Method Article

Classification de l’état d’activation des cellules souches neurales in vitro à l’aide de l’autofluorescence

DOI:

10.3791/63110

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April 12th, 2024

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1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit des stratégies d’identification et d’enrichissement de l’état cellulaire dans des cultures de cellules souches neurales neurales de souris adultes primaires par imagerie par autofluorescence à l’aide i) d’un microscope confocal, ii) d’un trieur de cellules activées par fluorescence pour effectuer l’imagerie d’intensité, ou iii) d’un microscope multiphotonique pour effectuer l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches neurales (NSC) divisent et produisent des neurones nouveau-nés dans le cerveau adulte par un processus appelé neurogenèse adulte. Les CSN adultes sont principalement quiescents, c’est-à-dire un état cellulaire réversible où ils sont sortis du cycle cellulaire (G0) tout en restant réactifs à l’environnement. Dans la première étape de la neurogenèse adulte, les CSN quiescentes (CSNq) reçoivent un signal et s’activent, sortant de la quiescence et réintégrant le cycle cellulaire. Ainsi, la compréhension des régulateurs de la quiescence et de la sortie de la quiescence des NSC est essentielle pour les stratégies futures ciblant la neurogenèse adulte. Cependant, notre compréhension de la quiescence des NSC est limitée par des contraintes techniques dans l’identification des NSC quiescentes (qNSC) et des NSC activées (aNSC). Ce protocole décrit une nouvelle approche pour identifier et enrichir les qNSCs et aNSCs générées dans les cultures in vitro par imagerie de l’autofluorescence des NSC. Tout d’abord, ce protocole décrit comment utiliser un microscope confocal pour identifier les marqueurs autofluorescents des qNSC et des aNSC afin de classer l’état d’activation des NSC à l’aide de l’intensité de l’autofluorescence. Deuxièmement, ce protocole décrit comment utiliser un trieur de cellules activées par fluorescence (FACS) pour classifier l’état d’activation des NSC et enrichir les échantillons pour les qNSC ou les aNSC en utilisant l’intensité de l’autofluorescence. Troisièmement, ce protocole décrit comment utiliser un microscope multiphotonique pour effectuer l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence (FLIM) à la résolution d’une seule cellule, classifier l’état d’activation du NSC et suivre la dynamique de la sortie de quiescence en utilisant à la fois les intensités d’autofluorescence et les durées de vie de la fluorescence. Ainsi, ce protocole fournit une boîte à outils de résolution de cellule unique, sans marquage, pour étudier la quiescence et la sortie de la quiescence des NSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les NSC créent des neurones nouveau-nés tout au long de la vie dans de nombreux organismes dans un processus appelé neurogenèse adulte 1,2. Pour produire des neurones nouveau-nés, un qNSC doit d’abord s’activer, entrant dans le cycle cellulaire pour élargir la population et produire des progéniteurs neuronaux 3,4,5,6. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la quiescence des NSC, notre capacité à identifier pleinement les moteurs et les régulateurs de la quiescence des NSC est limitée par les limites techniques qui existent pour isoler et identifier les qNSC et leur transition vers l’activation. L’imagerie par autofluorescence a déjà permis d’étudier les changements d’état cellulaire dans de nombreux types de cellules différents, tels que la microglie et les lymphocytes T, en résolvant le remodelage métabolique, qui influence les propriétés optiques des cofacteurs métaboliques autofluorescents tels que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H) et la flavine adénine dinucléotide (FAD)7,8. Les NSC remodèlent considérablement leurs réseaux métaboliques lorsqu’ils subissent la sortie de quiescence9, 10, 11, 12, 13, 14. Ainsi, pour tirer parti de ces différences, l’autofluorescence des NSC a récemment été utilisée pour identifier et enrichir l’état d’activation des NSC en détectant les changements d’autofluorescence attribués au remodelage métabolique qui se produit lorsque les NSCs sortent de la quiescence15. L’imagerie par autofluorescence offre plusieurs avantages techniques : i) elle ne nécessite pas l’ajout de marqueurs exogènes, ce qui peut impacter le comportement cellulaire ; ii) il peut fournir des données à haute résolution sur l’état d’activation du NSC ; et iii) il ne nécessite pas la destruction de la cellule 7,16. Ce protocole décrit trois stratégies pour exploiter l’autofluorescence des NSC afin d’étudier les états cellulaires quiescents et activés des NSC15.

Récemment, des NSC isolées de souris mâles âgées de 6 semaines dans la zone subgranulaire de l’hippocampe, cultivées et mises en repos de manière réversible in vitro 10,13,17,18,19,20,21, ont montré des niveaux accrus d’autofluorescence ponctuée (PAF) qui excitent entre 400 et 600 nm et émettent entre 500 et 700 nm. Ce signal était spécifique aux qNSC par rapport aux NSC activées et cycliques15. La capacité de séparer visuellement ces deux populations sans utiliser de marqueurs ou de rapporteurs d’anticorps supplémentaires est utile pour de nombreuses questions expérimentales sur la nature des qNSCs et des sorties de quiescence. Ainsi, tout d’abord, ce protocole décrit des stratégies pour imager le PAF dans les qNSC à l’aide d’un microscope confocal, qui peut être utilisé pour identifier l’état d’activation des NSC. Deuxièmement, ce protocole décrit des stratégies pour détecter le PAF à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et décrit plus en détail comment trier en fonction de ce signal pour enrichir les qNSCs ou aNSC. Ces stratégies fournissent une mesure qui peut être utilisée pour regrouper et séparer les CSN en fonction de l’état de la cellule.

Afin de mettre au point une méthode à plus haute résolution pour séparer les CSN non seulement dans des états distincts, mais aussi lorsqu’elles passent de la sortie de quiescence à l’activation complète, l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence (FLIM) a été réalisée à l’aide d’un microscope multiphotonique pour imager l’autofluorescence NAD(P)H (appelée canal 1) et l’autofluorescence verte (appelée canal 2 ; qui détecte à la fois l’autofluorescence FAD et le PAF dans les qNSC) ainsi que leur intensité. Cette approche capitalise sur le fait que les propriétés optiques des molécules dans la cellule dépendent de leurs propriétés physiques16,22. Par exemple, le NAD(P) (le NAD et le NADP sont optiquement indiscernables, et donc le NAD(P) est utilisé pour désigner les deux espèces) n’est pas autofluorescent à l’état oxydé, mais est autofluorescent à l’état réduit (NAD(P)H)23. De plus, des propriétés physiques supplémentaires des molécules autofluorescentes, telles que leur état de liaison aux enzymes, peuvent être extrapolées en effectuant une imagerie de la durée de vie de la fluorescence 7,22,24. Par exemple, le NAD(P)H a une durée de vie de fluorescence plus courte lorsqu’il n’est pas lié à une enzyme22. Comme les molécules autofluorescentes telles que le NAD(P)H, qui est impliqué dans des centaines de réactions métaboliques, sont utilisées différemment par les cellules progressant à travers différents états ou comportements cellulaires, ces changements peuvent être détectés et quantifiés à l’aide d’un microscope multiphotonique détectant la durée de vie de l’autofluorescence23. Avec l’abondance ou l’intensité de l’autofluorescence, ces mesures fournissent des informations multidimensionnelles pour séparer les NSC dans un état cellulaire ou l’autre et à travers les transitions dynamiques entre les états. Troisièmement, ce protocole décrit la réalisation, l’analyse et l’interprétation des mesures FLIM et d’intensité des signaux du canal 1 (NAD(P)H) et du canal 2 (PAF) à l’aide d’un microscope multiphotonique. En résumé, ce protocole décrit une boîte à outils sans marquage pour l’étude de la quiescence des NSC qui fournit des données unicellulaires à haute résolution sur l’état des NSC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de ce protocole sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Wisconsin-Madison.

1. Utilisation d’un microscope confocal pour imager PAF dans les qNSC et les aNSC afin d’identifier l’état des cellules NSC

  1. Générez des qNSCs et des aNSCs in vitro à partir de cultures primaires de NSC.
    1. Cellules souches neurones de culture purifiées à partir de cerveaux de souris adultes dans un milieu prolifératif à des fins d’expansion (Tableau 1)18,20,21. Ainsi, par défaut, les cultures de NSC in vitro sont des aNSC.
    2. Pour générer des qNSC, utilisez le protocole suivant pour plaquer des aNSC sur de la verrerie à couche, puis traitez-les avec un milieu qNSC pour induire une quiescence pendant 3 jours.
    3. Préparez de la verrerie avec un indice de réfraction adapté aux objectifs d’immersion dans l’huile pour les NSC adhérents en les enduivant d’abord d’une solution de poly-L-ornithine (PLO ; 10 mg/mL dans l’eau pour le plastique, 50 mg/mL dans l’eau pour le verre) suffisante pour couvrir le fond du plat (pour un puits de cuvette d’imagerie de 1 cm2 , utilisez ~150 μL) pendant 1 h à 37 °C dans ddH2O.
    4. Retirez la solution PLO et lavez-la 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    5. Enduire d’une solution de laminine (5 mg/mL) suffisante pour couvrir le fond de la boîte (pour une cuvette d’imagerie de 1 cm2 , utiliser ~150 μL) dans du PBS et incuber au moins 3 h à 37 °C, ou toute la nuit.
    6. Retirez la solution de laminine, puis ajoutez un milieu de culture suffisant pour couvrir le fond de la boîte (pour une cuvette d’imagerie de 1 cm2 , utilisez ~150 μL).
    7. Préparez les cellules pour la trypsinisation en centrifugeant des aNSC (elles peuvent commencer sous forme de monocouches ou de neurosphères) à 120 x g pendant 4 min à température ambiante (RT, ~25 °C).
    8. Trypsiniser les cellules souches embryonniques en granulés de l’étape précédente dans 100 μL de mélange de trypsine pendant 5 min à 37 °C, puis tremper la trypsinisation avec 200 μL de mélange d’inhibiteurs de la trypsine (tableau 1).
    9. Laissez les NSC reposer pendant 2 min, puis triturez-les mécaniquement en les pipetant de haut en bas 10 fois.
    10. Ajouter 5 mL de milieu aNSC et faire tourner les cellules à 120 x g pendant 4 min.
    11. Remettre les CSN en suspension dans 1 mL de milieu aNSC et plaquer les cellules à une confluence de 10 % à 20 % dans un milieu aNSC. Par exemple, plaquez ~5 000 cellules dans un puits d’une cuvette d’imagerie de 1 cm2 avec un milieu de 150 μL.
    12. Après avoir laissé 24 h pour que les aNSC adhèrent à la surface de la boîte, retirez le milieu aNSC et remplacez-le par un milieu qNSC suffisant pour couvrir le fond de la boîte (pour une cuvette d’imagerie de 1 cm2, utilisez ~150 μL ; Tableau 1 - comme décrit précédemment 10,13,17,18) dans les puits où la quiescence sera induite.
    13. Changez de support aNSC et qNSC au moins une fois tous les 2 jours. Après 3 jours en milieu qNSC, les NSC sont au repos et peuvent être utilisés pour des expériences d’imagerie.
  2. Utilisez un microscope confocal pour imager en direct les qNSC et les aNSCs in vitro.
    REMARQUE : Chaque microscope a son logiciel propriétaire ; Suivez donc ces étapes en effectuant des actions analogues pour configurer un microscope spécifique. Ce protocole fournira des instructions pour travailler dans NIS-Elements.
    1. Configurez le microscope confocal pour l’imagerie par autofluorescence.
      1. Cliquez sur Laser 405 et tapez du texte dans la fenêtre d’émission du menu Laser 405 . Cliquez sur TD pour collecter une image en lumière transmise et définir la valeur HV pour visualiser l’échantillon.
      2. Réglez la puissance du laser sur 3,5 % et le gain sur 75. Réglez Zoom sur 2. Configurez les paramètres de balayage confocal, définissez Pixel Dwell sur 0,5 et Résolution sur 2048 x 2048 pixels.
    2. Faites la mise au point sur les cellules sous un objectif à immersion dans l’huile ~60x en utilisant le fond clair pour faire la mise au point.
    3. Passez en mode de balayage confocal en cliquant sur Port oculaire, en vous assurant que le chemin de la lumière est maintenant dirigé vers la tête de balayage et qu’aucun cube de filtre ne se trouve dans le chemin de la lumière.
    4. Le PAF est enrichi en qNSCs et est largement excitable et émettable (voir Figure 1). Choisissez la meilleure configuration optique en fonction des capacités du système à l’aide de la Figure 1 comme guide. Pour le signal le plus fort et le plus propre, excitez avec un laser entre ~400-500 nm, collectez ~580-620 nm et utilisez un objectif d’immersion dans l’huile ~60x.
      REMARQUE : L’imagerie par autofluorescence nécessite des puissances laser plus élevées que celles des expériences d’imagerie typiques. Si vous imagez d’autres molécules autofluorescentes ou d’autres marqueurs avec PAF, concevez soigneusement la configuration optique pour éviter les fuites dans les canaux d’autofluorescence.
    5. Acquérir des images d’autofluorescence dans les qNSC et les aNSC. Cliquez sur Numériser, puis sur l’image, puis sur Capturer. Pour obtenir les meilleures images, collectez des images à plan unique avec le cytoplasme des cellules (basé sur l’autofluorescence plus faible diffusée dans toute la cellule) au point pour obtenir une coupe efficace représentative de chaque cellule.
    6. Utilisez une configuration optique identique (par exemple, la même puissance laser) et des échantillons d’images le même jour si vous souhaitez comparer directement différentes images.
    7. Les puissances exactes du laser et du détecteur dépendront de chaque système spécifique. Commencez par utiliser de faibles puissances laser, puis augmentez lentement les puissances jusqu’à ce que le signal soit détectable sans être saturé.
  3. Analysez le PAF dans les qNSCs en direct et les aNSCs in vitro.
    1. Après avoir acquis des images d’autofluorescence dans des qNSC ou des aNSC, quantifiez les images en ouvrant un fichier dans ImageJ25.
    2. Utilisez l’option Traiter > filtres > flou gaussien (Sigma : 2) sur l’image de l’autofluorescence qNSC/aNSC pour lisser les pixels inégaux.
    3. Utilisez Image > Ajuster > seuil pour sélectionner les pixels représentant PAF (éliminer les pixels d’arrière-plan) et cliquez sur Appliquer. Utilisez les mêmes paramètres de seuillage pour toutes les images qui seront directement comparées.
    4. Utilisez Process > Binary > Watershed pour séparer les PAF à proximité spatiale.
    5. À l’aide de la souris de l’ordinateur, dessinez une région d’intérêt (ROI) autour d’une cellule, déterminée soit en regardant une image en fond clair, soit en regardant l’autofluorescence diffuse présente uniformément dans tout le cytoplasme de la cellule.
      REMARQUE : Il est généralement acceptable d’exclure les processus périphériques minces et d’inclure le noyau, car l’autofluorescence n’est généralement pas présente à ces endroits et ne perturberait donc pas l’analyse.
    6. Utilisez Analyser > Analyser les particules (taille : 0,1-infini μm ; Circularité : 0-1) avec résumé vérifié.
      REMARQUE : ImageJ produira ensuite une fenêtre de sortie avec des données sur les particules dans la région d’intérêt, ce qui permet de tabuler le nombre de PAF dans chaque cellule. D’autres molécules fluorescentes peuvent être associées à l’imagerie PAF. Cependant, comme le PAF est un signal relativement faible, il est important de vérifier que les autres fluorophores ne saignent pas dans le canal PAF. En règle générale, les fluorophores absorbant 600+ nm et émettant 650+ nm peuvent être associés à des PAF d’imagerie, tels que LipidSpot 610.

2. Utilisation de FACS pour enrichir l’état d’activation des NSC dans des NSC cultivées basées sur l’autofluorescence

  1. Générez des qNSC et des aNSC comme décrit dans la section 1.
  2. Triez un mélange de qNSC et d’aNSC en direct en fonction de l’autofluorescence.
    REMARQUE : À titre d’exemple, ce protocole explique comment enrichir les aNSC ou les qNSC dans un échantillon généré en mélangeant des qNSC et des aNSC selon un rapport de 1:1.
    1. Avant la trypsinisation et le tri cellulaire, étiquetez les cellules qui progressent dans la phase S en ajoutant 10 μM 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU ; un analogue de la thymidine qui s’incorpore dans les cellules synthétisant l’ADN, comme dans la phase S du cycle cellulaire) au milieu de culture cellulaire pendant 1 h.
    2. Trypsiniser les qNSC et les aNSC comme indiqué aux étapes 1.1.8, les remettre en suspension dans 0,5 mL de tampon FACS (tableau 1), puis les placer sur de la glace.
      REMARQUE : les qNSC adhèrent fortement à la parabole. À une confluence relativement plus élevée, les qNSC peuvent être dissociées mécaniquement de la parabole. Cependant, si les qNSC se trouvent à une confluence relativement plus faible ou s’ils sont difficiles à éliminer mécaniquement de la boîte par pipetage, utilisez de la trypsine pour les retirer de la boîte.
      1. Retirer le milieu de culture des qNSC et ajouter 0,25 % de trypsine suffisante pour couvrir le fond de la boîte (pour une cuvette d’imagerie de 1 cm2 , utiliser ~150 μL), en incubant pendant 3 min à 37 °C.
      2. Après l’incubation, éteignez la réaction de trypsine en ajoutant un milieu correspondant à chaque type de cellule égal au volume de trypsine ajouté. Dissocier mécaniquement les cellules de la boîte avant la collecte et la centrifugation.
    3. À l’aide d’une buse de ~130 μm, analysez les qNSC et les aNSC à l’aide d’un cytomètre en flux ou d’un FACS avec des conditions optiques basées sur les capacités de l’instrument et détectez le PAF comme illustré à la figure 1. Par exemple, utilisez un laser de 405 nm pour exciter l’échantillon et utilisez un filtre de 580-620 nm pour la détection.
    4. Collectez au moins 10 000 qNSC et aNSC singulet dans un fichier de données, puis utilisez-les pour concevoir des portes afin de collecter un enrichissement de qNSC ou d’aNSC. Par exemple, définissez des vannes pour collecter les 25 % supérieurs ou les 25 % inférieurs des NSC en fonction de l’intensité de l’autofluorescence dans l’échantillon mixte aNSC :qNSC (1:1).
    5. Après avoir réglé des portes pour trier les singlets avec une autofluorescence plus brillante ou plus faible comme décrit ci-dessus, triez les cellules dans des puits recouverts de laminine PLO remplis d’un milieu aNSC (10 000 cellules/cm2, voir étape 1.1.3).
    6. Après le FACS, laissez les NSC reposer pendant 3 h dans l’incubateur. Fixez les cellules en les traitant avec du paraformaldéhyde à 4% suffisant pour couvrir le fond de la boîte (pour une cuvette d’imagerie de 1 cm2 , utilisez ~150 μL) pendant 15 min à RT.
      REMARQUE : Pour visualiser l’EdU dans les cellules, il est plus facile d’obtenir un kit commercial de détection de l’EdU et de suivre le protocole recommandé par le fabricant.
    7. Tout d’abord, perméabiliser les cellules par un traitement avec 0,25% de triton dans du PBS pendant 15 min à RT.
    8. Ensuite, traitez les cellules avec une solution de coloration EdU à RT pendant 30 min.
      REMARQUE : La composition précise de la solution de coloration EdU varie en fonction de la source des réactifs, mais se compose grossièrement d’un tampon réactionnel, d’un additif tampon réactionnel, d’un sulfate de cuivre et d’une molécule modifiée par un alcyne ou un azide. Voir la table des matériaux pour un kit recommandé.
    9. Après la coloration pour visualiser EdU, laver les échantillons 3 fois pendant 10 min avec du PBS.

3. Utilisation d’un microscope multiphotonique pour détecter l’autofluorescence des canaux 1 et 2 et effectuer des tests FLIM sur les CSN in vitro afin d’identifier les populations et les transitions d’état cellulaire des CSN

REMARQUE : Chaque microscope a son logiciel propriétaire ; Suivez donc ces étapes en effectuant des actions analogues pour configurer un microscope spécifique. Ce protocole fournira des instructions pour travailler à Prairie View.

  1. Générez des qNSC et des aNSC comme décrit dans la section 1.
  2. Configurez le microscope multiphotonique pour l’imagerie à durée de vie de fluorescence.
    1. Utilisez un objectif avec un grossissement de 40x ou plus (~1,15 NA).
    2. Utilisez un microscope multiphotonique doté des composants suivants, ou équivalents : un laser ultrarapide accordable, un dichroïque passe-long de 720 nm, un tube photomultiplicateur (PMT) au phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP), une électronique de comptage de photons uniques corrélée dans le temps et un wattmètre analogique.
    3. Pour l’imagerie du canal 1, réglez le laser accordable sur 750 nm et utilisez un cube de filtre d’émission de 440/80 nm. Pour l’imagerie du canal 2, réglez le laser sur 890 nm et utilisez un cube de filtre d’émission de 550/100 nm.
      REMARQUE : Éteignez les lumières de la pièce avant que les PMT ne soient allumés.
  3. Fonction de réponse de l’instrument
    1. Capturez une fonction de réponse de l’instrument (IRF) en imageant un cristal d’urée broyé pour tenir compte de la réponse temporelle de l’instrument lors de la désintégration mesurée.
      REMARQUE : L’IRF est convolué avec la décroissance pour calculer avec précision la courbe d’ajustement de décroissance. Pour l’acquisition, le laser est réglé sur 890 nm et le cube de filtre d’émission 440/80 nm est utilisé. Le PMT GaAsP est réglé à un gain de 800, et les pockels (puissance laser) sont réglés très bas au départ, généralement 1.
    2. Sélectionnez un champ de vision avec de l’urée cristalline et augmentez légèrement les pockels (jusqu’à un maximum de 15).
    3. Ensuite, acquérez une image en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l’imagerie cellulaire : discriminateur de fraction constante (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, résolution de 256 x 256, temps de séjour défini à 4,8 μs, zoom optique réglé à 1,5x et temps d’intégration de 60 s.
  4. Effectuez une imagerie de la durée de vie de la fluorescence et une imagerie d’intensité pour l’autofluorescence des canaux 1 et 2 sur des qNSC et des aNSC en direct in vitro
    1. Trouver un champ de vision pour imager : utilisez les oculaires pour trouver un champ de vision approprié et modifiez le chemin de la lumière vers l’échantillon sur le microscope pour permettre l’imagerie.
      REMARQUE : Une image du canal 1 sera acquise en premier, suivie d’une image du canal 2 du même champ de vision.
    2. Configuration pour la collecte de l’image du canal 1 : Cliquez sur l’onglet Puissance/Gain et réglez le gain sur le PMT sur 800, cliquez sur l’onglet Laser 2-P et sélectionnez 750 nm pour le laser, et assurez-vous que le cube de filtre approprié est utilisé (440/80 nm).
    3. Collectez l’image du canal 1.
      1. Démarrez le mode Aperçu en allant dans l’onglet Puissance/Gain et en réglant les Pockels sur 30, puis en allant dans la section Balayage de cet écran et en cliquant sur Balayage en direct.
      2. Augmentez les Pockels pour trouver un bon champ de vision à faible puissance laser (inférieure à 3,6 mW). Une fois le champ de vision trouvé, ajustez les Pockels de sorte que le wattmètre indique ~3,6 mW sur la puissance après la cellule Pockel, et que le discriminateur de fraction constante (CFD) dans l’onglet Taux de comptage mesure 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Allez dans la section Analyse et cliquez sur Analyse unique une fois que ces paramètres sont remplis. Cela permettra d’acquérir une image du canal 1 sur 60 s.
    5. Pour collecter une image du canal 2, cliquez sur l’onglet Laser 2-P et sélectionnez 890 nm pour le laser, remplacez le cube de filtre par le cube d’émission du canal 2 (550/100 nm).
    6. Démarrez le mode de prévisualisation comme décrit dans la section 3.4.3, augmentez les Pockels jusqu’à ce que le capteur de puissance indique ~7 mW, et les comptes CFD sont à nouveau de 1 x 104 -1 x 105.
    7. Allez dans la section Balayage et cliquez sur Balayage unique une fois que ces paramètres sont remplis. Cela permettra d’acquérir une image du canal 2 sur 60 s.
    8. Acquisition d’autres images : après avoir acquis une image du canal 1 et du canal 2, trouvez un nouveau champ de vision et répétez les étapes 3.4.2 à 3.4.4. En règle générale, la collecte de 4 à 6 champs de vision pour imager ~50 à 100 cellules est suffisante pour une condition dans une expérience.
      REMARQUE : mCherry peut être utilisé comme étiquette fluorescente supplémentaire sans fuite dans les canaux 1 et 2.
  5. Analysez les images de durée de vie fluorescente.
    1. Générez des matrices de désintégration pour les images de durée de vie de la fluorescence dans SPCImage en suivant les étapes 3.5.2 à 3.1.14.
      REMARQUE : Pour plus d’informations, consultez les manuels mis à jour disponibles gratuitement en ligne26.
    2. Ouvrez SPCImage et ouvrez l’image FLIM IRF collectée dans la section 3.3.
    3. Ajustez les barres noires verticales de l’histogramme pour qu’elles se limitent à la courbe de décroissance de l’IRF. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur IRF > Copier dans le presse-papiers.
    4. Ouvrez un fichier image FLIM dans l’ensemble de données à analyser, obtenu à la section 3.4.
    5. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur IRF > Coller à partir du presse-papiers.
    6. En bas à droite du logiciel, définissez Composants sur 2.
    7. Dans la barre de menu supérieure du logiciel, cliquez sur Options > Modèle. Sélectionnez ensuite MLE pour Méthode d’ajustement, Binning spatial au carré, Seuil à crête, et sous Paramètres, sélectionnez Décroissance multiexponentielle.
    8. En bas à gauche du logiciel, augmentez Bin jusqu’à ce que le nombre de photons soit d’au moins 100 en pixels cytoplasmiques représentatifs au pic du nombre de photons immédiatement après l’excitation.
    9. En bas à gauche du logiciel, définissez le seuil. Pour le canal 1, utilisez un seuil de « 50 ». Pour le canal 2, utilisez le seuil « 0 ».
    10. Dans la barre de menu supérieure du logiciel (ce protocole décrit comment utiliser la version 8.3), cliquez sur Calculer > matrice de désintégration.
      REMARQUE : Assurez-vous que les valeurs de Chi2 sont ~0,8-1,2 dans toute l’image. Cela confirme que les données seront robustes en validant la modélisation de la décroissance biexponentielle.
    11. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur Fichier > Enregistrer.
    12. Dans la barre de menu supérieure du logiciel, cliquez sur Fichier > Exporter, puis exportez ce qui suit :
      Valeur codée par couleur, T1, T2, Chi2, Intensités de pixels, A1[%], A2[%] et image codée par couleur (avec légende)
      REMARQUE : SPCImage est maintenant configuré pour effectuer un traitement par lots, en analysant toutes les images d’un canal donné (analysez les images FLIM du canal 1 ensemble, puis répétez l’opération à partir de l’étape 3.5.2 pour les images FLIM du canal 2).
    13. Pour effectuer un traitement par lots, cliquez sur Calculer > traitement par lots et sélectionnez les images FLIM à traiter.
    14. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur Fichier > Exporter > Exportation par lots et sélectionnez les matrices de décomposition à exporter (générées à l’étape précédente).
    15. Utilisez CellProfiler pour créer des masques cytoplasmiques en suivant les étapes 3.5.16 à 3.5.24.
      REMARQUE : Pour ce faire, les noyaux seront manuellement autour des images d’intensité du canal 1, où le noyau est noir et clairement visible. Ensuite, un pipeline CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (Fichier supplémentaire 1) produira automatiquement un masque cellulaire et cytoplasmique entier, selon les instructions du masque nucléaire. Les noyaux peuvent également être marqués avec mCherry et imagés en même temps que l’autofluorescence du canal 1 et du canal 2 pour fournir la capacité d’automatiser l’identification des noyaux. Cependant, de nombreux colorants nucléaires conventionnels saignent spectralement dans les canaux d’autofluorescence et sont donc incompatibles avec cette technique.
    16. Dans R Studio, utilisez R_ASCtoTIFF.rmd27 (Fichier supplémentaire 2) pour convertir les fichiers X_photons.asc , où X est le nom de l’image acquise à partir de l’image du canal 1 définie sur les fichiers TIF.
    17. Ouvrez Cell Profiler et ouvrez manual_segmentation.cpproj.
    18. Chargez dans le canal 1 les TIF de photons créés à l’étape 3.5.16 à l’étape Images en haut du pipeline.
    19. Dans les 3 étapes inférieures du pipeline intitulées SaveImages, définissez un chemin d’enregistrement pour les masques que CellProfiler générera.
    20. Cliquez sur Démarrer le mode de test en bas à gauche de CellProfiler.
    21. Cliquez sur Exécuter en bas à gauche de CellProfiler. Lorsque CellProfiler atteint l’étape IdentifyObjectsManually (IdentifyObjectsManually ), une fenêtre s’affiche et affiche l’image du canal 1 en cours de traitement.
    22. Cliquez sur la touche F du clavier, puis tracez manuellement une trace des noyaux d’une cellule tout en maintenant le bouton de clic gauche de la souris enfoncé. Après avoir tracé les noyaux, relâchez le bouton de clic gauche de la souris. Répétez cette étape pour toutes les cellules de l’image.
    23. Cliquez sur Terminé en bas à droite de la fenêtre contextuelle avec l’image d’intensité. Le logiciel va maintenant terminer le pipeline et exporter des masques cytoplasmiques, nucléaires et cellulaires totaux.
    24. En bas à gauche, cliquez sur Visionneuse d’images suivante et répétez les étapes 3.5.21 à 3.5.23 pour toutes les images TIF du canal 1.
    25. Utilisez le script R (Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd) pour intégrer les matrices de désintégration générées aux étapes 3.5.2 à 3.5.14 et les masques cytoplasmiques générés aux étapes 3.5.15 à 3.5.24 afin d’obtenir les variables d’imagerie de la durée de vie moyenne de la fluorescence pour le cytoplasme de chaque cellule en suivant les étapes 3.5.26 à 3.5.30
    26. À l’aide d’une feuille de calcul (p. ex., Microsoft Excel), créez un document .csv intitulé test_key27 [Fichier supplémentaire 3] par exemple) avec 3 colonnes.
    27. Intitulez les colonnes Dossier, NADH et FAD. Remplissez le tableau pour répertorier l’emplacement du dossier dans le dossier, puis le préfixe du titre de l’image dans NADH et FAD, respectivement, pour lier chaque image du canal 1 à chaque image du canal 2 (voir l’exemple de données - Tableau 2).
  6. Dans R Studio, ouvrez l’option Intégrer les matrices de désintégration et les masques cytoplasmiques.rmd27(Fichier supplémentaire 4).
    1. Définissez les chemins d’accès aux fichiers suivants, tels qu’ils sont annotés dans le script : Définissez le répertoire de travail, l’emplacement du fichier du canal 1, l’emplacement du fichier FAD, l’emplacement du fichier de masque et l’emplacement et le nom du fichier de sortie.
    2. Exécutez l’intégralité du script. Une fois le script terminé, un fichier de sortie sera généré, y compris les métadonnées et les variables FLIM moyennes.
    3. Effectuez l’analyse à l’aide de l’autofluorescence FLIM data.rmd27 (Fichier supplémentaire 5) ou à l’aide de tout autre logiciel d’analyse.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagerie confocale par autofluorescence pour séparer l’état des cellules NSC (Figure 1)
Pour utiliser la microscopie confocale pour résoudre l’état d’activation des CSN, les CSNq et les CSNa ont été générées in vitro à l’aide d’un milieu d’activation ou d’un milieu de quiescence, comme décrit précédemment 10,13,17,18. Pour détecter la PAF dans les CSN, des qNSC et des aNSC en direct ont été imagés en utilisant la même exposition sur un microscope confocal (Ex : 405 nm, Em : 580-620 nm). Les qNSC présentaient un nombre plus élevé de PAF que les aNSC (Figure 1A,B). Cette découverte illustre comment les propriétés de l’autofluorescence peuvent être utilisées comme marqueurs pour identifier l’état cellulaire des qNSC et des aNSC.

Enrichissement FACS de l’état cellulaire NSC par autofluorescence (Figure 2)
Pour enrichir l’état du cycle cellulaire à l’aide de FACS, des qNSCs et des aNSC ont été générés in vitro 10,13,17,18,19 comme décrit dans ce protocole et pré-marqués avec EdU pendant 1 h avant la trypsinisation et l’analyse dans le cytomètre en flux pour marquer les cellules progressant à travers la phase S. Les qNSC et les aNSC ont ensuite été analysés par cytométrie en flux, séparément ou en mélange, selon un rapport de 1 qNSC :1 aNSC (Figure 2


figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une technique de résolution unicellulaire, sans marquage, non destructive, qui permet de classer in vitro l’état des cellules NSC par imagerie de signaux autofluorescents dans les NSC. Cette approche détecte les changements métaboliques qui se produisent lors de la sortie de la quiescence des NSC, qui influencent les propriétés optiques des cofacteurs métaboliques, tels que le NAD(P)H, et offre de nombreux avantages par rapport aux technologies existantes pour étudier la quiescence des NSC. Par exemple, de nombreuses techniques conventionnelles d’étude des qNSCs et des aNSC, telles que le marquage avec des marqueurs de cycle cellulaire comme EdU, nécessitent la fixation d’échantillons. Les méthodes existantes qui sont capables d’étudier les CSN vivantes sont encore limitées par la nécessité d’introduire des marqueurs exogènes, généralement en générant des transgènes codant pour des protéines fluorescentes. Ces outils sont limités à la fois par les ressources nécessaires à leur génération et par de nombreuses mises en garde techniques. Par exemple, les protéines de filament intermédiaire nestin et la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) sont couramment utilisées comme marqueurs des qNSCs et des aNSCs 12,13,18,28,29. Cependant, on sait que la nestine et la GFAP sont exprimées différemment entre les qNSC et les aNSC 12,13,18,28,29. De plus, l’imagerie par autofluorescence fournit des données unicellulaires à haute résolution, qui peuvent démêler l’hétérogénéité d’une cellule unique perdue ou compliquée à interpréter dans des expériences qui aboutissent à une analyse en masse d’une population de cellules.

Cependant, l’imagerie par autofluorescence présente également plusieurs limites. De nombreux signaux autofluorescents se perdent lors de la fixation des cellules. Ainsi, l’imagerie par autofluorescence se limite largement à l’étude des cellules vivantes. L’imagerie par autofluorescence repose également sur l’absence de fluorophores introduits de manière exogène, qui peuvent saigner dans les canaux autofluorescents. Bien que de nombreux fluorophores puissent être compatibles avec l’imagerie par autofluorescence dans des situations spécifiques, il n’est pas toujours possible d’associer l’imagerie par autofluorescence à de nombreux outils existants. L’imagerie de cellules vivantes peut également induire une phototoxicité. Une itération de l’imagerie utilisant ce protocole n’induit pas une phototoxicité suffisante pour réduire la viabilité des NSC. Cependant, l’imagerie répétée des cellules au cours d’une période plus fréquente à des intervalles plus fréquents plusieurs fois par jour peut générer une phototoxicité significative et, par conséquent, n’est pas une stratégie viable pour étudier la quiescence des NSC. Enfin, bien que l’imagerie par autofluorescence puisse être utilisée pour étudier les CSN de souris mâles âgées de 6 semaines de l’hippocampe ou des ventricules latéraux, il n’est pas clair dans quelle mesure cette technique peut être utilisée pour étudier les CSN d’autres sources, âges ou autres types de cellules souches.

Le protocole décrit ici suppose également une production précise de qNSCs et d’aNSCs in vitro en utilisant les protocoles précédemment établis 10,13,17,18,19. S’il est difficile de reproduire les résultats de ce protocole, assurez-vous que les qNSCs et les aNSCs sont correctement générés en sondant la présence ou l’absence de divers marqueurs de qNSCs et d’aNSC, comme décrit précédemment 10,13,17,18,19. Dans l’ensemble, l’imagerie par autofluorescence fournit une nouvelle approche technique pour identifier les qNSC et les aNSC et étudier les sorties de quiescence des NSC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions la carotte de cytométrie en flux de l’UW-Madison (P30 CA014520 et 1S10RR025483-01), ainsi que les membres du laboratoire Moore et de la communauté de l’UW-Madison pour leur contribution. Nous remercions nos sources de financement : NIH T32 T32GM008688 (à C.S.M.), Diana Jacobs Kalman Fellowship de l’AFAR (à C.S.M.), Wisconsin Graduate Fellowship (à C.S.M.), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, à D.L.M.), Vallee Scholar Award (à D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (à D.L.M et M.C.S.), R01 CA185747 (à M.C.S.), R01 CA205101 (à M.C.S.), R01 CA211082 (à M.C.S.) et la subvention n° de subvention de la National Science Foundation CBET-1642287 (à M.C.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Objectif à eau 40xNikonMRD77410Objectif utilisé dans le microscope multiphotonique dans la partie 3
Cuvette à 8 puitsIbidi80826-90Pour l’imagerie des aNSCs/qNSCs
Wattmètre analogiqueThorlabsPM100AUtilisé dans le microscope multiphoton dans la partie 3
Antibiotique-antimycosique (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062Antibiotique pour les milieux NSC
B-27Invitrogen17504044Complément nutritionnel pour milieu NSC
BMP4Fisher Scientific5020BP010Facteur d’induction de la quiescence
Albumine sérique bovineSigmaA4919-25GPour la fabrication
laser ultrarapide BMP4 ChameleonLaser cohérentN/AUtilisé dans le microscope multiphotonique dans la partie 3
MicroscopeconfocalMicroscope NikonC2utilisé pour la partie 1
DMEM/F-12 (sans GlutaMAX)Invitrogen11320033Milieu de base pour NSCs
DNAseSigmaD5025-15KUinhibiteur de trypsine
InvitrogenC10337Test de prolifération pour culture cellulaire
EGFPeproTechAF-100-15-500UGFacteur de croissance pour milieu NSC
FGFPeproTech100-18BFacteur de croissance pour les milieux NSC
Trieur de cellules activées par fluorescenceBDFACSAriaTrieur de cellules activées par fluorescence utilisé pour la partie 2
HéparineSigmaH3149-50KUAdditif pour les milieux NSC
L-15Invitrogen21083027Pour la préparation de la solution d’inhibiteur de trypsine
LamininSigmaL2020-1MGPour le revêtement de la verrerie
Microscope inversé Nikon TiEN/ACadre de microscope Utilisé pour la partie 3
PLOSigmaP3655-100MGPour le revêtement de la verrerie
SPC-150 Électronique de comptage de photons uniquesBecker et HicklN/AUtilisé dans le microscope multiphotonique dans la partie 3
Trypsine (pour trypsiniser des pastilles d’aNSC qui se développaient sous forme de sphères ou de monocouches)Gibco15090046Pour trypsiniser les neurosphères ou les aNSCs adhérents
Trypsine (pour trypsiniser les qNSC)Gibco25200072Pour trypsiniser les qNSCs adhérents
Inhibiteur de trypsineSigmaT6522-100MGPour inhiber la trypsinisation des aNSCs Cristaux d’urée
SigmaU5128-5GUtilisé pour collecter un IRF
VerseneThermo Fisher15040066Pour la préparation de la trypsine
d’un Ajouté au kit de dosage EdU Nikon

References

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