Pour obtenir un insecte axenique, sa surface d’œuf est stérilisée et la larve éclose est ensuite élevée à l’aide de feuilles axeniques. Cette méthode fournit un moyen efficace pour la préparation d’insectes axeniques sans administrer d’antibiotiques ou développer un régime artificiel, qui peut également être appliqué à d’autres insectes mangeurs de feuilles.
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Article de méthode
Préparation et élevage d’insectes axeniques avec des semis de culture tissulaire pour les études d’interaction entre le microbiote hôte et intestinal du coléoptère
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les intestins des insectes sont colonisés par diverses bactéries qui peuvent avoir un impact profond sur les traits physiologiques de l’hôte. L’introduction d’une souche bactérienne particulière dans un insecte axenique est une méthode puissante pour vérifier la fonction microbienne intestinale et élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions intestin microbe-hôte. L’administration d’antibiotiques ou la stérilisation des surfaces des œufs sont deux méthodes couramment utilisées pour éliminer les bactéries intestinales des insectes. Cependant, en plus des effets indésirables potentiels des antibiotiques sur les insectes, des études antérieures ont indiqué que l’alimentation en antibiotiques ne pouvait pas éliminer les bactéries intestinales. Ainsi, les régimes artificiels sans germes sont généralement utilisés pour maintenir les insectes axeniques, ce qui est un processus fastidieux et laborieux qui ne peut pas ressembler pleinement aux composants nutritionnels des aliments naturels. Décrit ici est un protocole efficace et simple pour préparer et maintenir les larves axeniques d’un coléoptère (Plagiodera versicolora). Plus précisément, les surfaces des œufs de coléoptères ont été stérilisées, après quoi des feuilles de peuplier exemptes de germes ont été utilisées pour élever des larves d’axenique. Le statut axenique des insectes a ensuite été confirmé par des essais dépendants de la culture et indépendants de la culture. Collectivement, en combinant la désinfection des œufs et la culture sans germes, une méthode efficace et pratique a été développée pour obtenir P. versicolora axenique, fournissant un outil facilement transférable pour d’autres insectes mangeurs de feuilles.
Introduction
Semblable aux mammifères, le tube digestif des insectes est une cavité pour la digestion et l’absorption des aliments. La plupart des insectes abritent diverses bactéries commensales qui se développent dans leurs intestins et vivent de la nutrition fournie par les hôtes1. La communauté commensale intestinale a un impact profond sur de multiples processus physiologiques chez les insectes, y compris la digestion et la désintoxication des aliments 2,3,4, la nutrition et le développement 5,6,7, la défense contre les agents pathogènes et les parasites 8,9,10,11, la communication chimique12,13 et les comportements14 ,15. Curieusement, certains microbiotes intestinaux peuvent être facultativement pathogènes ou être manipulés par des agents pathogènes envahisseurs pour aggraver l’infection, ce qui indique que les bactéries intestinales peuvent être nocives dans certains cas 16,17,18. Les bactéries intestinales peuvent également servir de ressource microbienne pour les applications biotechniques et la lutte antiparasitaire. Par exemple, des bactéries digérant la lignocellulose provenant d’insectes phytophages et xylophages ont été utilisées pour digérer les cellules végétales afin de développer des biocarburants19. La dispersion de symbiotes intestinaux modifiés exprimant des molécules bioactives est une tactique nouvelle et prometteuse pour lutter contre les ravageurs agricoles et forestiers et les moustiques transmettant des maladies infectieuses 19,20,21, qui peut également être utilisée pour améliorer l’aptitude des insectes utiles 22. Illustrer comment une bactérie intestinale se comporte in vivo est donc considéré comme une priorité pour tirer pleinement parti de sa fonction et l’exploiter davantage pour diverses applications.
Les animaux peuvent abriter de 1 à > 1000 espèces microbiennes symbiotiques dans l’intestin1. En conséquence, il est difficile de vérifier avec précision comment les taxons bactériens individuels ou leur assemblage se comportent à l’intérieur d’un animal, et si l’hôte ou ses partenaires microbiens déterminent une fonction spécifique. Par conséquent, la préparation de larves axeniques pour obtenir des insectes gnotobiotiques par colonisation mono- ou multi-espèces est nécessaire pour étudier la fonction bactérienne et l’interaction avec les insectes23. À l’heure actuelle, l’administration de cocktails antibiotiques et la stérilisation de la surface des œufs d’insectes sont des méthodes courantes pour éliminer les bactéries intestinales 14,24,25,26. Cependant, les régimes antibiotiques ne peuvent pas éliminer complètement les bactéries intestinales et ont un effet négatif sur la physiologie de l’insecte hôte27,28. Par conséquent, l’utilisation d’insectes traités aux antibiotiques peut obscurcir les véritables capacités de certaines bactéries intestinales. Heureusement, la stérilisation de surface des œufs peut annuler ce problème23,29, qui n’a pas ou peu d’effets sur les insectes expérimentaux. En outre, les régimes artificiels ne peuvent pas ressembler pleinement aux aliments naturels pour insectes, et le développement d’un régime artificiel est un processus coûteux et laborieux30,31.
Le coléoptère du saule, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), est un ravageur répandu qui mange les feuilles et se nourrit principalement d’arbres saplicacés, tels que les saules (Salix) et le peuplier (Populus L.) 32,33. Ici, le dendroctone du saule a été utilisé comme insecte mangeur de feuilles représentatif pour développer un protocole de préparation et d’élevage d’un insecte sans germes. Nous avons exploité la culture de tissus végétaux pour obtenir des feuilles de peuplier exemptes de germes pour élever des larves de P. versicolora axenic à partir d’œufs stérilisés. Le statut axenique des larves de P. versicolora a été vérifié par des tests dépendants de la culture et indépendants de la culture. Ce protocole peut maintenir des insectes axeniques qui imitent mieux la condition sauvage que l’élevage d’insectes avec un régime artificiel. Plus important encore, cette méthode est pratique à un coût très faible, ce qui augmente la faisabilité de l’obtention d’insectes axeniques pour de futures études d’interaction insecte-intestin, en particulier pour les insectes non modèles sans régime artificiel bien développé.
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Protocole
1. Élevage d’insectes
- Maintenir la population de P. versicolora dans une chambre de croissance à l’état de 27 °C et 70 ± 5 % d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité. Placez-les dans des boîtes en plastique perforées avec du papier absorbant humide carrelé et nourrissez-les de branches de peuplier frais. Vaporisez de l’eau propre sur du papier absorbant pour maintenir l’humidité et changez les branches tous les deux jours.
- Isoler les adultes pour la ponte après la nymphose. Nourrissez-les de feuilles tendres pour obtenir plus d’œufs.
- Recueillir les œufs nouvellement pondus (dans les 24 heures). Placez les œufs sur du papier absorbant humide pendant 60 h pour préparer les larves d’axenique.
REMARQUE: Les œufs nouvellement pondus éclosent après environ 72 h. Le meilleur moment pour stériliser les surfaces des œufs est la veille de l’éclosion; sinon, le nombre d’œufs éclos avec succès diminuera.
2. Culture de peupliers sans germes
- Préparer des solutions mères de Murashige et de Skoog (MS) et de 1 mg/mL d’acide acétique α-naphtalène (NAA) (voir la Table des matériaux).
- Dans une hotte de biosécurité, ajouter 50 μL de solution mère NAA de 1 mg/mL à 500 mL de milieu MS, agiter pour bien mélanger et verser environ 50 mL par récipient de culture tissulaire et attendre la solidification.
- Préparez des scalpels, une lampe à alcool et une pince; stériliser les scalpels et les pinces dans la flamme de la lampe à alcool dans la hotte de biosécurité.
- Couper des segments de tige de 3 à 4 cm avec des bourgeons apicaux ou des bourgeons latéraux de plants de peuplier à environ 1 mois de croissance (semis de culture tissulaire sans germes) et les insérer dans le milieu de culture, un ou deux segments de tige par récipient.
- Incuber ces segments de tige dans une chambre de croissance à 25 °C et 50 ± intensité lumineuse de 10 cd avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant environ 30 jours. Utilisez les feuilles exemptes de germes pour nourrir les larves axeniques.
3. Stérilisation à la surface des œufs et élevage des larves axeniques
- Boîtes de Petri autoclaves, pinceaux, papier filtre, eau distillée et une boîte de Petri contenant du support de gélose LB (Luria-Bertani).
- Placez les feuilles avec des œufs adhérents dans une boîte de Pétri, retirez soigneusement les œufs des feuilles à l’aide d’une pince et transférez-les dans une autre boîte de Pétri.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée très soigneusement car les œufs adhèrent aux feuilles. - Lavez ces œufs avec de l’éthanol à 75% pendant 8 min et répétez le lavage quatre fois avec de l’eau stérile.
- Transférer les œufs sur un milieu de gélose LB pour préserver l’humidité pour l’éclosion.
REMARQUE: L’utilisation d’un milieu de gélose LB peut aider à vérifier si l’œuf désinfecté est exempt de germes. - Placez la boîte de Pétri dans une chambre de croissance et attendez que les œufs éclosent dans les 24 heures.
- Dans une hotte de biosécurité, carreler trois morceaux de papier filtre humide dans une boîte de Pétri, placer des feuilles de peuplier sans germes sur le papier, recueillir les larves et les placer sur les feuilles, sceller la boîte de Pétri avec un parafilm et les incuber dans une chambre de croissance à 27 °C et 70 ± 5% d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
REMARQUE: Les feuilles cultivées en tissu sont délicates et peuvent perdre de l’eau rapidement. Ainsi, l’utilisation de papier filtre humide est nécessaire lors du transfert des feuilles dans la boîte de Pétri. - Changez les feuilles tous les deux jours.
- Pour les groupes élevés de manière conventionnelle, transférez les œufs des feuilles dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide et nourrissez ces larves avec des feuilles de peuplier exemptes de germes.
4. Vérification des larves d’axenique avec des tests dépendants de la culture
- Sélectionnez au hasard trois larvesde 1 ème, 2e et 3e stade parmi les groupes exempts de germes et élevés de manière conventionnelle.
- Disséquez les larves du3ème stade avec des ciseaux et des pinces stériles sous un stéréomicroscope et collectez leurs intestins dans des tubes de microcentrifugation. Recueillir intactesles larves du 1er et du 2 e stade dansdes tubes.
REMARQUE: Recueillir les larves entières du1er et du 2e stade car elles sont trop petites pour être disséquées et garder leurs intestins intacts. - Ajouter 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate et trois billes d’acier dans des tubes de 1,5 mL et broyer les tissus en homogénats à l’aide d’un homogénéisateur battant les billes.
- Ajouter 100 μL de l’homogénat au milieu de la gélose LB et plaquer à l’aide d’une tige d’étalement en verre stérile.
- Placez les plaques à 37 °C pendant 24 h et observez les colonies bactériennes.
5. Vérification des individus axeniques avec des tests indépendants de la culture
- Extraire l’ADN total des tissus (obtenu à la section 4) à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN.
- Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm.
- Amplifier le gène de l’ARNr 16S bactérien à l’aide d’amorces universelles d’ARNr 16S avec PCR. Configurez le système de réaction avec 18 μL de 1,1x mélange maître PCR (voir la table des matériaux), 0,5 μL d’amorce 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL d’amorce 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') et 100 ng d’ADN modèle. Réglez les conditions de PCR à 95 °C pendant 3 min; 28 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min; suivi de 72 °C pendant 10 min. Conserver les produits PCR à 4 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
- Mélangez les produits PCR avec un colorant d’acide nucléique et analysez-les par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1% dans 1x tampon TAE. Utilisez 10 μL d’un marqueur d’ADN comme référence.
- Observez le gel avec un transilluminateur UV et recherchez le fragment cible autour de 1 500 bp.
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Résultats
Les étapes de la vie de P. versicolora sont illustrées à la figure 1. Le mâle adulte est plus petit que la femelle adulte (figure 1A). Dans le champ, le coléoptère regroupe ses œufs sur une feuille; ici, quatre œufs ont été détachés d’une feuille (figure 1B). Les segments de tiges de peuplier et les semis utilisés pour l’élevage d’insectes hacheniques sont illustrés à la figure 2. L’intestin d’...
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Discussion
La préparation de larves exemptes de germes et l’obtention de larves gnotobiotiques en réintroduisant des souches bactériennes spécifiques sont des méthodes puissantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions hôte-microbe. Les larves nouvellement écloses obtiennent le microbiote intestinal de deux manières principales: la transmission verticale de la mère à la progéniture ou l’acquisition horizontale par les frères et sœurs et l’environnement34. Le premier peut être rempli par tr...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par la National Natural Science Foundation of China (31971663) et le Young Elite Scientists Sponsorship Program de CAST (2020QNRC001).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL de | de NAA a. Préparez une solution mère de NAOH à 0,1 M (dissoudre 0,8 g de NaOH dans 200 ml d’eau distillée). b. Ajoutez 0,2 g de NAA dans un bécher de 250 ml, ajoutez un peu de solution de NaOH à 0,1 M jusqu’à ce que le NAA soit dissous et ajustez le volume final à 200 mL avec de l’eau distillée. c. Filtrez la solution pour éliminer les bactéries avec un contenant de 0,22 µ ; Un filtre à seringue et une seringue stérile de 50 mL sous-conditionnent la solution dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et la restaurent à -20 °C. | ||
| Tubes microcentrifuges de 1,5 mL | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x solution mère PBS | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissoudre 22,44 g de KOH (poids moléculaire : 56,1) dans 200 mL d’eau distillée et autoclaver pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Béchers de 250 mL et 2 000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Seringues stériles de 50 mL | Jinta | JT0125789 | |
| cylindre doseur de 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE solution | a. ; Dissoudre 242 g de Tris et 18,612 g d’EDTA dans 700 mL d’eau distillée. b. Ajuster le pH à 7,8 avec environ 57,1 mL d’acide acétique. c. Ajustez le volume final à 1 000 ml j. La solution mère a été diluée à 1x tampon TAE lors de l’utilisation. | ||
| 75 % d’éthanol | Xingheda trade | ||
| &alpha ;-naphtalène acide acétique (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Papier | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Acide acétique | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Homogénéisateur de battement de billes | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit d’extraction d’ADN | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Papier filtre | Jiaojie | Diamètre 70 mm | |
| Unité d’électrophorèse | sur gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green colorant d’acide nucléique | TsingKe | TSJ003 | |
| Semis de peuplier sans germes | Shan Xin peuplier de l’Université de Ludong dans la province du Shandong | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1× ;) | TsingKe | TSE101 | |
| Chambre de croissance | Ruihua | HP400GS-C | |
| gélosé LB | a. Dissoudre 5 g de tryptone, 5 g de NaCl, 2,5 g d’extrait de levure dans 300 mL d’eau distillée. b. Ajuster le volume final à 500 mL, transférer la solution dans une fiole conique de 1 000 mL et ajouter 7,5 g d’agar. c. Autoclaver le milieu pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Mini centrifugeuse | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS milieu basique | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS milieu solide pour la culture | a. Dissoudre 4,43 g de poudre de milieu basique MS et 30 g de saccharose dans 800 mL d’eau distillée. b. Ajuster le pH à environ 5,8 avec 2 M KOH à l’aide d’un pH-mètre. c. Ajuster le volume final à 1 000 mL, séparer en deux parties, transférer dans deux flacons coniques de 1 000 mL et ajouter 2,6 g de gélose par 500 mL j. Autoclave pendant 20 min à 121 ° ;C. | ||
| Spectrophotomètre NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pinceau | 1 cm de largeur, utilisé pour collecter les œufs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermocycleurs | Eppendorf | 6331000076 | |
| Boîtes de Pétri | Supin | 90 mm de diamètre | |
| pH-mètre | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 & micro ; L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1 000 & micro ; L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 & micro ; L | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 & micro ; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Récipient de culture de tissus végétaux | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Boîte | 2,35 L | ||
| Hydroxyde de potassium (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Amorces pour amplifier le gène bactérien de l’ARNr 16S | Sangon Biotech | 27-F : 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R : 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Hydroxyde de sodium (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Billes | 0,25 mm | utilisées pour broyer les tissus | |
| Stéréomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Saccharose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marqueur | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Base | Tris Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | ; LP0037 | |
| Transilluminateur UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| saule | Sha Lake Park, Wuhan, Chine | ||
| Chrysomèle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, Chine | ||
| Extrait de levure | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Références
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Réimpressions et autorisations
