon de tube ouvert lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement: Assurez-vous que la trypsine a été chargée en C6 du rack de tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant de reprendre le protocole. Cliquez sur Reprendre pour continuer.
  21. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message d’avertissement : Ouvrez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage sur le module de température. Décapsulez les tubes d’échantillonnage et cliquez sur Reprendre pour continuer. Restez à l’affût pendant que le robot transfère 10 μL de trypsine dans chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq cycles de mélange.
  22. Envelopper les bouchons du tube d’échantillonnage avec un film de paraffine, transférer tous les échantillons dans un mélangeur à température contrôlée et incuber à 37 °C pendant 16 à 20 h avec une agitation à 600 tr/min.
    REMARQUE: La digestion de la trypsine peut également être effectuée directement sur le module de température à 37 ° C.

3. Nettoyage des peptides à l’aide de perles paramagnétiques SP3

  1. Le lendemain, après la digestion nocturne de la trypsine, faites tourner brièvement les échantillons à l’aide d’une microcentrifugeuse de paillasse (≤2 000 x g) (voir Tableau des matériaux) et placez les échantillons sur un support à tubes magnétiques. Laissez reposer les échantillons pendant 2 min.
    1. Transférer soigneusement le surnageant avec une pipette dans un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible liaison de protéines. Conservez les échantillons au réfrigérateur et passez aux étapes 3.2 à 3.9.
      REMARQUE: Pour un stockage à long terme, conservez les échantillons à -80 ° C.
  2. Ouvrez le script Python SP3_peptide_cleanup.py dans un éditeur de texte et spécifiez-le si nécessaire dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT.
    REMARQUE: Les variables spécifiques à l’expérience comprennent le nombre d’échantillons et de répliques, le volume de peptides à transférer, le volume de réactifs (billes, acétonitrile, DMSO), la pointe de départ pour les pipettes P20/P50 et P300, et bien commencer dans la plaque de puits profond sur le module magnétique. Chaque échantillon de digestion BSA contient environ 120 μL de volume de digestion, qui sera alicité en deux répliques techniques avec 55 μL dans chaque réplicat. Pour nettoyer uniquement la moitié du résumé, remplacez la variable numérique de réplication par 1.
  3. Téléchargez le script dans l’onglet PROTOCOL de l’application Opentrons .
  4. Placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT-2 spécifié dans le script Python (Figure 3). Assurez-vous que le module magnétique est sous tension et connecté au robot. Placez une nouvelle plaque de puits de 2 mL de 96 puits de profondeur (voir tableau des matériaux) sur le dessus du module magnétique.
  5. Ouvrez l’onglet CALIBRER et effectuez l’étalonnage pour la combinaison de labware et de pipettes requise dans ce script Python.
    REMARQUE: L’étalonnage pour les mêmes combinaisons de matériel de laboratoire et de pipette ne doit être effectué qu’une seule fois, et l’application Opentrons enregistrera les paramètres d’étalonnage.
  6. Placer les échantillons digérés (surnageant prélevé à l’étape 3.1) dans le rack tubulaire de 2,0 mL dans l’ordre vertical dans les puits A1, B1....
  7. Préparer 15 mL d’acétonitrile compatible LC-MS/MS dans un tube conique de 50 mL et placer le tube dans le puits A3 dans le rack à tubes 4 en 1 avec le support de tube de 15 mL + 50 mL.
  8. Préparer 5 mL de DMSO à 2 % en ajoutant 100 μL de DMSO avec 4,9 mL d’eau de qualité spectrométrie de masse dans un tube conique de 15 mL. Placez le tube dans le puits A1 dans le rack à tubes de 15mL + 50mL.
  9. Étiquetez un tube conique vide de 50 mL comme déchet et placez-le dans le puits B3 dans le rack de tubes de 15 mL + 50 mL.
  10. Préparez les billes SP3 conformément à la référence 16.
    1. Préparer une quantité appropriée de billes mélangées dans un tube de microcentrifugation de 2,0 mL.
      REMARQUE: Chaque réaction de nettoyage peptidique nécessite 10 μL de billes mélangées. Par exemple, préparez un minimum de 40 μL de billes mélangées pour quatre réactions de nettoyage.
    2. Laissez le mélange de billes reposer sur le support magnétique pendant 2 min. Retirez soigneusement le surnageant avec une pipette et mesurez le volume du surnageant avec une pipette.
    3. Calculez le volume restant de billes et ajoutez 5 à 10 fois l’eau de qualité spectrométrie de masse (par exemple, 100 à 200 μL d’eau pour 20 μL de perles) et le vortex (vitesse 10) pendant 10 s. Asseyez les perles sur le support magnétique pendant 2 min.
    4. Répétez les étapes de lavage à l’eau pour un total de trois lavages.
    5. Remettre en suspension les billes finales dans de l’eau de qualité MS jusqu’à une concentration finale de 50 μg/μL. Placer les billes magnétiques lavées dans le puits A6 dans le rack tubulaire de 2,0 mL.
      REMARQUE : Il est recommandé de remettre en suspension les billes à une concentration de 10 μg/μL16. Dans l’effort d’optimisation actuel, la concentration finale a été modifiée à 50 μg/μL pour minimiser le volume total du mélange perle-peptide-acétonitrile.
  11. Assurez-vous que le robot transfère 55 μL des échantillons digérés aux puits situés dans les plaques de puits profond du module magnétique.
  12. Vérifiez que le protocole du robot est mis en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que les billes préparées ont été chargées dans le format A6 du rack de tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant de reprendre le protocole. Vortex les perles, puis tournez brièvement pendant 5 s sur une mini centrifugeuse de paillasse et placez les perles dans le puits A6 du rack à tubes de 2 mL avec le bouchon ouvert. Restez à l’affût pendant que le robot mélange les perles 10 fois pendant cinq tours en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE: Le robot transfère 10 μL de billes à chaque échantillon digéré dans les plaques de puits profond, suivi de cinq fois de mélange.
  13. Assurez-vous que le robot transfère 1 292 μL d’acétonitrile à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois en pipetant de haut en bas pour faciliter la liaison des peptides et des perles.
    REMARQUE: Chaque transfert est effectué sur plusieurs tours car la pipette P300 ne peut transférer que jusqu’à 300 μL à la fois.
  14. Assurez-vous que le robot mélange tous les échantillons cinq fois en pipetant de haut en bas dans la plaque de puits profond.
  15. Attendez que le module magnétique soit engagé et que les échantillons soient incubés sur le module pendant 2 min.
  16. Restez à l’affût pendant que les vitesses d’aspiration et de distribution du pipetage sont réglées pour ralentir à 25 μL/s par rapport à la valeur par défaut de 150 μL/s.
    REMARQUE: Le robot retire lentement le surnageant de chaque puits et le jette dans le tube à déchets pendant que le module magnétique est engagé.
  17. Attendez que les vitesses d’aspiration et de distribution du pipetage soient rétablies au réglage par défaut. Observez que le module magnétique se désengage.
  18. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que le capuchon du tube ACN est éteint. Décapsulez manuellement le tube acétonitrile et replacez-le dans le rack du tube. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 1 mL d’acétonitrile pour laver chaque échantillon et mélange immédiatement 10 fois.
  19. Assurez-vous que le robot mélange tous les échantillons 10 fois pour les laver.
  20. Restez à l’affût pendant que le module magnétique est engagé et incubez les échantillons pendant 2 min.
  21. Attendez que le robot modifie la vitesse d’aspiration du pipetage pour ralentir et retirer lentement le surnageant et le distribuer dans le tube à déchets.
  22. Observez pendant que le robot incube les échantillons sur le module magnétique pendant 60 s pour permettre à l’acétonitrile résiduel de s’évaporer, puis modifie les vitesses d’aspiration de pipetage par défaut. Observez que le module magnétique se désengage.
  23. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche à nouveau le message : Vortex DMSO et ouvrez les majuscules. Vortexez manuellement le DMSO à 2 % pendant 10 s et replacez-le dans le puits A1 dans le rack tubulaire de 15 mL-50 mL. Cliquez sur Reprendre pour continuer.
  24. Assurez-vous que le robot transfère 80 μL de DMSO à 2 % à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.
  25. Assurez-vous que le robot mélange tous les échantillons 10 fois pendant cinq tours supplémentaires.
  26. Restez à l’affût pendant que le module magnétique est engagé et incubez les échantillons pendant 2 min.
  27. Observez pendant que le robot modifie la vitesse d’aspiration de la pipette pour ralentir (25 μL / s) et transfère lentement le surnageant aux puits vides dans la plaque de puits profond.
  28. Attendez que le robot incube des échantillons sur le module magnétique pendant 2 minutes pour enlever les billes résiduelles dans les échantillons.
  29. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Placez de nouveaux tubes de 2 mL dans le rack de tubes de 2 mL et assurez-vous que le nombre de tubes correspond au nombre total d’échantillons.
  30. Placer le premier tube de microcentrifugation de 2 mL dans le puits directement après l’échantillon final de digestion BSA. Cliquez sur Reprendre pour continuer.
    REMARQUE : Par exemple, les six échantillons de digestion BSA testés dans ce protocole se trouvent dans les puits A1, B1, C1, D1, A2 et B2. Par conséquent, le nouvel ensemble de tubes de 2,0 mL est placé dans les puits B3, C3, D3, ... et ainsi de suite.
  31. Observez pendant que le robot transfère 88 μL d’échantillons des puits dans la plaque de puits profond vers le nouvel ensemble de tubes de 2,0 mL.
    REMARQUE: Le volume transféré (1,1 x 80 μL) dans le protocole est optimisé pour s’assurer que tout le volume de l’échantillon est aspiré dans les embouts de pipette.
  32. Restez à l’affût pendant que le robot modifie la vitesse d’aspiration de la pipette par défaut et désengage le module magnétique.
  33. Sécher manuellement les peptides nettoyés dans un évaporateur sous vide (voir tableau des matériaux) et passer à la section 5 ou stocker des échantillons séchés à -20 °C.

4. Préparation d’échantillons de SEP avec du lysat de protéines du cœur humain (5 mg/mL) avec des billes paramagnétiques SP3

  1. Ouvrez le script Python SP3_digestion.py et spécifiez les valeurs des variables dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT.
    REMARQUE: Les variables comprennent le nombre d’échantillons et de répliques, la concentration de l’échantillon, le volume de réactifs (TNT, IAA, trypsine, billes, éthanol à 100% et 80%), le temps d’incubation de la TNT et de l’IAA, la pointe de départ pour les pipettes P20/P50 et P300, et bien commencer dans la plaque de puits profond sur le module magnétique.
  2. Suivez les étapes 2.2 à 2.23 de la rubrique 2 pour la préparation d’échantillons de SEP avec une seule protéine d’albumine sérique bovine pour l’incubation de TNT et d’IAA. Reportez-vous à la Figure 1 pour la configuration du pont du robot dans ces étapes.
  3. Préparer un mélange de billes SP3 fraîches (20 μL de billes par réaction de nettoyage) pour le nettoyage des protéines (comme spécifié à l’étape 3.10) pendant les étapes d’incubation de la TNT et de l’IAA (étapes 2.15 et 2.19). Placez les perles dans le puits D6 sur le support tubulaire de 2 mL.
  4. Vérifiez que le programme du robot est mis en pause avec le message : Ouvrez les bouchons de tube. Décapsulez manuellement les tubes d’échantillonnage dans le bloc d’aluminium au-dessus du module de température et cliquez sur Reprendre pour continuer.
  5. Assurez-vous que le robot transfère tous les échantillons des tubes de 2,0 mL vers une nouvelle plaque de puits profond au-dessus du module magnétique.
  6. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que les billes préparées ont été chargées dans D6 du rack de tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant de reprendre le protocole. Ouvrez le capuchon du tube de perles et cliquez sur Reprendre pour continuer.
  7. Observez pendant que le robot transfère 20 μL de billes à chaque puits dans la plaque de puits profond avec cinq cycles de mélange des perles et cinq cycles de mélange du mélange échantillon-perles.
  8. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que 100 % d’éthanol a été chargé dans le format A3 du rack tubulaire de 15 mL-50 mL situé dans l’emplacement 5 avant la reprise du protocole. Préparer 10 à 20 mL d’éthanol à 100 % (c.-à-d. éthanol à 200 épreuves, voir tableau des matériaux) dans un tube conique de 50 mL et le placer dans le puits A3 du rack. Cliquez sur Reprendre pour continuer.
  9. Restez à l’affût pendant que le robot transfère 140 μL d’éthanol à 100% à chaque puits de la plaque immédiatement suivi de 10 cycles de mélange pour faciliter la liaison des peptides aux billes.
  10. Assurez-vous que le robot mélange chaque échantillon en piquant de haut en bas 10 fois par tour pour un total de cinq tours de mélange.
  11. Restez à l’affût pendant que le module magnétique est engagé et incubez les échantillons sur le module pendant 2 min.
  12. Observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir (25 μL / s) et aspire le surnageant de chaque puits et le distribue dans le tube à déchets.
  13. Attendez que le robot rétablisse la vitesse de pipetage par défaut et désengage le module magnétique.
  14. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que 80 % d’éthanol a été chargé dans le format A4 du rack tubulaire de 15 mL à 50 mL situé dans l’emplacement 5 avant la reprise du protocole. Préparer manuellement 20 mL d’éthanol à 80 % en mélangeant 4 mL d’eau de qualité MS avec 16 mL d’éthanol à 100 % (c.-à-d. 200 épreuves). Placez l’éthanol à 80% dans le puits A4 dans le rack à tubes. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 1 mL d’éthanol à 80 % à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.
  15. Observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir (25 μL / s), aspire le surnageant de chaque puits et le distribue dans le tube à déchets. Attendez que le robot rétablisse la vitesse de pipetage par défaut et désengage le module magnétique.
  16. Ouvrez le capuchon de la solution ABC lorsque le programme du robot est en pause et affiche le message : Ouvrez le capuchon sur le tube ABC. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Restez à l’affût pendant que le robot désengage le module magnétique, transfère 250 μL d’ABC à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.
    REMARQUE: Cette étape consiste à laver les échantillons avec ABC.
  17. Assurez-vous que le robot engage le module magnétique et incube des échantillons sur le module pendant 2 min.
  18. Observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir (25 μL / s) et transfère le surnageant de chaque puits au tube de déchets. Attendez que le robot transfère 100 μL de tampon ABC à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.
  19. Vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message suivant : Assurez-vous que les nouveaux tubes de collecte ont été placés dans un bloc d’aluminium de 2,0 mL avant de reprendre le protocole. Placez un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible rétention de protéines dans le bloc d’aluminium immédiatement après le dernier tube d’échantillon initialement dans le bloc. Cliquez sur Reprendre pour continuer. Restez à l’affût pendant que le robot transfère chaque échantillon dans le tampon ABC vers les nouveaux tubes de 2,0 mL.
    REMARQUE: Examinez les puits et transférez manuellement tout échantillon résiduel dans les tubes si nécessaire.
  20. Préparer une quantité appropriée de trypsine de qualité MS (10 μL par échantillon) en dissolvant 20 μg de trypsine de qualité MS dans de l’eau de qualité MS à une concentration finale de 0,2 μg/μL lorsque le programme du robot est interrompu et affiche le message suivant : Assurez-vous que la trypsine (0,2 μg/μL) a été chargée dans le C6 du rack de tubes de 2 mL situé dans l’emplacement 4 avant la reprise du protocole. Assurez-vous que le robot transfère 10 μL de trypsine à chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq cycles de mélange.
  21. Envelopper les bouchons du tube d’échantillonnage avec un film de paraffine, transférer tous les échantillons dans un mélangeur à température contrôlée et incuber à 37 °C pendant 16 à 20 h en agitant à 1 000 tr/min.
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer la digestion avec des secousses à 1 000 tr / min pour minimiser les précipitations des perles pendant l’incubation pendant la nuit.

5. Nettoyage des peptides à l’aide de perles paramagnétiques SP3

  1. Suivez les instructions par étapes de l’étape 2, Nettoyage des peptides à l’aide de perles paramagnétiques SP3.

6. Chromatographie liquide et spectrométrie de masse

  1. Remettre en suspension les peptides BSA (étapes 2-3) et lysat cardiaque (étape 4) dans de l’acide formique à 0,1 % en ajoutant 1 mL d’acide formique LC-MS de grade 99 % dans l’eau de SEP à un volume total de 1 L.
    ATTENTION : L’acide formique est un acide fort. Il est très corrosif pour les yeux, la peau et le système respiratoire. Manipuler avec soin sous une hotte chimique portant un EPI.
  2. Quantifier la concentration de peptides post-digestion à l’aide d’un kit de dosage peptidique quantitatif17 et injecter 0,5 μg de digestion BSA et 1,5 μg de digestion cardiaque pour l’analyse LC-MS/MS.
  3. Mettre en place le programme de chromatographie liquide pour l’analyse LC-MS/MS.
    REMARQUE: Dans une configuration typique, les digestes peptidiques peuvent être chargés sur une colonne C18 en phase inversée (particule de 3 μm; pore de 100 Å; 75 μm x 150 mm; voir tableau des matériaux) en utilisant les paramètres fournis dans le fichier supplémentaire 2.
  4. Acquérir des données protéomiques de fusil de chasse à l’aide d’un spectromètre de masse (voir tableau des matériaux) en utilisant les paramètres fournis dans le fichier supplémentaire 3.
  5. Effectuez une recherche dans la base de données des protéines pour l’identification des protéines.
    1. Téléchargez et installez le logiciel requis, MaxQuant.
      REMARQUE: Le logiciel MaxQuant (v.1.6.10.43) a été utilisé ici pour les étapes suivantes (voir tableau des matériaux).
    2. Téléchargez la base de données sur le protéome humain à partir d’une base de données de séquences protéiques de haute qualité (UniProt/SwissProt) (voir tableau des matériaux). Cliquez sur le bouton Télécharger et choisissez FASTA (canonique).
      REMARQUE: En option, téléchargez FASTA (non canonique) pour inclure les isoformes protéiques de chaque gène dans la base de données, si vous le souhaitez.
    3. Dans l’interface du logiciel MaxQuant, spécifiez le fichier FASTA à utiliser comme base de données de protéines en accédant au panneau Paramètres globaux et cliquez sur l’onglet Séquences ; Ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter pour spécifier le chemin d’accès au fichier FASTA.
    4. Dans l’interface du logiciel MaxQuant, spécifiez les fichiers de spectre de masse bruts acquis à analyser en accédant au panneau Données brutes et en cliquant sur le bouton Charger et en sélectionnant le(s) fichier(s) brut(s).
    5. Configurez les paramètres de recherche comme indiqué dans le tableau 1. Activez la quantification sans étiquette (LFQ) si nécessaire.
    6. Attendez la fin de la recherche et recherchez le nombre de correspondances du spectre peptidique (MSP) qui dépassent les seuils FDR de 1 % dans le fichier msms.txt dans le dossier /combined/txt.
      REMARQUE : Dans les comparaisons effectuées ici pour la section des résultats représentatifs, les MSP mappés à plusieurs protéines ont été filtrés, et les MSP mappés à une protéine unique ont été retenus pour compter le nombre de MSP, de peptides et de protéines (Figure 4 et Figure 5).

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Résultats

Trois scripts Python sont fournis ici qui sont compatibles avec le robot OT-2, et qui effectuent la préparation d’échantillons pour la protéomique de spectrométrie de masse avec une seule protéine albumine sérique bovine standard (répliques techniques n = 5 digestions) et un échantillon de lysat cardiaque humain contenant un détergent (n = 5 digestions). Chaque produit de digestion est divisé en deux réactions de nettoyage peptidique. Le nombre de correspondances peptide-spectre (MSP), de peptides et de protéines identif...

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Pour de meilleures performances, des logiciels de laboratoire, des modules et des consommables compatibles avec OT-2 vérifiés par Opentrons doivent être utilisés. Des logiciels de laboratoire personnalisés peuvent être créés en suivant les instructions d’Opentrons à la référence 14. Assurez-vous de calibrer le pont OT-2, les pipettes et le matériel de laboratoire lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois. Il est également essentiel de suivre l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par les prix F32-HL149191 des NIH; R00-HL144829 à EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 à MPL. La figure 1, la figure 2 et la figure 3 sont créées à l’aide d’un outil d’illustration scientifique basé sur le Web, BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
300 et micro ; Pointes de pipette LOpentrons
supports de tubes 4 en 1Opentronsbase et 4 couvercles de porte-tubes de 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml et 50 ml. Nous utilisons des couvercles de 2 ml et 15 ml + 50 ml dans cette étude.
Acclaim PepMap 100 C18 Colonne HPLCThermo Scientific#1645683 &mu ; p m ; 100 et Aring ; pore; 75 &mu ; m x 150 mm
Acetonitrile LC-MS gradeVWR#JT9829
Ensemble de blocsen aluminium OpentronsCet ensemble de blocs comprend 3 couvercles compatibles avec les tubes de 96 puits de 2,0 ml et une bande PCR à utiliser avec le module de température OT-2. Nous utilisons le support de tube de 2,0 ml dans ce manuscrit.
Bicarbonate d’ammoniumSigma-Aldrich# A6141
Étalon d’albumine sérique bovine, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Diméthylsulfoxyde (DMSO) Grade LC-MSThermo Scientific#85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
Colonnes HPLC EASY-SprayThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Ethanol Proof 195-200Fisher#04-355-720
Acide formique LC-MS gradeThermo Scientific#85178
Lysat de cœur humainNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacétamideSigma-Aldrich#I1149
Porte-tubemagnétiqueThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini centrifugeuseThermo Scientific#75004061mini-centrifugeuse de paillasse pour essorage rapide
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V BottomOpentrons
OT-2 module magnétiqueOpentronsGEN1
OT-2 P300 pipette monocanalOpentronsGEN1
OT-2 P50 pipette monocanalOpentronsGEN1
OT-2 robot pipetateurrobot OpentronsOT-2 OT-2
module de températureOpentronsGEN1
Pierce Dosage colorimétrique quantitatif des peptidesThermo Scientific#23275
Tubes Protein LoBind 2.0 mLEppendorf#022431102
Base de données de séquences de protéinesUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640 %
20reviewed :oui
Sera-Mag SpeedBead Particules magnétiques modifiées au carboxylate,Cytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Particules magnétiques modifiées au carboxylate, HydrophileCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificÉvaporateur sous vide
Thermo Q Exactive HF Spectromètre de masseThermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsine MS GradeThermo Scientific#90057
Eau LC-MS gradeVWR#BDH83645.400
Ensemble de Chaque ensemble comprend 2 supports de hydrophobe

Références

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  13. Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
  14. Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
  15. Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
  16. Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
  17. Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
  18. Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).

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