Utilisation de l’optogénétique pour inverser la neuroplasticité et inhiber la recherche de cocaïne chez le rat

Résumé

Les méthodes décrites ici décrivent une procédure utilisée pour inverser optogénétiquement la plasticité induite par la cocaïne dans un circuit comportementalement pertinent chez le rat. La stimulation optique soutenue à basse fréquence des synapses thalamo-amygdales induit une dépression à long terme (LTD). La DLT optogénétique in vivo induite chez des rats ayant consommé de la cocaïne a entraîné une atténuation subséquente de la recherche de drogue motivée par des signaux.

Résumé

Ce protocole démontre les étapes nécessaires à l’utilisation d’outils optogénétiques pour inverser la plasticité induite par la cocaïne dans les circuits thalamo-amygdale afin de réduire les comportements ultérieurs de recherche de cocaïne chez le rat. Dans nos recherches, nous avions constaté que lorsque des rats s’auto-administrent de la cocaïne par voie intraveineuse associée à un signal audiovisuel, les synapses formées aux entrées du noyau géniculé médian du thalamus (MGN) sur les principaux neurones de l’amygdale latérale (LA) deviennent plus fortes à mesure que l’association signale-cocaïne est apprise. Nous avons émis l’hypothèse que l’inversion de la plasticité induite par la cocaïne au niveau de ces synapses réduirait le comportement de recherche de cocaïne motivé par les signaux. Afin d’accomplir ce type de neuromodulation in vivo, nous voulions induire une dépression synaptique à long terme (LTD), qui diminue la force des synapses MGN-LA. À cette fin, nous avons utilisé l’optogénétique, qui permet la neuromodulation des circuits cérébraux à l’aide de la lumière. L’opsine excitatrice oChiEF a été exprimée sur des terminaux MGN présynaptiques dans l’AL en infusant un AAV contenant oChiEF dans le MGN. Des fibres optiques ont ensuite été implantées dans le LA et une lumière laser de 473 nm a été pulsée à une fréquence de 1 Hz pendant 15 minutes pour induire la LTD et inverser la plasticité induite par la cocaïne. Cette manipulation produit une réduction durable de la capacité des signaux associés à la cocaïne à induire des actions de recherche de drogue.

Introduction

La toxicomanie est un problème de santé publique très grave aux États-Unis et dans le monde. Malgré des décennies de recherches intenses, il existe très peu d’options thérapeutiques efficaces ^1,2. Un revers majeur du traitement est le fait que la consommation chronique de drogues génère des souvenirs associatifs à long terme entre les signaux environnementaux et la drogue elle-même. La réexposition à des signaux liés à la drogue entraîne des réponses physiologiques et comportementales qui motivent la consommation continue de drogues et la rechute³. Une nouvelle stratégie thérapeutique consiste à mettre en œuvre des traitements basés sur la mémoire qui visent à manipuler les circuits impliqués dans la régulation des associations médicament-signal. Récemment, il a été observé que les synapses de l’amygdale latérale (LA), en particulier celles provenant du noyau géniculé médian (MGN) du thalamus, sont renforcées par l’auto-administration répétée de cocaïne associée à des signaux, et que cette potentialisation peut soutenir le comportement de recherche de cocaïne ^4,5. Par conséquent, il a été proposé que la réintégration induite par les signaux puisse être atténuée en inversant la plasticité au niveau des synapses MGN-LA.

La capacité de cibler précisément la plasticité synaptique d’un circuit cérébral spécifique a été un défi majeur pour le domaine. Les outils pharmacologiques traditionnels ont eu un certain succès dans la diminution des comportements de rechute, mais sont limités par l’incapacité de manipuler les synapses individuelles. Cependant, le développement récent de l’optogénétique in vivo a fourni les outils nécessaires pour surmonter ces limitations et contrôler les voies neuronales avec une précision temporelle et spatiale ^6,7,8. En exprimant des opsines sensibles à la lumière dans un circuit cérébral spécifique, la lumière laser peut ensuite être utilisée pour activer ou inhiber le circuit. La stimulation optique dépendante de la fréquence peut être utilisée pour manipuler spécifiquement la plasticité synaptique du circuit chez un animal au comportement.

Ce manuscrit décrit la procédure suivie pour manipuler le circuit MGN-LA pertinent sur le plan comportemental en utilisant l’optogénétique in vivo . Tout d’abord, l’opsine excitatrice oChIEF a été exprimée dans le MGN et des fibres optiques ont été implantées bilatéralement dans le LA. Les animaux ont ensuite été entraînés à s’auto-administrer de la cocaïne d’une manière dépendante des signaux, ce qui potentialise la voie MGN-LA. Ensuite, une stimulation soutenue à basse fréquence avec une lumière laser de 473 nm a été utilisée pour produire une LTD spécifique au circuit. L’inversion de la plasticité induite par la consommation de cocaïne a généré une réduction durable de la capacité des signaux à déclencher des actions associées au comportement de recherche de drogue.

Protocole

Les expériences décrites dans ce protocole étaient conformes aux lignes directrices établies par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Pittsburgh. Toutes les procédures ont été effectuées sur des rats Sprague-Dawley adultes naïfs qui pesaient de 275 à 325 g à leur arrivée.

1. Construction d’implants en fibre optique et de câbles de raccordement

1. Préparer les implants de fibres optiques en suivant les protocoles précédemment publiés⁹. Les expériences décrites dans ce protocole ont utilisé une fibre de base de 200 μm (0,5 NA) et une virole céramique multimode LC/PC de Ø1,25 mm, taille de trou de Ø230 μm.
   1. Utilisez un outil Dremel pour marquer le tiers inférieur d’une virole (le plus proche de l’extrémité plate de la virole). La notation des viroles les aide à rester attachés au ciment dentaire, ce qui augmente la probabilité qu’ils restent en sécurité tout au long de l’expérimentation.
   2. Utilisez des coupe-fil pour couper ~35 mm de fibre. Utilisez un outil de décapage de fibre pour dépouiller ~ 25 mm de fibre, en laissant 10 mm non exposés.
   3. Préparez de l’époxy thermodurcissable conformément aux instructions du fabricant. Dissoudre 1 g de poudre de résine dans 100 mg de composé durcisseur. Fixez une aiguille émoussée de calibre 25 à une seringue de 1 mL. Remplissez la seringue avec de l’époxy et fixez un embout d’aiguille émoussé de calibre 25.
   4. Utilisez un étau ou une pince pour maintenir solidement la virole avec le côté plat vers le haut et le côté convexe vers le bas. Avec la seringue remplie d’époxy, ajoutez une goutte d’époxy sur le côté plat de la virole, en faisant preuve de prudence pour essuyer l’excès d’époxy des côtés de la virole.
   5. Insérez la partie dénudée de la fibre à travers la virole en laissant 5 mm supplémentaires de fibre dénudée exposée. Dans le cas des implants LA, la fibre sera implantée à 7,9 mm ventrale au bregma, de sorte que la longueur exposée de la fibre non dénudée devrait être de ~ 13 mm.
   6. Durcissez l’époxy avec un pistolet thermique pendant environ 30-40 s jusqu’à ce qu’il devienne de couleur noire / ambre.
   7. Marquez la fibre directement à l’interface de l’extrémité convexe de la virole avec un couteau diamant et utilisez un doigt pour tapoter doucement la fibre.
   8. Polir l’extrémité convexe de la virole en la tenant avec un hémostatique, en veillant à appliquer une pression uniforme et en effectuant 20 rotations circulaires chacune sur une série de papier de polissage (de haute qualité à basse qualité; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Fixez la fibre non dénudée à la table à l’aide de ruban adhésif et de fibre dépouillée, laissant 2 mm supplémentaires au-delà de la coordonnée ventrale (pour les implants LA, la longueur finale de la fibre est de ~10 mm). Utilisez un hémostatique pour tirer sur la virole et casser uniformément la fibre où elle a été marquée. Veillez à ne pas couper complètement la fibre lors du score, sinon le noyau de la fibre sera endommagé.
2. Construisez des câbles de raccordement compatibles avec les implants à fibre optique. Des câbles de raccordement conçus sur mesure ont été achetés (voir le tableau des matériaux). Alternativement, les câbles de raccordement peuvent être construits selon les protocoles⁹ précédemment publiés.
   REMARQUE: Le diamètre et le NA de la fibre de virole et de la fibre du câble de raccordement doivent correspondre à la jonction de couplage pour éviter une perte excessive de lumière, ce qui peut entraîner une incapacité à stimuler suffisamment l’activité neuronale.
3. Mesurez le rendement lumineux à travers le câble de raccordement et les implants de fibre optique en fixant le câble de raccordement / fibre optique à une source de lumière laser appropriée (473 nm, sortie de 1 mW) et en mesurant la sortie avec un capteur de lumière. Une fibre construite avec succès émettra un cercle concentrique de lumière et n’aura pas plus de 30% de perte de lumière.

2. Cathétérisme intraveineux des rongeurs, administration de virus et implantation de fibres optiques

1. Préparez l’animal à la chirurgie.
   1. Anesthésier complètement les rats avec l’anesthésique de votre choix en fonction des lignes directrices de l’établissement. Une option est le chlorhydrate de kétamine (87,5-100 mg/kg, i.m.) et le chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg, i.m.). Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié en vérifiant l’absence d’un réflexe de pincement des orteils.
      MISE EN GARDE : La kétamine est une substance contrôlée qui doit être manipulée conformément aux directives institutionnelles.
      NOTE: L’injection intramusculaire d’anesthésiques est utilisée dans cette étude car elle a produit une induction d’anesthésie plus rapide et plus fiable que l’injection intrapéritonéale. Surveillez continuellement la respiration et la réactivité du rat et fournissez un soutien thermique tout au long de la chirurgie.
   2. Rasez une grande partie du dos du rat (haut du dos juste au-dessus des omoplates jusqu’au milieu du dos) ainsi que la zone du cou sous le membre antérieur droit et le cuir chevelu.
   3. Placez le rat dans la zone chirurgicale et appliquez du puralube (larmes artificielles) sur les yeux. Injecter un volume de carprofène (analgésique) en poids corporel par voie sous-cutanée (s.c.) à travers la peau du haut du dos, puis injecter 5 mL de solution de Lactated Ringer s.c. à travers la peau du bas du dos.
   4. Désinfectez tous les sites chirurgicaux en mouillant un morceau de gaze stérile avec de la bétadine et en l’essuyant dans la zone chirurgicale rasée à l’aide d’un mouvement circulaire. Répétez ensuite le processus avec 70% d’éthanol. Répétez ce cycle alterné trois fois.
2. Effectuer l’implantation d’un cathéter intraveineux selon les protocoles précédemment publiés ^4,10.
   REMARQUE: Un champ chirurgical n’est pas utilisé pendant cette chirurgie pour éviter l’irritation pendant l’implantation du cathéter. Stériliser tous les instruments et équipements avant utilisation. Utilisez des gants stériles et changez les gants si une surface non stérile est en contact.
3. Immédiatement après l’implantation du cathéter, fixez le rat dans un cadre stéréotaxique pour effectuer des injections d’AAV.
   1. Administrer une injection sous-cutanée (s.c) de lidocaïne à 2 % (0,2-0,3 mL) au cuir chevelu comme anesthésique local.
      REMARQUE : L’anesthésique local n’est pas utilisé pendant l’implantation du cathéter intraveineux pour éviter toute altération des résultats chirurgicaux.
   2. Connecter une canule d’injection en acier inoxydable de calibre 26 à une seringue Hamilton remplie de 1 μL de solution concentrée d’AAV : AAV5-hSyn-tdTomato ou AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomate
      NOTE: oChIEF est une variante de l’opsine channelrhodopsin sensible à la lumière bleue (ChR2), qui peut répondre à une large gamme de fréquences ^8,11, et a donc une utilité pour les expériences LTD basse fréquence discutées dans ce protocole, mais aussi pour les expériences LTP à haute fréquence (non discutées ici). La construction oChIEF a été donnée par le Dr Roger Tsien et traitée pour l’emballage et la purification par le Duke Viral Vector Core. Au moins 3-4 semaines sont nécessaires entre le jour de l’injection et le jour de l’induction de la LTD pour permettre une expression optimale du virus dans les terminaux axoniques MGN.
      MISE EN GARDE : En général, l’AAV est considéré comme un organisme de niveau de biosécurité 1 (BSL-1), avec un faible risque d’auto-infection à moins qu’un virus auxiliaire ne soit utilisé dans sa production. Son utilisation nécessite l’approbation de l’IACUC et l’EPI approprié doit être utilisé en tout temps conformément aux directives institutionnelles pour limiter l’exposition inutile.
   3. À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 0,5 mm de l’avant vers l’arrière du crâne et retirez le tissu sus-jacent pour exposer la surface du crâne.
   4. Nivelez la tête du rat dans l’axe antérieur/postérieur et zéro coordonnée stéréotaxique au bregma.
   5. Percez trois petits trous dans le crâne à l’aide d’un outil Dremel équipé d’un petit foret. Utilisez un tournevis pour fixer fermement les vis en acier inoxydable (M2x4 965-A2) en place.
      REMARQUE: Les vis sont nécessaires pour une bonne fixation du ciment dentaire et la création de casques robustes et durables. La position des vis doit être répartie sur l’axe antéro-postérieur du crâne et loin du site d’injection AAV.
   6. Forer des trous bilatéraux pour l’injection d’AAV en fonction des coordonnées de l’Atlas du cerveau des rats (Watson et Paxinos)¹² pour la partie médiale du noyau géniculé médian (MGN); en mm de bregma, AP: -5,4; ML : ±3,0; DV : -6,6. Abaisser lentement les canules d’injection (4 mm/min) jusqu’à ce qu’elles soient positionnées dans le MGN. Injecter une solution concentrée d’AAV à raison de 0,1 μL/min.
   7. Laissez la canule d’injection en place pendant 5 minutes après la fin des perfusions pour permettre la diffusion loin de la canule, puis retirez lentement la canule du cerveau.
4. Immédiatement après les injections de virus, continuer à implanter des fibres optiques ^4,9 ciblant les terminaux MGN-LA.
   1. Utiliser un outil Dremel pour percer des trous bilatéraux pour les implants de fibres optiques ciblant l’amygdale latérale (en mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Utilisez des pinces pour saisir la virole de l’implant de fibre optique et la fixer aux adaptateurs stéréotaxiques afin qu’ils soient solidement maintenus en place.
   3. Abaissez lentement les fibres à un taux de 2 mm / min, jusqu’à ce que l’extrémité de la fibre se trouve dans la partie dorsale du LA (DV: -7,9 mm).
   4. Fixez d’abord les viroles au crâne à l’aide d’une fine couche d’adhésif instantané Loctite, suivie de ciment dentaire et couvrez les viroles avec des manchons de virole de 1,25 mm de diamètre et des couvercles anti-poussière.
      REMARQUE : Le choix de l’adhésif pour fixer les viroles au crâne doit être approuvé par le comité local ou institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. La loctite est utilisée pour cette étude afin de fixer de manière fiable les viroles au crâne après essais et erreurs avec plusieurs adhésifs; Cependant, les alternatives disponibles peuvent être envisagées.
5. Après les interventions chirurgicales, logez les rats individuellement et offrez un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Fournir des soins postopératoires conformes aux lignes directrices de l’établissement. Rincer quotidiennement les cathéters avec une solution saline contenant de la gentamicine (5 mg/mL) et de l’héparine (30 USP/mL) pour maintenir la perméabilité. Au moins 5 jours après la chirurgie et 24 heures avant le début des expériences comportementales, la nourriture limite les rats à ~90% de leur poids libre.

3. Auto-administration de cocaïne chez les rongeurs et extinction du levier instrumental

REMARQUE: Toutes les procédures comportementales sont effectuées dans des chambres de conditionnement opérationnelles standard, équipées de deux leviers rétractables sur un mur, d’une lumière de stimulus au-dessus de chaque levier, d’un générateur de tonalité, d’une lumière domestique et d’une pompe à perfusion.

1. Soumettre les rats à des séances quotidiennes d’auto-administration de cocaïne de 1 h (2 mg/mL) dans le cadre d’un programme de renforcement FR1.
   1. Placez les rats dans la chambre d’opération chaque jour et permettez aux rats d’appuyer sur un levier. Une pression sur le « levier actif » désigné (contrebalancé entre les leviers gauche et droit) donne une perfusion de cocaïne (1,0 mg / kg / perfusion) et une présentation de 10 s d’un signal composé de lumière et de tonalité. Une pression sur le « levier inactif » désigné n’a pas d’effets programmés.
   2. Poursuivre les expériences d’auto-administration pendant au moins 10 jours et jusqu’à ce que les rats réussissent à obtenir au moins 8 perfusions par jour pendant 3 jours consécutifs. Le non-respect des critères d’acquisition au jour 20 entraîne l’exclusion de l’étude.
2. Une fois les critères d’acquisition remplis avec succès, soumettre les rats à des séances d’extinction instrumentale de 1 h pendant 6 à 10 jours.
   1. Placez les rats dans des chambres opérantes et permettez aux rats d’appuyer librement sur levier. Cependant, les réponses sur les leviers actifs et inactifs n’ont pas de conséquences programmées.
   2. Demandez aux rats de poursuivre l’extinction instrumentale quotidiennement jusqu’à ce qu’une moyenne de < 25 pressions à levier sur deux jours consécutifs se produise.

4. Induction optogénétique in vivo de la LTD

NOTE: Les expériences d’inhibition optogénétique ont lieu 24 heures après le dernier jour de l’extinction instrumentale.

1. Connectez les cordons de raccordement à une diode laser bleue de 473 nm via un joint rotatif suspendu au-dessus d’une cage de logement de rongeurs standard propre avec le couvercle retiré. Cette configuration permet aux rongeurs de se déplacer librement autour de la cage pendant la stimulation optogénétique.
2. Allumez la diode laser conformément aux instructions d’utilisation et connectez-la à un générateur d’impulsions. Ajustez les paramètres de sorte que, lorsqu’il est allumé, le rat reçoive 900 impulsions lumineuses de 2 ms à 1 Hz.
   ATTENTION : Une protection oculaire adéquate doit être utilisée en tout temps pendant l’utilisation du laser.
3. Mesurez l’intensité lumineuse à travers le cordon de raccordement à l’aide d’un capteur de lumière. Ajustez l’intensité du laser de sorte que le flux lumineux à travers le câble de raccordement soit de ~5-7 mW.
4. Placez les rats dans une cage de logement propre. Enlevez les couvercles anti-poussière et les manchons de virole, exposant ainsi les viroles. Connectez les cordons de raccordement bilatéralement aux implants de fibre optique. Laissez les rats explorer l’environnement pendant 3 minutes avant l’induction de la DLT.
5. Allumez le générateur d’impulsions pour initier une stimulation optogénétique.
   NOTE: Bien que peu probable, si le rat éprouve des réactions indésirables à la stimulation, l’expérience est immédiatement terminée et les rats sont correctement euthanasiés selon les directives de l’établissement.
6. Après l’induction de l’ILD, gardez les rats dans la cage pendant 3 minutes, puis remettez-les dans leur cage à la maison.
7. Pour les expériences de contrôle, utiliser la même procédure de stimulation sur les rats qui expriment le virus de contrôle de la tomate AAV5-td. Pour les expériences fictives, attachez un cordon de raccordement à la fibre optique des rats qui expriment le virus AAV5-oChIEF, mais aucune stimulation n’est délivrée pendant une séance de 15 minutes.

5. Tester l’effet de la stimulation optogénétique sur la recherche de cocaïne induite par les signaux

1. 24 h après les stimulations optogénétiques in vivo, replacer les rats dans des chambres de conditionnement opérationnelles. Les rats sont soumis à une séance de réintégration standard de 1 heure induite par des signaux pour évaluer le comportement de recherche de cocaïne.
   REMARQUE : Lors de la réintégration induite par un signal, une réponse sur le levier actif donne une présentation de 10 s du signal associé à la cocaïne, mais pas de perfusions de cocaïne.
2. Effectuer un deuxième test de réintégration au moins 1 semaine après le premier test pour déterminer si l’induction optogénétique de la LTD entraîne une suppression à long terme de la recherche de cocaïne.

6. Coloration, fluorescence et imagerie pour la vérification histologique de l’expression virale et le placement des fibres optiques

1. Faire 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4% de paraformaldéhyde (PFA). Conservez les deux solutions sur de la glace. Le volume total dépendra du nombre de rats participant à l’étude (~100 mL de PBS et 200 mL de PFA seront utilisés par rat).
   ATTENTION : Le PFA est un produit chimique toxique et cancérogène connu. Prenez soin d’éviter l’inhalation ainsi que le contact avec la peau. Son utilisation et son élimination doivent être conformes aux directives institutionnelles, y compris l’utilisation d’EPI appropriés et d’une hotte chimique.
2. Installer la pompe péristaltique à un débit de 20 mL/min. Remplissage du tube de la pompe avec 1x PBS. Fixez une aiguille émoussée de calibre 20 à l’extrémité du tube.
3. Anesthésier profondément les rats avec du pentobarbital sodique (100 mg/kg, i.p.). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils avant de continuer.
   NOTE: Le pentobarbital sodique est utilisé puisque la perfusion est une procédure terminale.
4. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale du rat sous le diaphragme. Coupez à travers la cage thoracique rostralement le long des bords latéraux pour exposer le cœur du rat. Utilisez un hémostatique pour serrer la partie rostrale de la cage thoracique loin du cœur. Coupez tout tissu adipeux sus-jacent qui entoure le cœur.
5. Insérez l’aiguille émoussée dans le ventricule gauche et dans l’aorte. Percez un petit trou dans l’oreillette droite pour drainer la solution lorsqu’elle retourne au cœur.
6. Perfuser chaque rat avec 1x PBS pendant 5 min suivi de 4% PFA, pH 7,4 pendant 10 min.
7. Décapitater le rat, extraire le cerveau et le postfixer dans 4% PFA pendant 24 heures. Ensuite, transférez le cerveau à 30% de solution de saccharose pendant 2-3 jours.
8. Cerveau de coupe à 50 μm à l’aide d’un cryostat.
9. Montez toutes les tranches contenant le LA ou le MGN sur des lames de verre et un couvercle.
10. Découpes d’images à l’aide d’un microscope épifluorescent pour vérifier l’expression de la tomate AAV-oChIEF-tdTomate dans le MGN et ses projections à l’AL, ainsi que le placement de la fibre optique au-dessus du LA.

7. Perfusion et préparation aiguë des tranches cérébrales pour les expériences d’électrophysiologie

NOTE: Des expériences électrophysiologiques sont effectuées sur un sous-ensemble d’animaux pour valider le succès de la DLT in vivo .

1. Préparer des solutions électrophysiologiques à l’aide des réactifs énumérés dans les tableaux 1 à 3 ^4,13. Ajuster le pH de toutes les solutions à 7,4 avec HCl et ajuster l’osmolarité à 300-310 mOsm/kg_H2O. Préparer des solutions fraîches avant les expériences et conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Saturer toutes les solutions avec du carbogène (95% O 2/5% CO₂) à tout moment pendant l’utilisation.
2. En utilisant de l’isoflurane conformément aux directives locales ou institutionnelles sur les soins et l’utilisation des animaux, anesthésiez profondément le rat dans une chambre d’euthanasie fermée.  Confirmer que l’animal est complètement anesthésié par le réflexe de pincement des orteils.
3. Remplissez un petit bécher avec 50 ml de solution de coupe glacée. Remplir le tube de la pompe péristaltique avec une solution et ajuster le débit à 20 mL/min. Fixez une aiguille émoussée de calibre 20 à l’extrémité du tube.
4. Ouvrez la cavité abdominale (voir étapes 6.4 et 6.5) et perfuser brièvement le rat avec une solution de coupe (maximum 1-2 min).
5. Après perfusion, décapiter immédiatement le rat. Retirez la cervelle et placez-la dans un petit bécher rempli de solution de coupe à 4 °C pendant 30 s-1 min.
6. Transférez les cerveaux avec une spatule et fixez-les rapidement dans la chambre d’un vibratome. Retirez l’épaulard à l’aide d’une pince fine. Remplir la chambre avec une solution de coupe à 4 °C et préparer des tranches coronales aiguës (250 μm d’épaisseur) de l’amygdale à une vitesse de 0,37 mm/sec et une fréquence de 70 Hz.
7. Au fur et à mesure de l’obtention des tranches, placer chacune d’elles dans une chambre de rétention remplie de solution de coupe et incuber à 37 °C pendant 10-12 min. Environ 5 à 7 tranches contenant le LA peuvent être obtenues par animal.
8. Transférer les tranches dans un bécher de solution de maintien à température ambiante (RT) et laisser récupérer pendant >30 minutes avant l’expérimentation.
   REMARQUE: Les tranches restent généralement saines lorsqu’elles sont conservées dans une solution de rétention pendant 4 à 6 heures. En raison de la nature fluorescente de l’AAV, les tranches sont conservées dans des conditions de faible luminosité.

8. Enregistrements électrophysiologiques ex vivo

1. Préparer des solutions intracellulaires à l’aide des réactifs énumérés dans les tableaux 4 et 5.
   NOTE: Les solutions intracellulaires doivent être fabriquées avant les expériences et peuvent être stockées à long terme (3-12 mois) à -80 ° C ou à court terme (1-2 mois) à -20 ° C. Le pH des solutions est ajusté à 7,3 (avec CsOH pour la solution intracellulaire à base de Cs et avec KOH pour la solution intracellulaire à base de K). Ajuster à une osmolarité finale de 290-300 mOsm/kg_H2O.
2. Préparer une solution mère de picrotoxine de 500 mM dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
   NOTE: Les stocks de picrotoxines sont aliquotes et stockés à -20 °C. Le jour de l’utilisation, les aliquotes sont décongelées et ajoutées à la solution d’enregistrement jusqu’à une concentration finale de 100 μM.
   ATTENTION: La picrotoxine est un antagoniste non compétitif des récepteurs GABA_A , de sorte que l’infusion de picrotoxine a un effet stimulant. Il est gravement toxique par ingestion orale ou absorption cutanée. Un EPI approprié doit être utilisé en tout temps lorsque vous travaillez avec de la picrotoxine.
3. Transférer les tranches dans un microscope droit conçu pour les expériences d’électrophysiologie.
4. Pendant les expériences, baigner en continu les tranches perfusées avec une solution d’enregistrement chauffée à 31-33 °C.
5. Agrandissez le LA à l’aide d’un objectif 4x. Identifier les principaux neurones par morphologie avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x.
6. Utilisez une pipette en verre (3-5 MΩ) remplie d’une solution intracellulaire à base de Cs (pour les expériences de pince de tension) ou d’une solution intracellulaire à base de K (pour les expériences de pince courantes) pour obtenir des enregistrements de pince patch à cellules entières.
7. Identifier les projections axonales MGN infectées par AAV sous fluorescence (à l’aide d’un filtre RFP). Stimuler les projections à l’aide d’un laser DPSS à lumière bleue (473 nm) connecté à un générateur d’impulsions.
   ATTENTION : Pour limiter l’exposition au laser, la lumière laser collimatée est couplée à un port fluorescent sur le microscope et focalisée sur la tranche à travers l’objectif.
   REMARQUE: En mode de serrage de tension, les courants postsynaptiques excitateurs (EPSC) sont évoqués optiquement à 0,1 Hz. Les neurones recevant des entrées de neurones MGN infectés par AAV présenteront des EPSC fiables.
8. Pour induire une LTD ex vivo , en mode de pince courante, enregistrer une ligne de base stable des potentiels postsynaptiques excitateurs (EPSP) pendant au moins 10 minutes. Ensuite, délivrez 900 impulsions de 2 ms de lumière de 473 nm à une fréquence de 1 Hz (temps total = 15 min). Ensuite, enregistrez en continu les EPSP à 0,1 Hz pendant ≥60 min.

Résultats

Une chronologie décrivant l’ordre des expériences est présentée à la figure 1. Tout au long des expériences comportementales, le nombre de perfusions de cocaïne ainsi que le nombre de réponses apportées sur le levier actif servent de mesure de l’intensité du comportement de recherche de cocaïne. Au cours des premiers jours de l’auto-administration de cocaïne, le nombre de réponses actives devrait augmenter progressivement au cours de chaque jour d’acquisition, avant de se stabiliser au cours...

Discussion

Comme décrit ci-dessus, plusieurs étapes critiques sont importantes pour obtenir les résultats expérimentaux appropriés. Le protocole ne sera probablement efficace que chez les animaux qui acquièrent correctement l’auto-administration de cocaïne et, à ce jour, il n’a été testé qu’à l’aide des paramètres décrits ci-dessus. Il est possible que la dose de cocaïne, le calendrier de renforcement et les paramètres de signal puissent être modifiés avec probablement peu d’effet sur les résultats comportementaux, à l’exception du...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,9 % Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	Voir Lin et al., 2009 ; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		Voir Lin et al., 2009 ; Nabavi et al., 2014
Larmes artificielles (pommade ophtalmique)	Covetrus	70349
ATP Sel de magnésium	Fisher Scientific	A9187
Bétadine	Butler Schein	38250
Chlorure de calcium	Fisher Scientific	C1016
Chlorure de césium	Fisher Scientific	289329
Césium hydroxyde	Fisher Scientific	516988
Méthanesulfonate de césium	Fisher Scientific	C1426
Cocaïne HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Régulateur de température à double canal	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Éthanol	Université de Pittsburgh Chimie Stockroom	200C5000
Capuchons anti-poussière de virole	Thor Labs	CAPL	Capuchons anti-poussière en plastique blanc pour embouts de 1,25 mm
Manchons d’accouplement de virole Objectifs	Doric	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Embouts	en fibre de précision	MM-FER2007C-2300	Ø ; Virole multimode LC/PC en céramique de 1,25 mm, et Oslash ; 230 &mu ; m taille du trou
Fibre optique	Thor Labs	FP200URT	200 &mu ; Fibre multimode à noyau m (0,5 NA)
Joint rotatif à fibre optique	Prizmatix	(Commandé sur Amazon)	Diamètre de 18 mm, connecteur FC-FC pour
outil de dénudage de fibre	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield avec DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicine	Henry Schein	6913
GTP Sel de sodium	Fisher Scientific	G8877
Seringue Hamilton		80085	10 &mu ; L volume, calibre 26, 2 pouces, point style 3
Pistolet thermique	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 ° ; F
fibres de précision	époxy durcissables à la chaleur	PFP-353ND-8OZ
Héparine	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
Kétamine HCl	Henry Schein	55853	La kétamine est une substance contrôlée et doit être manipulée conformément aux directives de l’établissement
s	Henry Schein	9846
Laser, pilote et coupleur laser-fibre	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, laser à semi-conducteurs pompé par diode (une option)
L-glutathion	Fisher Scientific	G4251
Lidocaïne	Butler Schein	14583
Capteur de lumière	Thor Labs	PM100D	Console compacte de compteur d’énergie avec affichage numérique
Loctite adhésif instantané	Grainger	5E207
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	203726
Amplificateur à microélectrodes/Acquisition de données	Dispositifs moléculaires	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Pompe à micro-injecteurs	Harvard Apparatus	70-4501	Seringue double
Micromanipulateur	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscope	Olympus	BX51WI	Microscope droit pour l’électrophysiologie
Microscope	Olympus	BX61VS	Microscope épifluorescent à balayage de lames
N-méthyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet ciment dentaire, liquide	Lang Dental	1504BLK	noir
Orthojet ciment dentaire, poudre	Lang Dental	1530BLK	Poudre contemporaine, noir
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148
Câbles de raccordement	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Tube
Picrotoxine	Fisher Scientific	AC131210010
Disque de polissage	Thor Labs	D50FC
Tampon de polissage	Thor Labs	NRS913	9 » x 13 »
Papier de polissage	Thor Labs	LFG5P	5 &mu ; m grit
Papier de polissage	Thor Labs	LFG3P	3 &mu ; m grit
Papier de polissage	Thor Labs	LFG1P	1 &mu ; m grit
Papier de polissage	Thor Labs	LFG03P	0.3 &mu ; Chlorure
potassium	Sigma-Aldrich	P9333
Hydroxyde de potassium	Fisher Scientific	P5958
Méthanesulfonate de potassium	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofène)	Henry Schein	24751
Auto-administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S7653
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	1064980500
L-Ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	A7631
Pentobarbital de sodium	Henry Schein	24352
Phosphate de sodium	Sigma-Aldrich	S9638
Phosphocréatine de sodium	Fisher Scientific	P7936
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P2256
Vis à métaux en acier inoxydable	WW Grainger	; 6GB25	M2-0.40mm Vis à métaux, casserole, Phillips, A2 Acier inoxydable, Ordinaire, 3 mm de longueur
Adaptateur stéréotaxique pour embouts	Thor Labs	XCL
Cadre stéréotaxique	Stoelting	51603
Saccharose	Sigma-Aldrich	S8501
Fil de suture	Outils de science fine	18020-50	Fil de soie ; Taille : 5/0, Diamètre : 0,12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Tissue Adhesive	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198