Article de méthode

Isolement, propagation et identification d’espèces bactériennes ayant des propriétés métabolisant les hydrocarbures dans les habitats aquatiques

DOI :

10.3791/63101

⸱

7 décembre 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons le processus d’isolement, de propagation et de caractérisation des bactéries dégradant les hydrocarbures des habitats aquatiques. Le protocole décrit l’isolement bactérien, l’identification par la méthode de l’ARNr 16S et le test de leur potentiel de dégradation des hydrocarbures. Cet article aiderait les chercheurs à caractériser la biodiversité microbienne dans les échantillons environnementaux, et plus particulièrement à dépister les microbes ayant un potentiel de biorestauration.

Résumé

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Les polluants hydrocarbonés sont récalcitrants à la dégradation et leur accumulation dans l’environnement est toxique pour toutes les formes de vie. Les bactéries codent pour de nombreuses enzymes catalytiques et sont naturellement capables de métaboliser les hydrocarbures. Les scientifiques exploitent la biodiversité dans les écosystèmes aquatiques pour isoler les bactéries ayant un potentiel de biodégradation et de biorestauration. Ces isolats de l’environnement fournissent un riche ensemble de voies métaboliques et d’enzymes, qui peuvent être utilisées pour intensifier le processus de dégradation à l’échelle industrielle. Dans cet article, nous décrivons le processus général d’isolement, de propagation et d’identification des espèces bactériennes des habitats aquatiques et examinons leur capacité à utiliser les hydrocarbures comme seule source de carbone in vitro en utilisant des techniques simples. Le présent protocole décrit l’isolement de diverses espèces bactériennes et leur identification ultérieure à l’aide de l’analyse de l’ARNr 16S. Le protocole présente également des étapes pour caractériser le potentiel de dégradation des hydrocarbures des isolats bactériens. Ce protocole sera utile aux chercheurs qui tentent d’isoler des espèces bactériennes des habitats environnementaux pour leurs applications biotechnologiques.

Introduction

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Les hydrocarbures (HC) sont largement utilisés à la fois comme combustibles et dans des applications chimiques. Les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène et le xylène sont largement utilisés comme solvants1. Les alcènes tels que l’éthylène et le propylène servent de précurseurs dans la synthèse des polymères de polyéthylène et de polypropylène, respectivement. Polymérisation d’un autre hydrocarbure, le styrène forme du polystyrène. Les activités anthropiques introduisent des hydrocarbures dans l’environnement au cours de leur production et de leur transport. La contamination des sols et de l’eau par les hydrocarbures est trè....

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Protocole

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1. Collecte, traitement et analyse des échantillons

NOTE: Ici, nous présentons un protocole pour isoler les bactéries des habitats aquatiques. Certains des isolats peuvent être pathogènes, par conséquent, portez des gants et désinfectez la zone de travail avant et après utilisation.

  1. Prélever 500 mL d’échantillon d’eau dans cinq bouteilles de verre stériles provenant de différents sites du plan d’eau. Mesurer le pH et la température de chaque échantillon à l’aide d’un pH-mètre et d’un thermomètre, respectivement.
    REMARQUE : Le protocole n’est pas spécifique au site et peut être facilement adapté pour isoler les ....

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Résultats

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Le schéma décrivant l’ensemble de la procédure d’isolement et de criblage des bactéries des habitats aquatiques et leur identification ultérieure par l’analyse de l’ARNr 16S est représenté à la figure 1. Des échantillons d’eau prélevés dans une zone humide de Dadri, en Inde, ont été prélevés dans des bouteilles en verre stériles et immédiatement emmenés au laboratoire pour traitement. Les échantillons ont été passés à travers des feuilles filtrantes avec une taille de pores .......

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Discussion

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Il est bien établi que seulement environ 1% des bactéries sur Terre peuvent être facilement cultivées en laboratoire6. Même parmi les bactéries cultivables, beaucoup restent non caractérisées. L’amélioration des méthodes moléculaires a donné une nouvelle dimension à l’analyse et à l’évaluation des communautés bactériennes. Cependant, ces techniques ont des limites, mais elles ne rendent pas les analyses de culture redondantes. Les techniques de culture pure pour isoler des espèces bactériennes ind.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Karthik Krishnan et les membres du laboratoire de RP pour leurs commentaires et suggestions utiles. DS est soutenu par la bourse SNU-Doctoral et la bourse Earthwatch Institute India. Le laboratoire RP est soutenu par une subvention CSIR-EMR et des fonds de démarrage de l’Université Shiv Nadar.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseSigma-AldrichA4718Électrophorèse sur gel
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Composant du milieu de croissance
Sulfate d’ammoniumSigma-AldrichA4418Composant du milieu de croissance
Bacto-AgarMillipore1016141000Préparation des milieux solides
Chlorure de calcium (CaCl2)MERCKC4901-500GComposant du milieu de croissance
CatécholSigma-Aldrich135011Essai de dégradation des hydrocarbures Bromure de
cétyltriméthylammonium, CTABSigma-AldrichH6269Isolement de l’ADN génomique
ChloroformeHIMEDIAMB109Isolement de l’ADN génomique
Phosphate disodique (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Composant du milieu de croissance
EDTASigma-AldrichE9884Composant tampon de l’ADNg
Sulfate ferreux, heptahydraté (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Composant du milieu de croissance
Glucose Sigma-AldrichG7021Composant du milieude
GlycérolSigma-AldrichG5516Composante de milieu de croissance ; Stocks de glycérol
IsopropanolHIMEDIAMB063Isolement de l’ADN génomique
LB AgarDifco244520Milieu
de croissance Luria-Bertani (LB)Difco244620Milieu de croissance
Sulfate de magnésium (MgSO4)MERCKM2643Composant
du milieu de croissanceSulfate de manganèse (II) monohydraté (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Composant du milieu de croissance
Bouillon nutritif (NB)Merck (Millipore)03856-500G Milieu decroissance
PeptoneMerck91249-500GComposant du milieu de croissance
PhénolSigma-AldrichP1037Isolement de l’ADN génomique
Phosphate de potassium, dibasique (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Composant du milieu de croissance
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Composant du milieu de croissance
Protéinase KThermoFisher ScientificAM2546Isolement de l’ADN génomique
QIAquick Gel Kit d’extraction QIAGEN160016235DNA purification
QIAquick PCR Kit de purificationQIAGEN163038783Purification de l’ADN
R2A AgarMillipore1004160500Milieu de croissance
Spectrophotomètre SmartSpec Plus 4006221Mesure de l’absorbance
Acétate de sodiumSigma-AldrichS2889Isolement génomique de l’ADN
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS9888Composant du milieu de croissance
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma-AldrichL3771Isolement de l’ADN génomique
StyrèneSigma-AldrichS4972Biodégradation du styrène
Taq ADN polyméraseNEBM0273X16s ARNr PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension de l’ADN
Bouillon de soja tryptique (TSB)Merck22092-500GMilieu
croissance Extraitde levure Sigma-AldrichY1625-1KGComposant du milieu
de croissance Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Composant du milieu de croissance
croissancegénomique de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environme....

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Mots-clés

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