Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Résumé

Les bactéries sécrètent des vésicules extracellulaires (VE) de taille nanométrique transportant des molécules biologiques bioactives. La recherche sur les véhicules électriques se concentre sur la compréhension de leur biogenèse, de leur rôle dans les interactions microbes-microbes et hôte-microbe et des maladies, ainsi que de leurs applications thérapeutiques potentielles. Un flux de travail pour l’isolation évolutive des véhicules électriques de diverses bactéries est présenté pour faciliter la normalisation de la recherche sur les véhicules électriques.

Résumé

Diverses espèces bactériennes sécrètent ~20-300 nm de vésicules extracellulaires (VE), composées de lipides, de protéines, d’acides nucléiques, de glycanes et d’autres molécules dérivées des cellules parentales. Les VE fonctionnent comme des vecteurs de communication intra et inter-espèces tout en contribuant à l’interaction entre les bactéries et les organismes hôtes dans le contexte de l’infection et de la colonisation. Compte tenu de la multitude de fonctions attribuées aux VE dans la santé et la maladie, il y a un intérêt croissant pour l’isolement des VE pour les études in vitro et in vivo . On a émis l’hypothèse que la séparation des VE en fonction des propriétés physiques, à savoir la taille, faciliterait l’isolement des vésicules provenant de diverses cultures bactériennes.

Le flux de travail d’isolement comprend la centrifugation, la filtration, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour l’isolement des VE à partir de cultures bactériennes. Une étape de filtration à flux tangentiel (TFF) entraînée par pompe a été incorporée pour améliorer l’évolutivité, permettant l’isolation du matériau des litres de culture cellulaire de départ. Escherichia coli a été utilisé comme système modèle exprimant la nanoluciférase associée à EV et la mCherry non associée à EV en tant que protéines rapporteures. La nanoluciférase a été ciblée sur les VE en fusionnant son extrémité N avec la cytolysine A. Les premières fractions chromatographiques contenant 20-100 nm EVs avec cytolysine A - nanoLuc associée étaient distinctes des fractions ultérieures contenant les protéines libres. La présence de nanoluciférase associée à l’EV a été confirmée par marquage immuno-or et microscopie électronique à transmission. Ce flux de travail d’isolation EV est applicable à d’autres espèces bactériennes à Gram négatif et à Gram positif associées à l’intestin humain. En conclusion, la combinaison de la centrifugation, de la filtration, de l’ultrafiltration/TFF et de la SEC permet une isolation évolutive des VE de diverses espèces bactériennes. L’utilisation d’un flux de travail d’isolement normalisé facilitera les études comparatives des VE microbiennes entre les espèces.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures de type liposome, de taille nanométrique, composées de lipides, de protéines, de glycanes et d’acides nucléiques, sécrétées par les cellules procaryotes et eucaryotes¹. Depuis les premières études visualisant la libération de VE par les bactéries à Gram négatif², le nombre de fonctions biologiques attribuées aux VE bactériens (20-300 nm de diamètre) n’a cessé de croître au cours des dernières décennies. Leurs fonctions comprennent le transfert de la résistance aux antibiotiques³, la formation de biofilm⁴, la détection ....

Protocole

REMARQUE : Veiller à ce que tous les travaux impliquant des bactéries et de l’ADN recombinant suivent les pratiques exemplaires en matière de confinement de la biosécurité appropriées au niveau de risque pour la biosécurité de chaque souche. Le travail doit être effectué conformément aux réglementations locales, nationales et internationales en matière de biosécurité.

1. Souches bactériennes et conditions de culture

REMARQUE : Les souches bactériennes utilisées dans cette étude étaient Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaio....

Résultats

Pour évaluer quelles fractions chromatographiques SEC ont été enrichies pour les VE, la colonne SEC a été chargée de 2 mL de milieu de culture conditionné à E. coli MP1 qui avait été concentré 1 000 fois par TFF, et des fractions séquentielles ont été recueillies. À l’aide de MRPS, il a été constaté que les fractions 1 à 6 contenaient le plus de VE (figure 2A). Les fractions suivantes contenaient très peu de VE, comprenant au lieu de protéines sans VE (Figure 2B.......

Discussion

Dans le protocole ci-dessus, une méthode est décrite qui est évolutive et isole de manière fiable les VE de diverses bactéries gram-négatives/positives et aérobies/anaérobies. Il a plusieurs points d’arrêt potentiels tout au long de la procédure, bien qu’il soit préférable d’éviter de prendre plus de 48 heures pour isoler les VE des milieux de culture bactériens conditionnés.

Tout d’abord, il consiste à cultiver des bactéries pour générer un milieu de culture bactérien conditionné. Il a été co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes PCR à paroi mince à capuchon plat de 0,5 mL	Thermo Scientific	3430	il est important d’utiliser des tubes PCR à paroi mince pour obtenir des lectures précises avec Qubit
16 % Paraformaldéhyde (formaldéhyde) solution aqueuse	Microscopie électronique	sciences 15700
250 mL Flacons à centrifuger en polypropylène Fiberlite	ThermoFisher	010-1495
500 mL Flacons centrifuges en polypropylène Fiberlite	ThermoFisher	010-1493
65 mm Adaptateur de bouteille en polypropylène à fond rond/conique	Beckman Coulter	392077	permet à Vivacell de s’adapter dans le rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 Centrifugeuse XPI	Beckman Coulter		N’est plus vendue par Beckman. L’Avanti J-26XP est le modèle contemporain le plus proche.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Bouillon de perfusion Brain Heart (BHI)	Himedia	M2101	Après l’autoclavage, le bouillon BHI et la gélose ont été introduits dans la chambre anaérobie, complétés par Menadione (1 µ ; g/L), hématine (1,2 & micro ; g/L) et le chlorhydrate de L-cystéine (0,05 %). Ils ont ensuite été incubés pendant au moins 24 h dans des conditions anaérobies avant d’être inoculés avec les souches bactériennes anaérobies.
Cartouche microfluidique C-300	Spectradyne
Chloramphénicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Microscope électronique	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
em>Escherichia coli HST08 (cellules compétentes Steller)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (cadeau)		Bactérie commensale dérivée de l’intestin de souris
Adaptateur Fiberlite 500 mL à 250 mL	ThermoFisher	010-0151-05	utilisé avec le rotor Fiberlite pour permettre l’utilisation de bouteilles de 250 mL pour une culture bactérienne de plus petite taille de culture bactérienne de départ
Rotor centrifuge à angle fixe Fiberlite	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	pour 6 bouteilles de 500 mL
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Cuivre	Microscopie électronique sciences	FCF-400-CU
Glutaraldéhyde (qualité EM, solution aqeous à 10 %)	Sciences de microscopie électronique	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	La solution mère a été préparée dans une solution de L-histidine 0,2 M sous forme de 1,2 mg/mL
Lecteur de microplaques Infinite M Nano+	Tecan		Cet équipement a été utilisé pour mesurer la fluorescence mCherry
In-Fusion  ; HD Cloning Plus	Takara	638909	Pour le clonage des fragments de PCR dans les vecteurs linéaires par PCR
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) bouillon, Miller	Difco	244620
Chlorhydrate de L-cystéine	J.T. Baker	2071-05	Il doit être pesé et ajouté directement au milieu BHI autoclavé à l’intérieur de l’anaérobie chambre
Raccord Masterflex, polypropylène, droit, adaptateur Luer vers tuyau cannelé femelle, 1/8 » ID ; 25/PK	cole-parmer -	HV-30800-08	pour circuit de tuyauterie de filtration
Raccord Masterflex, polypropylène, droit, adaptateur Luer mâle vers tuyau cannelé, 1/8 » ID ; 25/PK	cole-parmer -	HV-30800-24	pour circuit de tuyauterie de filtration
Variateur analogique Masterflex L/S, 20 à 600 tr/min	Masterflex	HV-07555-00
Tête de chargement facile Masterflex L/S pour tubes de précision, 4 rouleaux, boîtier PARA, rotor en acier inoxydable	Masterflex	EW-07514-10
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, PharmaPure, L/S 16 ; 25 pi	Cole Palmer	EW-06435-16	Tube à faible liaison/lixiviation
Menadione (vitamine K3)	MP	102259	solution mère a été préparée dans de l’éthanol sous forme de 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	dispositif TFF que nous avons utilisé pour filtrer jusqu’à 2 L de surnageant de culture E. coli
Système de dosage Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	Ce kit de dosage a été utilisé pour mesurer la luminescence de la protéine rapporteure nluc
NanoLuc (Nluc) Luciferase Anticorps, clone 965808	R& D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidique Instrument de détection d’impulsions résistives	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		pour la distribution granulométrique
OneTaq 2x Master Mix avec tampon standard	NEB	M0482	Master mix d’ADN polymérase utilisé pour effectuer les réactions PCR de routine pour le contrôle des colonies
Protein LoBind, 2,0 mL, PCR tubes propres	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	Master Mix d’ADN polymérase utilisé pour effectuer les réactions PCR nécessaires au clonage de
qEV original, 35 nm	Izon		volume de chargement maximal de 0,5 mL
qEV rack	Izon		pour une utilisation avec les colonnes SEC qEV-original
qEV-2, 35 nm	Izon		volume de chargement maximal de 2 mL
Fluorimètre Qubit	ThermoFisher		N’est plus disponible. Le produit disponible le plus proche est le fluorimètre Qubit 4.0 (cat. Non. Q33238)
Kit de dosage des protéines Qubit	ThermoFisher	Q33211	Conserver le kit à température ambiante. Les étalons sont stockés à 4 ° ;C.
Centrifugeuse Sorvall Lynx 4000	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires		Cet équipement a été utilisé pour mesurer la bioluminescence de la nanoluciférase
Système de filtration sous vide stérile Stericup Quick-release-GP (150, 250 ou 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	Un ou plusieurs filtres peuvent être utilisés pour s’adapter aux volumes de travail. D’après notre expérience, vous pouvez filtrer deux fois le volume indiqué sur la taille du produit.
Acétate d’uranyle	Sciences de la microscopie électronique	22400
Chambre anaérobie en vinyle	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus filtres à seringue (0,02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	à filtrer le diluant MRPS