Préparation biologique et technique mécanique pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zozonulaires

Résumé

Le protocole décrit une méthode pour l’étude de la viscoélasticité de la matrice extracellulaire et de sa dépendance à la composition protéique ou aux facteurs environnementaux. Le système matriciel ciblé est la zonule de souris. La performance de la méthode est démontrée en comparant le comportement viscoélastique des fibres zonulaires de type sauvage avec celles dépourvues de glycoprotéine-1 associée aux microfibrilles.

Résumé

L’élasticité est essentielle à la fonction des tissus tels que les vaisseaux sanguins, les muscles et les poumons. Cette propriété est dérivée principalement de la matrice extracellulaire (ECM), le maillage protéique qui lie les cellules et les tissus ensemble. Comment les propriétés élastiques d’un réseau ECM sont liées à sa composition, et si les propriétés de relaxation de l’ECM jouent un rôle physiologique, sont des questions qui n’ont pas encore été pleinement abordées. Une partie du défi réside dans l’architecture complexe de la plupart des systèmes ECM et la difficulté d’isoler les composants ECM sans compromettre leur structure. Une exception est la zonule, un système ECM trouvé dans l’œil des vertébrés. La zonule comprend des fibres de centaines à des milliers de micromètres de longueur qui couvrent l’espace sans cellule entre la lentille et la paroi oculaire. Dans ce rapport, nous décrivons une technique mécanique qui tire parti de la structure hautement organisée de la zonule pour quantifier ses propriétés viscoélastiques et déterminer la contribution des composants protéiques individuels. La méthode implique la dissection d’un œil fixe pour exposer la lentille et la zonule et utilise une technique de traction qui étire les fibres zonulaires de manière égale pendant que leur tension est surveillée. La technique est relativement peu coûteuse mais suffisamment sensible pour détecter des altérations des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez des souris dépourvues de protéines zonulaires spécifiques ou avec le vieillissement. Bien que la méthode présentée ici soit conçue principalement pour étudier le développement oculaire et la maladie, elle pourrait également servir de modèle expérimental pour explorer des questions plus larges concernant les propriétés viscoélastiques des ECM élastiques et le rôle de facteurs externes tels que la concentration ionique, la température et les interactions avec les molécules de signalisation.

Introduction

L’œil d’un vertébré contient une lentille optique vivante qui aide à focaliser les images sur la ^rétine1. La lentille est suspendue sur l’axe optique par un système de fibres délicates orientées radialement, comme illustré à la figure 1A. À une extrémité, les fibres se fixent à l’équateur de la lentille et, à l’autre, à la surface du corps ciliaire. Leurs longueurs s’étendent sur des distances allant de 150 μm chez la souris à 1 mm chez l’homme. Collectivement, ces fibres sont connues sous le nom de zonule de ^Zinn2, la zonule ciliaire, ou simplement la zonule. Les traumatismes oculaires, les....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université de Washington et ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Fabrication de pièces spécialisées et construction d’appareils

1. Fabrication de pièces spécialisées
   1. Fabrication de sondes. Tenez un capillaire en verre à un angle comme illustré dans le panneau de gauche de la figure 2A. Placez une flamme d’un allume-cigare à environ 2 cm d’une extrémité et maintenez-la là jusqu’à ce que l’extrémité se plie de 9....

Résultats

La technique de traction décrite ici fournit une approche simple pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez la souris. En bref, l’œil de souris est d’abord préservé par injection d’un fixateur à la pression intraoculaire physiologique. Cette approche maintient le gonflage naturel de l’œil et maintient les fibres correctement pré-tendues (la fixation a été jugée acceptable après que des expériences préliminaires ont démontré qu’elle ne modifiait pas l’élasticité ou la résistance des fibres d.......

Discussion

La zonule est un système ECM inhabituel où les fibres sont disposées symétriquement et peuvent être manipulées à l’identique en déplaçant la lentille oculaire le long de l’axe optique. L’espace est également facilement accessible sans perturbation cellulaire, ce qui permet d’étudier les fibres dans un environnement proche de leur état natif. La technique pull-up tire parti de cette présentation ECM pour manipuler les fibres délicates de souris, un système génétiquement traitable, et quantifier avec précision leurs propri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vis hexagonales 1/4-20 3/4 pouce de long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 écrou	Quincaillerie
Imprimante 3D SLA	Anycubic	Photon
4-40 vis 3/8 pouce de long, 2	Quincaillerie
Capillaires, OD 1,2 mm et 3 pouces de long, sans filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) colle	Loctite
Balance numérique précise à 0,01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft	Tableur
Microscope d’inspection/dissection	Amscope	SKU : SM-4NTP	Distance de travail ~ 15 cm
Micromanipulateur, Économie 4 axes	WPI	Kite-L
Micromètre motorisé	Thorlabs	Z812B
Lentille cylindrique négative	Thorlabs		LK1431L1-75 mm focale
Boîtes de Pétri, 50 mm
Support de poteau, 3 pouces	Thorlabs	PH3
Post, 4 pouces	Thorlabs	TR4
Logiciel d’enregistrement à l’échelle	Vernier	LoggePro
Contrôleur de servomoteur	Thorlabs	KDC101
Logiciel de contrôleur de servomoteur	Thorlabs	APT
Base à fentes, 1	Thorlabs	BA1S
Bases à fentes, 2	Thorlabs	BA2
Support pour caméra micromanipulaire	WPI	M-10
USB pour microscope	Amscope	SKU : MD500
Colle activée par les UV avec source UV	Amazon