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Article de méthode

Un modèle d’abrasion épithéliale pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes

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DOI :

10.3791/63112

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29 décembre 2021

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1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de maladies.

Résumé

La cornée est essentielle à la vision, représentant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position externe, la cornée est très sensible à une grande variété de blessures pouvant entraîner une perte de transparence cornéenne et éventuellement la cécité. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de la transparence cornéenne et des capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise des plaies cornéennes, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie. Pour atteindre cet objectif, les modèles murins de plaies cornéennes se sont avérés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes fonctionnant dans des conditions physiologiques normales. Ici, un protocole pour créer une abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Dans ce modèle, une tréphine circulaire de 2 mm de diamètre, centrée sur la cornée, est utilisée pour délimiter la zone de la plaie. Le spud de club de golf est utilisé avec soin pour débrider l’épithélium et créer une plaie circulaire sans endommager la membrane basale épithéliale cornéenne. La réponse inflammatoire qui en résulte se déroule sous la forme d’une cascade bien caractérisée d’événements cellulaires et moléculaires essentiels à une cicatrisation efficace des plaies. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation compromise des plaies cornéennes dans le contexte de la maladie.

Introduction

La cornée est le tiers antérieur transparent de l’œil. La cornée remplit plusieurs fonctions, notamment la protection des structures internes de l’œil et la formation d’une barrière structurelle qui protège l’œil contre les infections1. Plus important encore, la cornée est essentielle à la vision, fournissant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil 2,3. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position vers l’extérieur, la cornée est exposée à une grande variété de blessures au quotidien qui peuvent entraîner une perturbation de sa fonction de barrière, une perte de transparence et éventuellement la cécité. La perte de transparence cornéenne est l’une des principales causes de déficience visuelle dans le monde 4,5. Les abrasions cornéennes sont une raison courante des visites à la salle d’urgence , représentant la moitié des cas oculaires présentés à l’urgence6. On estime que plus de 1 million de personnes souffrent de blessures oculaires chaque année aux États-Unis7. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de sa transparence et de ses capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise de la plaie cornéenne, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices 8,9. En outre, la popularité croissante des chirurgies réfractives place un défi traumatique unique sur la cornée10. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie.

À cette fin, plusieurs modèles animaux de cicatrisation des plaies cornéennes ont été développés 11,12,13,14,15. Les modèles murins de cicatrisation des plaies cornéennes se sont révélés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes opérant dans des conditions physiologiques normales. Différents types de plaies cornéennes ont été utilisés dans l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes, chacune convenant à l’étude de différents aspects du processus de cicatrisation des plaies. Les types de modèles de plaies les plus courants utilisés dans les études sur la cicatrisation des plaies cornéennes sont les modèles de plaies mécaniques et chimiques. Les plaies cornéennes chimiques, impliquant principalement la création de brûlures alcalines sur la cornée, sont utiles pour étudier les ulcères cornéens, l’opacification et la néovascularisation13. Les plaies cornéennes mécaniques impliquent des plaies de débridement (abrasion) et des plaies de kératectomie 14,15,16. Une membrane basale épithéliale cornéenne intacte ou percée définit respectivement le débridement et les plaies de kératectomie. Dans les plaies de débridement, la membrane basale épithéliale reste intacte, tandis que dans les plaies de kératectomie, la membrane basale est percée avec pénétration principalement dans le stroma antérieur. Les plaies de débridement sont les plus utiles pour étudier la réépithélialisation, la prolifération des cellules épithéliales, la réponse immunitaire et la régénération nerveuse après une blessure cornéenne. Les plaies de kératectomie, d’autre part, sont les plus utiles pour étudier les cicatrices cornéennes14,15.

Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de la maladie17.

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Protocole

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Houston et du Baylor College of Medicine. Les lignes directrices décrites dans la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie ont été suivies dans la manipulation et l’utilisation des souris.

1. Préparation

  1. Préparation de la solution de fluorescéine
    1. Préparer une solution de fluorescéine à 1 % en dissolvant 10 mg de sel de fluorescéine de sodium dans 1 mL de solution saline stérile ou de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile 1x.
      REMARQUE: Préparer la solution de fluorescéine de sodium le jour de l’utilisation ou un jour avant pour éviter la contamination microbienne. Lorsqu’elle est préparée un jour avant utilisation, conserver la solution de fluorescéine à 4 °C à l’abri de la lumière. Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment.
    2. Divisez la solution en aliquotes pouvant être utilisées dans une seule expérience. 1-1,5 μL de solution de fluorescéine est utilisé par souris et par point temporel. Utilisez la formule suivante pour calculer le volume d’aliquote approprié pour une seule expérience :
      figure-protocol-1
      REMARQUE: Par exemple, si six souris sont étudiées dans une seule expérience avec la taille de la plaie surveillée à cinq points temporels, le volume d’aliquote approprié pour cette seule expérience serait:
      figure-protocol-2
  2. Préparation d’un cocktail kétamine/xylazine pour l’anesthésie des souris.
    1. Pour préparer 10 mL de cocktail, mélanger 2,0 mL de kétamine (100 mg/mL) avec 1,0 mL de xylazine (20 mg/mL) et ajouter 7,0 mL de PBS stérile. Préparez un cocktail de kétamine/xylazine un jour avant ou le jour de la chirurgie.
      REMARQUE: Toutes les solutions doivent être utilisées à température ambiante, sauf indication contraire.

2. Anesthésie

  1. Peser la souris (souris de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines) pour déterminer la quantité appropriée d’anesthésique à administrer. Utilisez la technique de contention de souris à deux mains pour retenir et manipuler les souris pour l’injection de l’anesthésique18. Administrer le cocktail kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale (i.p.) à une concentration finale de 80 mg/kg de kétamine et de 8 mg/kg de xylazine.
  2. Attendez que l’anesthésie complète soit réalisée avant d’effectuer une blessure cornéenne sur la souris. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant le réflexe de pédale après le pincement des orteils. Lorsqu’une anesthésie adéquate est obtenue, la souris ne doit pas se déplacer sur le pincement des orteils.
    REMARQUE: Parce que les souris perdent rapidement de la chaleur corporelle pendant l’anesthésie, il est important de fournir une source de chaleur aux souris pour prévenir l’hypothermie. Placez les souris sur une source de chaleur (coussin chauffant) pendant les étapes d’anesthésie et de récupération.

3. Création d’une plaie cornéenne

  1. Plaiez uniquement l’œil droit ou gauche. Maintenir la cohérence avec l’œil (c.-à-d. gauche ou droit) qui est blessé lorsque vous passez d’une souris à l’autre.
    REMARQUE: Parce que les abrasions endommagent les nerfs cornéens et réduisent l’acuité, blesser les deux yeux peut causer un inconfort et une déficience importants. Étant donné que les analgésiques ont le potentiel de supprimer les réponses inflammatoires, leur utilisation peut être un facteur de confusion dans certaines expériences visant à comprendre l’inflammation de la cornée. Éviter les analgésiques dans les expériences sur les plaies cornéennes a été approuvé par notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
  2. Pour créer la plaie cornéenne épithéliale
    1. Sous un microscope à dissection, utilisez la tréphine de 2 mm de diamètre (voir la figure 1) pour délimiter le centre de la cornée, en gardant l’œil grand ouvert à l’aide du pouce et de l’index pour tenir les paupières. Faites doucement virevolter la tréphine pour faire une impression sur l’épithélium cornéen.
      REMARQUE: Il faut veiller à ne pas appliquer de pression excessive lors de l’utilisation de la tréphine, car cela peut entraîner une perforation de la cornée. En outre, il faut prendre soin de positionner la tréphine au centre. Les pupilles peuvent être utilisées comme point de repère pour localiser le centre de la cornée.
    2. Sous un microscope à dissection, tenez le spud de club de golf émoussé (voir la figure 1) à environ 45° de la surface de la cornée dans la zone délimitée par la tréphine. Grattez soigneusement et continuellement l’épithélium dans la zone délimitée avec le spud pour débrider l’épithélium.
      REMARQUE: N’appliquez pas de force excessive dans le débridement, car cela peut également provoquer une perforation cornéenne. Les yeux des souris peuvent se dessécher pendant le processus de blessure, ce qui rend le débridement difficile. Dans un tel cas, appliquez du PBS stérile sur la surface oculaire pour maintenir une hydratation optimale.

figure-protocol-3
Figure 1 : tréphine de 2 mm et spud de club de golf émoussé. La tréphine est utilisée pour délimiter une région circulaire au centre de la cornée, et le spud du club de golf est utilisé pour enlever l’épithélium dans la région délimitée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Surveillance de la fermeture de la plaie et de la réépithélialisation

  1. Pipette 1-1,5 μL de solution de fluorescéine à 1% sur la surface blessée et image la cornée à l’aide d’un microscope numérique avec une source de lumière bleue.
  2. Acquérir des images dans la première minute de la solution de fluorescéine ajoutée pour éviter de se propager à l’épithélium environnant conduisant à une surestimation de la taille de la plaie. Les cornées blessées sont photographiées à des moments précis (c.-à-d. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h et 30 h) après la blessure.
    REMARQUE: À tous les moments, l’imagerie est réalisée sous anesthésie; la kétamine/xylazine est utilisée au moment de la blessure tandis que l’isoflurane est utilisé à des moments ultérieurs. Les souris sont logées individuellement dans des cages séparées pendant toute la durée de la surveillance de la fermeture de la plaie. Lorsqu’elles sont logées ensemble, les souris ont tendance à lécher les yeux de leur compagnon de litière, un comportement dont il a été démontré qu’il affectait la cicatrisation des plaies dans différents tissus19,20.
  3. Analysez les images capturées, traçez la zone de la plaie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. La zone de la plaie pour chaque point temporel est exprimée en pourcentage de la zone de la plaie d’origine à 0 h.

5. Imagerie et analyse de l’immunofluorescence

  1. Euthanasier les souris par une méthode approuvée par l’IACUC (dans ce cas, surdosage de dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale) aux moments souhaités après la blessure.
  2. Récoltez les globes oculaires en appuyant doucement sur le canthus latéral pour déplacer le globe oculaire à l’aide de ciseaux incurvés à l’iris. Guidez les ciseaux derrière le globe oculaire pour saisir fermement le nerf optique, puis coupez le nerf, ce qui permet d’enlever le globe oculaire.
  3. Fixez chaque globe oculaire dans 1 mL de 1x PBS contenant 2% de paraformaldéhyde pendant 1 h à température ambiante, puis lavez trois fois dans 1 mL de 1x PBS pendant 5 min chacun.
  4. Sous un microscope à dissection, utilisez une lame chirurgicale pour faire une incision dans la sclérotique, à environ 500 μm distale du limbe, puis coupez à travers le globe. À l’aide d’une pince, retirez doucement la matière de l’iris de la cornée, puis coupez soigneusement le tissu scléral, en vous assurant de laisser les membres intacts.
  5. Faites quatre coupes radiales partielles, chacune d’environ 1 mm de longueur, qui s’étendent de la cornée périphérique et s’arrêtent au centre pour permettre à la cornée de s’aplatir.
  6. Perméabiliser et bloquer les cornées dans 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % et de TritonX-100 à 0,01 % dans 1x PBS pendant 15 min, puis bloquer dans 2 % de BSA dans 1x PBS pendant 45 min supplémentaires à température ambiante.
  7. Incuber les cornées pendant la nuit à 4 °C dans un cocktail d’anticorps conjugués fluorochromes uniques directement marqués préparés dans 1x PBS contenant 2% de BSA.
    REMARQUE: Les anticorps sont ciblés pour marquer des cellules et des tissus spécifiques d’intérêt. Par exemple, l’endothélium, les neutrophiles et les plaquettes sont marqués avec des anticorps anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 et anti-CD4125,26, respectivement. Le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est ajouté au cocktail d’anticorps pour visualiser les noyaux.
  8. Après l’incubation, lavez les cornées trois fois dans 1x PBS pendant 15 minutes chacune.
  9. Montez les cornées sur une lame de microscope dans une goutte de milieu de montage à fluorescence anti-décoloration, couvrez avec un couvercle et image avec le grossissement souhaité (objectif 4x à 100x) à l’aide d’un microscope à fluorescence. Prenez des images pleine épaisseur de la cornée dans différentes régions, comme illustré à la figure 2A.
    REMARQUE : Le modèle d’analyse microscopique illustré à la figure 2A est utilisé pour analyser des changements régionaux spécifiques dans l’inflammation et la division cellulaire. La coloration DAPI et Ly-6G est utilisée pour identifier les neutrophiles extravasculaires. Avec la coloration DAPI, les neutrophiles sphériques ont un noyau distinct en forme de fer à cheval ou de beignet (Figure 2B).

figure-protocol-4
Figure 2: Stratégie d’imagerie cornéenne et infiltration de neutrophiles après abrasion centrale. (A) Représentation schématique d’un ensemble de cornée montrant neuf champs microscopiques sur le diamètre de la cornée. La zone grise représente la zone de plaie d’origine. La largeur de chaque région est de 500 μm. (B) Notez la forme distincte en fer à cheval ou en beignet des noyaux neutrophiles avec coloration DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

La figure 3 montre une micrographie électronique à transmission d’une plaie cornéenne créée avec le spud émoussé du club de golf, démontrant que la membrane basale épithéliale est en effet intacte après une blessure.

figure-results-1
Figure 3 : La membrane basale épithéliale reste intacte après abrasion cornéenne. Mic...

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Discussion

Le but de cet article sur les méthodes était de décrire un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé. Ce modèle murin a été utilisé pour étudier l’inflammation de la cornée et sa contribution à la cicatrisation des plaies. Ce type de modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes dans des conditions physiologiques normales et dans des pathologies 1...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Financement : Soutenu par : NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. et R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) et Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue officiels des National Institutes of Health ou de Sigma Xi.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-CD31BD Bioscience, Pharmingen550274
Anticorps anti-CD41BD Bioscience, Pharmingen553847
Anticorps anti-Ly6GBD Bioscience, Pharmingen551459
Albumine sérique bovine (BSA)ThermoFisher scientificB14
C57BL/6 sourisJackson Laboratories664
DAPISigma AldrichD8417
DeltaVision Microscope à fluorescence à déconvolution grand champGE Life Sciences
Microscope de dissectionMicrosystèmes
Leica Balances électroniques à chargement par le haut (balance)Fisher Scientific
EthanolThermoFisherscientific T038181000CS
Patate de golfInstruments StephensS2-1135
Ciseaux à courbe d’irisFisher Scientific31212
IsofluranePatterson vétérinaire07-893-1389
KétaminePatterson vétérinaire07-890-8598
Solution saline tamponnée au phospate (PBS)ThermoFisher scientificAM9624
Sel de fluorescéine de sodiumSigma Aldrich46970
Lame chirurgicale (lame scapel)Outils pour les sciences fines10022-00
TrephineIntegra Miltex33-31
TritonX -100Fisher Scientific50-295-34
PinceOutils pour les sciences fines11923-13
XylazinePatterson vétérinaireTél. : 07-808-1947

Références

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