Pour obtenir un insecte axenique, sa surface d’œuf est stérilisée et la larve éclose est ensuite élevée à l’aide de feuilles axeniques. Cette méthode fournit un moyen efficace pour la préparation d’insectes axeniques sans administrer d’antibiotiques ou développer un régime artificiel, qui peut également être appliqué à d’autres insectes mangeurs de feuilles.
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Article de méthode
Préparation et élevage d’insectes axeniques avec des semis de culture tissulaire pour les études d’interaction entre le microbiote hôte et intestinal du coléoptère
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les intestins des insectes sont colonisés par diverses bactéries qui peuvent avoir un impact profond sur les traits physiologiques de l’hôte. L’introduction d’une souche bactérienne particulière dans un insecte axenique est une méthode puissante pour vérifier la fonction microbienne intestinale et élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions intestin microbe-hôte. L’administration d’antibiotiques ou la stérilisation des surfaces des œufs sont deux méthodes couramment utilisées pour éliminer les bactéries intestinales des insectes. Cependant, en plus des effets indésirables potentiels des antibiotiques sur les insectes, des études antérieures ont indiqué que l’alimentation en antibiotiques ne pouvait pas éliminer les bactéries intestinales. Ainsi, les régimes artificiels sans germes sont généralement utilisés pour maintenir les insectes axeniques, ce qui est un processus fastidieux et laborieux qui ne peut pas ressembler pleinement aux composants nutritionnels des aliments naturels. Décrit ici est un protocole efficace et simple pour préparer et maintenir les larves axeniques d’un coléoptère (Plagiodera versicolora). Plus précisément, les surfaces des œufs de coléoptères ont été stérilisées, après quoi des feuilles de peuplier exemptes de germes ont été utilisées pour élever des larves d’axenique. Le statut axenique des insectes a ensuite été confirmé par des essais dépendants de la culture et indépendants de la culture. Collectivement, en combinant la désinfection des œufs et la culture sans germes, une méthode efficace et pratique a été développée pour obtenir P. versicolora axenique, fournissant un outil facilement transférable pour d’autres insectes mangeurs de feuilles.
Introduction
Semblable aux mammifères, le tube digestif des insectes est une cavité pour la digestion et l’absorption des aliments. La plupart des insectes abritent diverses bactéries commensales qui se développent dans leurs intestins et vivent de la nutrition fournie par les hôtes1. La communauté commensale intestinale a un impact profond sur de multiples processus physiologiques chez les insectes, y compris la digestion et la désintoxication des aliments 2,3,4, la nutrition et le développement 5,6,7, la ....
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Protocole
1. Élevage d’insectes
- Maintenir la population de P. versicolora dans une chambre de croissance à l’état de 27 °C et 70 ± 5 % d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité. Placez-les dans des boîtes en plastique perforées avec du papier absorbant humide carrelé et nourrissez-les de branches de peuplier frais. Vaporisez de l’eau propre sur du papier absorbant pour maintenir l’humidité et changez les branches tous les deux jours.
- Isoler les adultes pour la ponte après la nymphose. Nourrissez-les de feuilles tendres pour obtenir plus d’œufs.
- Recueillir les œufs nouvellement pondus (dan....
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Résultats
Les étapes de la vie de P. versicolora sont illustrées à la figure 1. Le mâle adulte est plus petit que la femelle adulte (figure 1A). Dans le champ, le coléoptère regroupe ses œufs sur une feuille; ici, quatre œufs ont été détachés d’une feuille (figure 1B). Les segments de tiges de peuplier et les semis utilisés pour l’élevage d’insectes hacheniques sont illustrés à la figure 2. L’intestin d’.......
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Discussion
La préparation de larves exemptes de germes et l’obtention de larves gnotobiotiques en réintroduisant des souches bactériennes spécifiques sont des méthodes puissantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions hôte-microbe. Les larves nouvellement écloses obtiennent le microbiote intestinal de deux manières principales: la transmission verticale de la mère à la progéniture ou l’acquisition horizontale par les frères et sœurs et l’environnement34. Le premier peut être rempli par tr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par la National Natural Science Foundation of China (31971663) et le Young Elite Scientists Sponsorship Program de CAST (2020QNRC001).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL de | de NAA a. Préparez une solution mère de NAOH à 0,1 M (dissoudre 0,8 g de NaOH dans 200 ml d’eau distillée). b. Ajoutez 0,2 g de NAA dans un bécher de 250 ml, ajoutez un peu de solution de NaOH à 0,1 M jusqu’à ce que le NAA soit dissous et ajustez le volume final à 200 mL avec de l’eau distillée. c. Filtrez la solution pour éliminer les bactéries avec un contenant de 0,22 µ ; Un filtre à seringue et une seringue stérile de 50 mL sous-conditionnent la solution dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et la restaurent à -20 °C. | ||
| Tubes microcentrifuges de 1,5 mL | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x solution mère PBS | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissoudre 22,44 g de KOH (poids moléculaire : 56,1) dans 200 mL d’eau distillée et autoclaver pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Béchers de 250 mL et 2 000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Seringues stériles de 50 mL | Jinta | JT0125789 | |
| cylindre doseur de 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE solution | a. ; Dissoudre 242 g de Tris et 18,612 g d’EDTA dans 700 mL d’eau distillée. b. Ajuster le pH à 7,8 avec environ 57,1 mL d’acide acétique. c. Ajustez le volume final à 1 000 ml j. La solution mère a été diluée à 1x tampon TAE lors de l’utilisation. | ||
| 75 % d’éthanol | Xingheda trade | ||
| &alpha ;-naphtalène acide acétique (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Papier | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Acide acétique | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Homogénéisateur de battement de billes | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit d’extraction d’ADN | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Papier filtre | Jiaojie | Diamètre 70 mm | |
| Unité d’électrophorèse | sur gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green colorant d’acide nucléique | TsingKe | TSJ003 | |
| Semis de peuplier sans germes | Shan Xin peuplier de l’Université de Ludong dans la province du Shandong | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1× ;) | TsingKe | TSE101 | |
| Chambre de croissance | Ruihua | HP400GS-C | |
| gélosé LB | a. Dissoudre 5 g de tryptone, 5 g de NaCl, 2,5 g d’extrait de levure dans 300 mL d’eau distillée. b. Ajuster le volume final à 500 mL, transférer la solution dans une fiole conique de 1 000 mL et ajouter 7,5 g d’agar. c. Autoclaver le milieu pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Mini centrifugeuse | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS milieu basique | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS milieu solide pour la culture | a. Dissoudre 4,43 g de poudre de milieu basique MS et 30 g de saccharose dans 800 mL d’eau distillée. b. Ajuster le pH à environ 5,8 avec 2 M KOH à l’aide d’un pH-mètre. c. Ajuster le volume final à 1 000 mL, séparer en deux parties, transférer dans deux flacons coniques de 1 000 mL et ajouter 2,6 g de gélose par 500 mL j. Autoclave pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Spectrophotomètre NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pinceau | 1 cm de largeur, utilisé pour collecter les œufs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermocycleurs | Eppendorf | 6331000076 | |
| Boîtes de Pétri | Supin | 90 mm de diamètre | |
| pH-mètre | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 & micro ; L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1 000 & micro ; L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 & micro ; L | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 & micro ; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Récipient de culture de tissus végétaux | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Boîte | 2,35 L | ||
| Hydroxyde de potassium (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Amorces pour amplifier le gène bactérien de l’ARNr 16S | Sangon Biotech | 27-F : 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R : 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Hydroxyde de sodium (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Billes | 0,25 mm | utilisées pour broyer les tissus | |
| Stéréomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Saccharose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marqueur | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Base | Tris Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | ; LP0037 | |
| Transilluminateur UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| saule | Sha Lake Park, Wuhan, Chine | ||
| Chrysomèle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, Chine | ||
| Extrait de levure | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Références
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
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Réimpressions et autorisations
