Article de méthode

Identification de la source des protéines sécrétées dans le rein par injection de Brefeldin A

DOI :

10.3791/63178

⸱

10 novembre 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’identification du type de cellule responsable de la sécrétion de cytokines est nécessaire pour comprendre la pathobiologie de la maladie rénale. Ici, nous décrivons une méthode pour colorer quantitativement le tissu rénal pour les cytokines produites par les cellules épithéliales ou interstitielles rénales à l’aide de la bréfeldine A, un inhibiteur de sécrétion, et de marqueurs spécifiques au type de cellule.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est l’une des dix principales causes de décès aux États-Unis. L’insuffisance rénale aiguë (IRA), bien que souvent guérissable, prédispose les patients à l’IRC plus tard dans la vie. Les cellules épithéliales rénales ont été identifiées comme des nœuds de signalisation clés dans l’IRA et l’IRC, par lesquels les cellules peuvent déterminer l’évolution de la maladie grâce à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. Dans l’IRC en particulier, plusieurs éléments de preuve ont démontré que les cellules tubulaires mal réparées entraînent la progression de la maladie par la sécrétion du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), du facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) et d’autres cytokines profibrotiques. Cependant, l’identification de la source et du nombre relatif de protéines sécrétées par différents types de cellules in vivo reste difficile.

Cet article décrit une technique utilisant la brefeldine A (BFA) pour empêcher la sécrétion de cytokines, permettant la coloration des cytokines dans le tissu rénal à l’aide de techniques d’immunofluorescence standard. Le BFA inhibe le transport du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi, qui est nécessaire à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. L’injection de BFA 6 h avant le sacrifice entraîne une accumulation de TGF-β, de PDGF et de CTGF à l’intérieur des cellules des tubules proximaux (PTC) dans un modèle murin de cisplatine de l’IRA et du TGF-β dans un modèle murin d’acide aristolochique (AA) de l’IRC. L’analyse a révélé que BFA + cisplatine ou BFA + AA augmentait significativement le signal positif TGF-β par rapport à BFA + solution saline, cisplatine ou AA seul. Ces données suggèrent que la BFA peut être utilisée pour identifier le type de cellule produisant des cytokines spécifiques et quantifier les quantités relatives et/ou les différents types de cytokines produites.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On estime que >10 % de la population mondiale souffre d’une forme de maladie rénale1. Définie par son apparition rapide, l’IRA est en grande partie curable ; cependant, un épisode d’IRA peut prédisposer les patients à développer une MRC plus tard dans la vie 2,3. Contrairement à l’IRA, l’IRC est caractérisée par une fibrose progressive et une aggravation de la fonction rénale, conduisant à une insuffisance rénale terminale nécessitant un traitement de remplacement rénal. La plupart des lésions rénales ciblent les cellules épithéliales spécialisées, telles que les podocytes ou les cellules tubulaires proximales, qui composent le néphron 4,5. Après une blessure, les cellules épithéliales survivantes aident à coordonner la réponse de réparation par la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. De cette façon, les cellules survivantes peuvent moduler la réponse immunitaire, diriger le remodelage de la matrice extracellulaire et aider à la récupération des organes.

Les cytokines sont de petites protéines sécrétées essentielles à la modulation de la maturation, de la croissance et de la réactivité des organismes multicellulaires 6,7. Ils fonctionnent comme des messagers de signaux entre divers types de cellules, y compris les cellules immunitaires et épithéliales8. Bien que l’on pense que les cytokines sont sécrétées principalement par les cellules immunitaires, des recherches de longue date ont démontré que les cellules épithéliales et interstitielles rénales sécrètent également des cytokines comme signaux pour d’autres cellules rénales résidentes, telles que les cellules tubulaires, les cellules interstitielles et les cellules immunitaires 9,10. Les PTC, en particulier, jouent un rôle important dans la phase d’initiation et de récupération après l’IRA11. Cependant, les PTC mal réparés sont connus pour sécréter des cytokines profibrotiques telles que le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), le facteur de croissance dérivé des plaquettes-D (PDGF-D) et le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF), contribuant à la progression de l’IRC12. Ainsi, les cellules épithéliales rénales utilisent des cytokines sécrétées pour moduler les lésions rénales.

Bien que l’on sache que les cellules épithéliales rénales sécrètent des cytokines, la source exacte et la contribution relative de chaque type de cellule ont été difficiles à déterminer en raison des défis techniques liés à l’étude des protéines sécrétées13. La cytométrie en flux, une approche couramment utilisée pour mesurer les cytokines, est difficile à réaliser sur les reins lésés, en particulier chez les reins très fibreux. Avec la recombinase Cre pilotée par un promoteur de cytokines, les souris rapporteures de cytokines sont souvent utilisées pour identifier le type de cellule qui exprime une cytokine donnée. Cependant, l’utilisation de souris rapporteures est limitée en raison de la nécessité de croiser des souris rapporteures dans divers contextes de knock-out, du manque de rapporteurs appropriés et du fait qu’une seule cytokine peut être analysée à la fois. Ainsi, il est nécessaire de développer une technique simple, polyvalente et abordable pour détecter les cellules rénales libérant des cytokines.

Nous avons émis l’hypothèse que l’injection de BFA, un inhibiteur de sécrétion qui bloque le transport du réticulum endoplasmique-Golgi in vivo, permettrait la coloration des protéines sécrétées dans le tissu rénal (Figure 1A,B), comme le montrent les tests basés sur la cytométrie en flux14,15. Avec des fabricants spécifiques de type de cellule, cette technique pourrait être utilisée pour identifier la source et la contribution relative des cellules productrices de cytokines dans les reins lésés. Contrairement aux échantillons de cytométrie en flux, les tissus fixes peuvent être conservés à long terme avec la préservation des protéines et des structures cellulaires, ce qui permet une étude plus approfondie des cellules sécrétoires. Pour tester cette hypothèse, des reins de souris ont été blessés avec un modèle d’IRA (cisplatine) et un modèle de CKD (néphropathie acide aristolochique (NAA)), injectés avec BFA et colorés à l’aide de techniques immunofluorescentes standard.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université Vanderbilt.

1. Animaux

  1. Utiliser des souris mâles BALB/c âgées de 8 à 12 semaines (poids corporel : environ 25 g) pour la néphropathie induite par l’acide cisplatine ou aristolochique.
  2. Assurez-vous que les souris sont en bonne santé et qu’elles ne présentent aucun signe évident de détresse ou de blessure causée par le combat.
    REMARQUE : Les blessures, en particulier à la queue, pourraient interférer avec le protocole décrit ici. Les souris BALB/c ont été choisies parce qu’il est plus facile de visualiser la veine de la queue pour l’injection chez ces souris. Le protocole décrit ici fonctionne pour d’autres souches de souris ; Cependant, la posologie du cisplatine ou de l’acide aristolochique peut différer d’une souche à l’autre.

2. Injection de cisplatine

  1. Dissoudre le cisplatine dans une solution saline stérile jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL.
    REMARQUE : Le cisplatine ne se dissout pas complètement à température ambiante. Il doit être manipulé dans une hotte.
  2. Réchauffez la solution de cisplatine dans un bain-marie à 37 °C et agitez à plusieurs reprises jusqu’à ce que le cisplatine soit complètement dissous.
  3. Pesez les souris et calculez le volume de solution de cisplatine nécessaire pour injecter 20 mg/kg de poids corporel (p.c.).
  4. Désinfectez la peau abdominale à l’aide d’écouvillons à la povidone iodée (7,5 %) et à l’alcool (70 %) en alternant 3 fois chacun.
  5. À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 25 G, injectez la solution de cisplatine par voie intrapéritonéale.
  6. Passer à la section 4 le 3e jour après l’injection.

3. Injection d’acide aristolochique (AA)

  1. Dissoudre l’acide aristolochique-I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 0,5 mg/mL.
    REMARQUE : AA doit être manipulé dans une hotte. L’AA-I doit être utilisé car c’est la forme dominante induisant des lésions rénales.
  2. Réchauffez la solution AA dans un bain-marie à 37 °C et agitez à plusieurs reprises jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
  3. Pesez les souris et calculez le volume de la solution d’AA à injecter à 5 mg/kg p.c.
  4. Désinfectez la peau abdominale à l’aide d’un tampon de povidone iodé (7,5 %) et d’alcool (70 %) 3 fois.
  5. À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 25 G, injectez la solution d’AA par voie intrapéritonéale.
  6. Injectez AA tous les deux jours pour un total de 3 injections.
  7. Passer à la section 4 le 42e jour après la dernière injection.

4. Préparation de la solution BFA

  1. Dissoudre le BFA dans du diméthylsulfoxyde à une concentration de 10 mg/mL pour obtenir une solution mère.
  2. Conservez la solution mère à -20 °C.
  3. Diluer la solution mère de BFA avec du PBS stérile à la concentration de travail finale de 1,25 mg/mL
    REMARQUE : Préparez une solution de travail fraîche à chaque fois immédiatement avant l’injection.

5. Injection de BFA dans la veine caudale

  1. Avant l’injection, mettez la cage à moitié sur un coussin chauffant pendant 10 minutes pour vous assurer que les souris sont au chaud afin d’éviter une baisse de la température corporelle, ce qui peut provoquer une vasoconstriction des vaisseaux de la queue et interférer avec l’injection.
    REMARQUE : Placez la cage sur les coussins chauffants de sorte que la moitié de la cage soit sur le coussin tandis que l’autre moitié ne l’est pas. De cette façon, lorsque les souris se sentent chaudes, elles peuvent se déplacer de l’autre côté de la cage et vice versa.
  2. Immobiliser les souris à l’aide de dispositifs de contention de taille appropriée disponibles dans le commerce.
  3. Désinfectez la queue à l’aide de povidone iodée et d’un tampon d’alcool trois fois comme décrit ci-dessus.
  4. Tenez la queue horizontalement et visualisez les nervures latérales de la queue (Figure 1C). Utilisez une source de lumière sous la queue pour aider à visualiser les veines.
  5. Insérez une aiguille de 28 G, en gardant l’aiguille et la seringue parallèles à la veine dans la direction de la tête.
  6. Injecter 200 μL de la solution de BFA à 1,25 mg/mL (0,25 mg de BFA). Attendez que la veine devienne claire car le sang est remplacé par la solution d’injection, indiquant que l’injection a réussi.
  7. Retirez l’aiguille et appuyez doucement sur la queue jusqu’à ce que le saignement cesse.
  8. Remettez les souris dans la cage et surveillez-les pour détecter d’autres saignements ou des signes de détresse.

6. Sacrifice et récolte des reins

  1. Euthanasier les souris avec une surdose d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale 6 h après l’injection de BFA.
    REMARQUE : Le point temporel de 6 heures a été choisi sur la base de la littérature démontrant que 6 h de traitement BFA dans d’autres organes permettent une accumulation suffisante de cytokines dans les cellules pour les visualiser par coloration immunofluorescente16.
  2. Immédiatement après le sacrifice, exposez l’abdomen et le cœur de la souris par une incision médiane ventrale.
  3. Prélever 100 à 500 μL de sang pour un dosage de l’azote uréique du sang (BUN) par ponction cardiaque. Utilisez des aiguilles de 25 g avec des seringues d’insuline de 1 ml pour prélever le sang. Pour prévenir la coagulation, ajoutez 5 μL de solution d’héparine (100 mg/15 mL de dH2O) à chaque échantillon.
    REMARQUE : Un minimum de 20 μL de sang est nécessaire pour le dosage de l’urgie ; cependant, environ 500 μL peuvent être collectés par ponction cardiaque après l’euthanasie, ce qui pourrait être utile pour d’autres tests. Prélevez autant de sang que possible.
  4. Conservez les échantillons de sang sur de la glace jusqu’à ce que les reins soient prélevés dans la section 7 ci-dessous.
    1. Centrifuger les échantillons de sang à 1 300 × g pendant 10 min.
    2. Isolez délicatement le plasma et conservez-le à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer le dosage BUN dans la section 17 ci-dessous. Vous pouvez également stocker les échantillons de plasma pour les tests de créatinine.

7. Perfusion et ablation des reins

  1. Perfuser la souris avec 10 à 20 ml de PBS à travers le ventricule gauche à l’aide d’une seringue de 20 ml à un débit de 2 à 4 ml/min jusqu’à ce que le perfusat devienne clair.
  2. Retirez les reins en tenant l’artère rénale et la veine avec des pinces près de la papille et en coupant les vaisseaux du côté opposé au rein.
  3. Retirez délicatement la capsule rénale en la décollant à la main ou à l’aide d’une paire de pinces fines et stériles.
  4. En fonction de l’anticorps, passer à la section 8 pour la préparation des tissus fixés inclus dans la paraffine ou à la section 10 pour la préparation des tissus congelés fixés.
    REMARQUE : Le traitement des tissus devra être optimisé pour chaque anticorps à utiliser pour la coloration.

8. Tissu inclus en paraffine pour la coloration TGF-β et PDGF-D

  1. Coupez le rein en deux en le plaçant sur une lame de verre propre et en le coupant horizontalement avec une nouvelle lame de rasoir. Placer la moitié dans 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS pendant 24 h sur un rotateur bout à bout à une vitesse de 10 rotations par minute (tr/min).
    REMARQUE : Le rein entier n’est pas nécessaire pour la section. Une moitié du rein peut être stockée ou utilisée pour d’autres tests.
  2. Remplacez le PFA par de l’éthanol à 70 %.
  3. À ce stade, soumettez la moitié rénale pour le traitement et l’intégration de la paraffine, puis sectionnez les tissus rénaux inclus dans la paraffine à 4-6 μm à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames chargées et prénettoyées17,18.
    REMARQUE : Les reins ont été traités et incorporés dans de la paraffine par la ressource partagée de pathologie translationnelle du centre médical de l’Université Vanderbilt et stockés à température ambiante.

9. Déparaffinisation et réhydratation

  1. Placez les lames dans un support de coloration pour lames et plongez-les dans un puits de coloration contenant du D-limonène pendant 5 min, en vous assurant que le tissu est complètement immergé. Répétez l’opération dans un puits contenant du D-Limonène frais.
  2. Réhydratez les tissus en trempant les lames dans des dilutions successives d’éthanol à 100 % (2x), 95 %, 90 % et 70 % pendant 5 minutes chacune.
  3. Laver les lames à l’eau dH2O pendant 5 min.
  4. Effectuer le prélèvement de l’antigène en incubant les sections dans un tampon de citrate (pH 6,0) dans un autocuiseur à 121 °C et 15 psi pendant 45 min.
  5. Lavez les lames à coulant dH2O pendant 20 min.
  6. Passez à l’article 12.

10. Préparation de tissus congelés pour la coloration CTGF

  1. Coupez le rein en deux le long de l’axe horizontal à l’aide d’une lame de rasoir fraîche.
    REMARQUE : Le rein entier n’est pas nécessaire pour la section. Une moitié du rein peut être stockée ou utilisée pour d’autres tests.
  2. Mettre la moitié du rein dans 10 mL de PFA à 0,5 % dans un tube de 15 mL sur un rotateur pendant 2 h à 4 °C à une vitesse de 10 tr/min.
  3. Décanter le PFA dans un récipient pour une élimination appropriée et ajouter 10 mL de glycine 0,1 M dans du PBS pendant 1 h à 4 °C à une vitesse de 10 tr/min.
  4. Décantez la glycine, ajoutez 10 ml de saccharose à 15 % dissous dans du PBS et placez le tube sur un rotateur pendant une nuit à 4 °C et 10 tr/min.
  5. Décantez le saccharose à 15 % et remplacez-le par 10 ml de saccharose à 30 % dissous dans du PBS pendant 1 h à 4 °C et 10 tr/min.
  6. Remplissez le moule d’enrobage avec un composé à température de coupe optimale (OCT) et enfoncez la moitié du rein à partir de l’étape 10.5 avec la surface coupée du rein vers le bas.
  7. Placez soigneusement le moule contenant le demi-rein et l’OCT dans une flaque d’azote liquide pour le congeler.
    REMARQUE : Ne laissez pas l’azote liquide entrer directement en contact avec l’OCT car cela peut entraîner la formation de bulles. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’utilisation d’azote liquide, comme des lunettes de protection/un écran facial, des gants cryogéniques et une blouse de laboratoire. Il est préférable d’utiliser de longues pinces, ~25 cm, pour placer les moules dans de l’azote liquide.
  8. Une fois congelé, stockez le moule à -80 °C.

11. Section congelée

  1. Assurez-vous que le cryostat est à -20 °C.
  2. Stocker les moules contenant des échantillons en OCT dans le cryostat à -20 °C pendant 2 h pour équilibrer la température.
  3. Retirez le moule en tenant les languettes et en appuyant par le bas.
  4. Placez l’OCT frais sur un porte-échantillon et placez le bloc d’échantillon congelé sur le dessus, le côté tissu tourné vers le dos du porte-échantillon.
  5. Placez le porte-échantillon et l’échantillon sur l’étagère de congélation.
  6. Placez un extracteur de chaleur lesté sur le dessus du bloc pour aplatir la surface. Gardez le couvercle du cryostat fermé lorsqu’il n’est pas utilisé pour éviter les fluctuations de température.
  7. Une fois que l’OCT frais entre le bloc d’échantillon et le porte-échantillon est congelé, assurez-vous que la connexion est sécurisée.
  8. Fixez le porte-échantillon sur la tête du microtome du cryostat.
  9. Commencez la section jusqu’à ce que le tissu soit visible dans le bloc d’échantillons.
  10. Sectionnez le tissu rénal à 4-6 μm et prélevez les sections sur une lame19 chargée de température ambiante.
  11. Une fois le mouchoir ramassé, conservez la lame à une température de -20 °C à -80 °C jusqu’au moment de la coloration. Ne le laissez pas décongeler jusqu’au moment de commencer à teindre.
  12. Avant de teindre, retirez la ou les lames de l’entreposage et laissez-les réchauffer à température ambiante. Ne laissez pas les sections sécher.
  13. Une fois à température ambiante, laver immédiatement les sections avec du PBS pendant 5 minutes deux fois à température ambiante pour éliminer le composé OCT.
  14. Passez à l’article 12.

12. Coloration par immunofluorescence

  1. Tracez le contour des sections de tissu à l’aide d’un marqueur de barrière hydrophobe. Maintenez une distance d’au moins 5 mm entre le tissu et le contour de la barrière hydrophobe.
  2. Ajouter 50 μL de tampon de blocage contenant 3 % de sérum d’ânesse et 0,1 % de Triton dans 1 % de sérum de bovin, d’albumine/solution saline tamponnée au Tris (TBS) sur le dessus de la section et incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
  3. Diluez les anticorps primaires avec du PBS à la concentration appropriée. Pour la détection des cytokines, utilisez 50 μL de solutions d’anticorps primaires dirigés contre le TGF-β1 (1:200), le PDGF-D (1:400) et le CTGF (1:200). Pour le marquage des myofibroblastes, utiliser 50 μL d’une solution de l’anticorps primaire dirigé contre l’actine du muscle alpha-lisse (α-SMA) conjuguée à Cy3 à 1:200.
  4. Retirez la solution bloquante et ajoutez les anticorps primaires dans la section, en veillant à ce qu’elle ne s’échappe pas du contour hydrophobe circulaire et incubez toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Réappliquez la barrière hydrophobe en cas de fuite.
  5. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min.
  6. Diluez les anticorps secondaires appropriés à 1:200 avec du PBS.
  7. Incuber les échantillons avec 50 μL de solutions d’anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
  8. Laver avec du PBS pendant 5 min.
  9. Lectine de lotus tetragonolobus diluée (LTL) conjuguée à la fluorescéine dans du PBS avec Ca2+ et Mg2+ à la concentration de 10 μg/mL.
    REMARQUE : Ca2+ et Mg2+ sont nécessaires pour la liaison LTL.
  10. Incuber les tissus avec 50 μL de solution LTL pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
  11. Laver avec du PBS avec Ca2+ et Mg2+ pendant 5 min.
  12. Incuber avec 50 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 5 μg/mL dans l’eau) pour colorer l’ADN et les noyaux pendant 5 minutes à température ambiante.
  13. Montez les lamelles en ajoutant 20 μL de réactif de montage anti-décoloration sur le tissu et en plaçant lentement la lamelle. Attendez 24 h pour que le réactif anti-décoloration se solidifie avant d’imager.
    REMARQUE : La liaison des lectines peut se dégrader avec le temps, entraînant une perte de signal. Il est préférable d’imager les échantillons colorés à la lectine peu de temps après la mise en place du réactif de montage. Si une perte de signal est observée, Ca2+ et Mg2+ peuvent être ajoutés au réactif de montage pour préserver la coloration.

13. Acquisition d’images

  1. Allumez le microscope inversé (voir le tableau des matériaux) avec une platine XY automatisée.
  2. Sélectionnez l’objectif 20x.
  3. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images (voir la Table des matériaux).
  4. Cliquez sur Live pour ouvrir la fenêtre d’affichage en direct.
  5. Trouvez la section du tissu et assurez-vous qu’elle est nette.
  6. Cliquez sur le menu Acquérir et sélectionnez Numériser une grande image.
  7. Dans la fenêtre Scanner une grande image , configurez la zone à numériser en déplaçant la platine à l’aide du joystick vers la partie la plus à gauche de la section de tissu et cliquez sur la flèche gauche. Répétez l’opération pour les segments tissulaires supérieur, le plus à droite et inférieur.
  8. Cliquez sur le menu d’acquisition .
  9. Assurez-vous que la case pour les grandes images est cochée.
    1. Si vous capturez des images multicanaux, cliquez sur l’onglet Lambda .
    2. Cliquez sur chaque canal et réglez le temps d’exposition à un niveau où la coloration est apparente sans saturation d’aucune partie de l’image.
      REMARQUE : Ces paramètres doivent être cohérents au sein d’un groupe expérimental. La modification des paramètres d’acquisition entre les échantillons entraînera des résultats inexacts.
    3. Répétez l’étape 9.2 pour chaque canal à collecter.
  10. Cliquez sur Scan.

14. Analyse d’images

  1. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images.
  2. Cliquez sur Fichier | Ouvrez et sélectionnez l’image.
  3. Faites un clic droit sur la fenêtre de l’image et choisissez la région d’intérêt polygonale (ROI).
  4. Décrivez le retour sur investissement à l’aide de l’outil à main levée . Décrivez les cellules tubules LTL-positives ou les cellules interstitielles α-SMA positives.
  5. Cliquez sur l’onglet Mesure | Seuil.
  6. Configurez les limites supérieure et inférieure du seuil en ajustant les curseurs de chaque côté de la zone de signal positif.
  7. Cliquez sur l’onglet ROI .
  8. Cliquez sur l’icône Exporter pour enregistrer les valeurs. Utilisez un tableur pour calculer le pourcentage de zone de signal positif/zone de retour sur investissement.

15. Alternative : Analyse d’images avec un logiciel libre (ImageJ)

  1. Ouvrez ImageJ.
  2. Cliquez sur Fichier | Ouvrir pour afficher une image.
  3. Cliquez sur Sélections à main levée.
  4. Sélectionnez le retour sur investissement en le décrivant à l’aide de l’outil à main levée . Décrivez les cellules tubules LTL-positives ou les cellules interstitielles α-SMA positives.
  5. Cliquez sur le menu Edition et sélectionnez Effacer à l’extérieur.
  6. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesurer pour déterminer la zone de retour sur investissement.
  7. Aller à l’image | Couleur | Diviser les chaînes.
  8. Ajustez les limites supérieure et inférieure du seuil pour détecter la zone du signal positif.
  9. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesurer.
  10. Enregistrez les données.
  11. Ouvrez les données à l’aide d’un tableur et calculez le rapport entre la surface du signal positif et la zone ROI.

16. En option : Imagerie avec microscope confocal à balayage laser

REMARQUE : Pour obtenir des images à plus haute résolution pour la publication, la microscopie confocale à balayage fournit des images plus claires et un bruit de fond réduit dans le tissu rénal.

  1. Allumez le microscope confocal à balayage laser (voir le tableau des matériaux).
  2. Sélectionnez l’objectif 40x (voir le tableau des matériaux).
  3. Cliquez sur l’onglet Localiser et recherchez les tissus en ajustant la mise au point.
  4. Allez dans l’onglet Acquisition , cliquez sur Canaux, puis choisissez 1 AU dans le paramètre sténopé.
  5. Ajustez l’intensité du gain laser dans chaque canal de sorte que le signal positif soit visible mais non saturé. Assurez-vous que les paramètres d’un ensemble d’échantillons expérimentaux restent constants.
  6. Cliquez sur Snap (Snap ) et enregistrez l’image dans le format souhaité.

17. Taux plasmatique d’azote urétique

  1. Retirez les échantillons à -20 °C et décongelez-les sur de la glace.
  2. Diluer le plasma avec du dH2O dans un rapport de 1:10.
  3. Pour chaque échantillon, mettez en place trois réactions distinctes en double dans une plaque à 96 puits.
    1. Pour l’échantillon plus l’étalon, ajoutez 5 μL d’urée à 200 mg/dL et 20 μL de plasma dilué.
    2. Pour l’échantillon seul, ajouter 5 μL dedH2O et 20 μL de plasma dilué.
    3. Pour un échantillon à blanc, ajouter 5 μL de dH2O et 20 μL de plasma dilué.
  4. Mélanger 85 μL de réactif + 1 μL d’uréase par échantillon pour préparer la solution de travail.
  5. Ajouter 80 μL de la solution de travail dans les puits « échantillon plus étalon » et « échantillon seul ».
  6. Ajoutez 80 μL de réactif (sans uréase) dans le puits « blanc d’échantillon » de l’étape 17.3 ci-dessus.
  7. Tapotez doucement la plaque pour mélanger et incubez pendant 5 min à température ambiante.
  8. Lisez OD560 avec un lecteur de plaques.
  9. Calculez la concentration d’urée Eq (1) et convertissez-la en BUN à l’aide de Eq (2).
    Urée (mg/dL) = (Échantillon seul-Échantillon blanc)/(Étalon-Échantillon seul) x (Étalon/4) x (Facteur de dilution) (1)
    BUN (mg/dL) = concentration d’urée/2,14 (2)
    REMARQUE : Ce test mesure la teneur en urée (poids moléculaire : 60) du sérum ; cependant, BUN ne fait référence qu’à la teneur en azote de l’urée (poids moléculaire : 28). Ainsi, une correction de 2,14 (60/28) est nécessaire pour convertir la concentration d’urée en BUN.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour examiner le rôle des cellules épithéliales tubulaires dans la production de cytokines après l’IRA induite par le cisplatine, le cisplatine a été injecté à une concentration de 20 mg/kg suivi d’une injection intraveineuse de 0,25 mg de BFA le jour 3 après l’injection de cisplatine. Les reins ont été prélevés 6 h plus tard. Des reins inclus dans de la paraffine ont été sectionnés et colorés avec du TGF-β, du PDGF-D et du CTGF, des cytokines représentatives responsables de la réparation tissulaire de l’IRA. Comme le mo...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les PTC rénaux sont connus pour réguler l’IRA et l’IRC par la sécrétion de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ainsi que de nombreuses autres protéines 20,21,22,23. De même, les glomérules, les tubules distaux et d’autres cellules épithéliales rénales, ainsi que les cellules interstitielles, sécrètent ces protéines et/ou...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Association américaine du cœur (AHA) : Kensei Taguchi, 20POST35200221 ; Le HHS | NIH | Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) : Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringues à insuline de 1 mLBD329654
Seringue de 10 mLBD302995
tube de 2 mLde marque Fisher05-408-138
Seringue de 20 mLBD302830
Aiguilles de 25 gBD305125
aiguilles de 28 g329424
plaque de 96 puitsCorning9017
Acide aristolochique-ISigma-AldrichA9461
&alpha ;-SMA anticorps conjugué avec Cy3Sigma-AldrichC6198RRID :AB_476856
Lame pour cryostatC.L. Sturkey. IncDT315R50
Albumine sérique bovine (BSA) Sigma-AldrichA7906
Brefeldin ASigma-AldrichB6542
CisplatineSigma-AldrichP4394
Acide citriqueSigma-Aldrich791725
Microscope confocalZEISS²sp ; LSM710
Objectifs de microscopie confocaleZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Logiciel confocalZEISSZEN
Coplin jarFisher Scientific19-4
Verre de couvertureFisher brand12545F
CryostatLeicaCM1850
CTGFanticorps GenetexGTX124232RRID :AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch711-165-152RRID : AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson immunoresearch705-175-147RRID : AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Moules à base jetables Fisherbrand22-363-553
sérum d’âneJackson immunoresearch017-000-121
EthanolDecon Labs, Inc.2701
PinceVETUSESD-13
GlycineFisher marque12007-0050
Coussins chauffantsKent scientificDCT-20
Héparine sel de sodiumACROSorganics 41121-0010100mg/15ml de dH2O
Chambre humidifiéeInvitrogen44040410Une boîte en plastique recouverte d’une feuille peut être utilisée comme chambre humidifiée alternative.
Seringues à insulineBD329461
Microscope inverséNIKONEclipse Ti-E2immunofluorescence
KIM-1anticorps R & DAF1817RRID : AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)Diagnostic nationalHS-200
lotus tetragonolobus lectineVecteurFL-13212
Lame de microscopeFisher scientific12-550-343
MicrotomeReichertJung 820 II
Caméra CMOS monochromeNIKON² DS-Qi-2
Kit chirurgical pour sourisKent scientificINSMOUSEKIT
NIS ElementsObjectifs NIKON NIKON
Plan Apo 20x/0.75logiciel d’acquisition d’images lié à Eclipse Ti-E2 (microscope inversé)
OCT composéScigen4586
Pap penVectorH-4000
PBS avec calcium et magnésiumCorning21-030-CV
PBS sans calcium et magnésium  ; Corning21-031-CV
Anticorps PDGF-DThermo-Fisher scientific40-2100
PFAMicroscopie électronique Science15710RRID : AB_2533455
Lecteur de plaquesPromegaGloMax® ; Découvrir Microplate Reader4 % PFA est dilué à partir de 16 % dans du PBS.
povidone iodée (Bétadine)Avrio Health L.P.NDC 67618-151-17
Autocuiseur  ; Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Réactif Anti-FadeInvitrogenP36930
Quantichrom Urea (BUN) Tay Kit IIBioAssay SystemsDUR2-100
Lame de rasoir à un seul tranchant pour la dissection rénale (.009", 0.23 mm)Outils IDL521013
Chauffe-lamesLab Scientific Inc.,XH-2001
LogicielNIKONNIS elements
SaccharoseRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris Tampon EDTACorning46-009-CMRRID : AB_10747473
Citrate trisodique dihydratéSigma-AldrichSLBR6660V
Citrate trisodique dihydratéSigma-Aldrich
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Lame de microscope chargée en verre blanc, taille 25 x 75 mm, bords rectifiés, bleu givréGlobe Scientific1358D
à SLBR6660V

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Prot ines s cr t es par le reinD tection des cytokinesInsuffisance r nale aiguMaladie r nale chroniqueCellules du tubule proximalMarquage immunofluorescentAccumulation de TGF b taInjection dans la veine caudaleMicroscopie confocale

Articles connexes