Ex Utero Culture d’embryons de souris de la prégestrulation à l’organogenèse avancée

Résumé

Une plate-forme améliorée pour la culture d’embryons entiers permet un développement ex utero continu et robuste d’embryons de souris post-implantation jusqu’à six jours, des stades de prégestulation jusqu’à l’organogenèse avancée. Dans ce protocole, nous détaillons la procédure standard pour une culture d’embryon réussie en utilisant des plaques statiques et des systèmes de bouteilles rotatives.

Résumé

Les méthodes de culture d’embryons de mammifères postimplantatoires ont été généralement inefficaces et limitées à de brèves périodes après la dissection hors de l’utérus. Des plates-formes ont récemment été développées pour la culture ex utero très robuste et prolongée d’embryons de souris à partir des stades de cylindre d’œuf jusqu’à l’organogenèse avancée. Ces plates-formes permettent un développement approprié et fidèle des embryons prégaztrulés (E5.5) jusqu’au stade de formation des membres postérieurs (E11). Les embryons à gastrulation tardive (E7.5) sont cultivés dans des bouteilles tournantes dans ces contextes, tandis que la culture prolongée à partir des stades de prégestrulation (E5.5 ou E6.5) nécessite une combinaison de cultures en bouteille statiques et rotatives. En outre, la régulation sensible de la concentration d’O2 et de _CO2, de la pression des gaz, des niveaux de glucose et de l’utilisation d’un milieu de culture ex utero spécifique est essentielle au bon développement de l’embryon. Ici, un protocole détaillé étape par étape pour la culture étendue d’embryons de souris ex utero est fourni. La capacité de cultiver des embryons de souris normaux ex utero de la gastrulation à l’organogenèse représente un outil précieux pour caractériser l’effet de différentes perturbations expérimentales au cours du développement embryonnaire.

Introduction

Le développement intra-utérin de l’embryon de mammifère a limité l’étude des premiers stades du développement postimplantatoire1,2. L’inaccessibilité de l’embryon en développement entrave la compréhension des processus de développement clés qui se produisent après l’implantation de l’embryon dans l’utérus, tels que l’établissement du plan corporel de l’animal, la spécification des couches germinales ou la formation de tissus et d’organes. De plus, la très petite taille de l’embryon postimplanté précoce le rend difficile à observer par imagerie intravitale in utero avant ^E103. L....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de protection des animaux de l’Institut Weizmann des sciences et approuvées par l’Institut Weizmann IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Les femmes enceintes en bonne santé ont été invitées à donner leur consentement éclairé pour prélever du sang dans leur cordon ombilical, tel qu’approuvé par le Comité Helsinki du Centre médical Rambam (#RMB-0452-15). On a demandé aux adultes en bonne santé leur consentement éclairé pour que du sang soit prélevé conformément aux directives du Comité Helsinki de l’Institut Weizmann des sciences (#1566-3).

1. ....

Résultats

Les conditions de culture sur rouleau décrites pour les embryons E7.5 (stade de gastrulation tardive) favorisent une croissance constante et normale des embryons avec une efficacité moyenne proche de 75 % après 4 jours de culture (figure 2 et tableau 1). L’efficacité du développement embryonnaire peut varier selon divers antécédents génétiques de souris, mais elle est toujours robuste (Figure 2C). La supplémentation en HBS au lieu de HCS donne u.......

Discussion

Le protocole de culture présenté ici peut soutenir le développement approprié et continu de l’embryon de souris ex utero jusqu’à six jours, de E5.5 à E11. Auparavant, les embryons à ces stades de développement ne pouvaient se développer normalement en culture que pendant de courtes périodes (jusqu’à 48 h)¹⁵. Le couplage du module de régulation des gaz à l’incubateur de culture à rouleaux pour un contrôle précis de la concentration en oxygène et de la pression hyperbare des gaz est essenti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; Filtre à pores (250 mL)	JetBiofil	FCA-206-250
0,22 & micro ; Filtre PVDF pour seringue à pores	Millipore	SLGV033RS
8 puits & micro-plaques fond en verre/ibiTreat	iBidi	80827/80826
Bouteille avec bouchon adaptateur pour l’entrée de gaz	Arad Technologies
Bungs (Hole)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 06	Utilisé pour sceller les bouteilles au fût
Bungs (Solid)	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 07	Utilisé pour sceller le tambour rotatif
Bouteilles de culture	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC 03/BTC 04	Soit des bouteilles en verre (petites) BTC 03 soit des bouteilles en verre (grandes) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate	J.T. Baker
Couteau diamanté	Outils de sciences fines	10100-30/45
Manomètre numérique	Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd	BX-DPG80
DMEM	GIBCO	11880
Dulbecco’s Phosphate Buffered	Saline Industries biologiques	02-020-1A
Sérum fœtal	bovin Industries biologiques	04-013-1A
Module de régulation de gaz	Arad Technologies	HannaLab1
Glutamax	GIBCO	35050061	glutamine
Pince Graefe	Outils scientifiques	fins 11052-10
HEPES	GIBCO	15630056
Pince microchirurgicale (Dumont #5, #55)	Outils scientifiques fins	11255-20
Pipettes Pasteur (verre)	Pipettes Pasteur Hilgenberg	3150102
(plastique)	Alexred	SO P12201
Pénicilline/Streptomycine	Industries biologiques	03-031-1B
Boîtes de Pétri (60 mm et 100 mm)	Falcon	351007/351029
Système d’incubation de précision	B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering	BTC01	Modèle BTC01 avec kit de bulles de gaz
Pro-coagulant Tubes à essai stériles (5 mL)	Greiner Bio-One	#456005
Sérum de culture d’embryons entiers de rat	ENVIGO Bioproducts	B-4520
Microscope stéréoscopique équipé d’une plaque chauffante	Nikon	SMZ18
Seringues stériles (5, 10 ml) pour filtration des sérums	Pic Solution
Ciseaux chirurgicaux	Outils de science fine	14094-11