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Article de méthode

Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

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DOI :

10.3791/63245

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16 décembre 2021

 ,  ,  , 
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit la préparation et la mesure quantitative de l’arginine libre et liée aux protéines et des méthyl-arginines par spectroscopie RMN 1H.

Résumé

L’arginine liée aux protéines est généralement méthylée dans de nombreuses protéines et régule leur fonction en modifiant les propriétés physico-chimiques, leur interaction avec d’autres molécules, y compris d’autres protéines ou acides nucléiques. Ce travail présente un protocole facilement réalisable pour quantifier l’arginine et ses dérivés, y compris la diméthylarginine asymétrique et symétrique (ADMA et SDMA, respectivement) et la monométhylarginine (MMA). Après l’isolement des protéines à partir de fluides corporels biologiques, de tissus ou de lysats cellulaires, une méthode simple d’homogénéisation, de précipitation des protéines et d’hydrolyse des protéines est décrite. Étant donné que les hydrolysats contiennent de nombreux autres composants, tels que d’autres acides aminés, lipides et acides nucléiques, une étape de purification par extraction en phase solide (SPE) est essentielle. L’EPS peut être effectuée manuellement à l’aide de centrifugeuses ou d’un robot de pipetage. La sensibilité pour ADMA utilisant le protocole actuel est d’environ 100 nmol/L. La limite supérieure de détection de l’arginine est de 3 mmol/L en raison de la saturation SPE. En résumé, ce protocole décrit une méthode robuste, qui s’étend de la préparation d’échantillons biologiques à la détection basée sur la RMN, fournissant des conseils précieux et des pièges pour un travail réussi lors de l’étude du méthylome d’arginine.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, la méthylation des résidus d’arginine a été reconnue comme une modification post-traductionnelle essentielle des protéines. Il affecte les processus biologiques fondamentaux tels que la régulation de la transcription, la transduction du signal et bien d’autres1. Les principales protéines impliquées dans la régulation de la méthylation de l’arginine sont les protéines arginine méthyltransférases (PRMT)2. Les principaux dérivés de l’arginine sont la ω-(N G,N G)-diméthylarginine asymétrique (ADMA), la ω-(N G,N’G)-diméthylarginine symétrique (SDMA) et la ω-N G-monométhylarginine (MMA)2.

Les PRMT utilisent la S-adénosyl-l-méthionine pour transférer les groupes méthyle au groupe guanidino terminal (avec deux groupes aminés équivalents) de l’arginine1 liée aux protéines. Deux enzymes principales peuvent être distinguées: les enzymes de type I et de type II catalysent la première étape de méthylation pour former le MMA (qui perd ainsi sa symétrie). Après cette étape, les enzymes de type I (p. ex. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilisent le MMA comme substrat pour former l’ADMA, tandis que les enzymes de type II (principalement PRMT5 et PRMT9) produisent de la SDMA. PRMT1 a été la première protéine arginine méthyltransférase à être isolée à partir de cellules de mammifères3. Pourtant, les PRMT ont été conservés au cours de l’évolution4 chez d’autres animaux comme les vertébrés non mammifères, les chordés d’invertébrés, les échinodermes, les arthropodes et les nématodes cnidaires5, les plantes6 et les protozoaires, y compris les champignons comme la levure7. Dans de nombreux cas, l’élimination de l’un des PRMT entraîne une perte de viabilité, révélant le rôle essentiel des espèces d’arginine méthylée impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux tels que la transcription, la traduction, la transduction du signal, l’apoptose et la séparation de phase liquide-liquide (c’est-à-dire la formation d’organites sans membrane, par exemple des nucléoles), qui implique régulièrement des domaines riches en arginine 8,9,10 . À son tour, cela influence la physiologie et les états pathologiques, y compris le cancer 11,12,13, le myélome multiple 14, les maladies cardiovasculaires15, la pathogenèse virale, l’amyotrophie spinale 16, le diabète sucré 17 et le vieillissement1. On pense que l’augmentation des taux d’ADMA dans la circulation sanguine, par exemple dérivée du poumon18 en raison de la dégradation des protéines, est liée à un dysfonctionnement endothélial, à une maladie pulmonaire chronique19 et à d’autres syndromes de maladie cardiovasculaire20. La surexpression des PRMT a été trouvée pour accélérer la tumorigenèse et est associée à un mauvais pronostic21,22. Par ailleurs, l’ablation de PRMT6 et PRMT7 déclenche un phénotype de sénescence cellulaire23. Une diminution significative de l’ADMA et du PRMT1 a été observée au cours du vieillissement des fibroblastes WI-3824.

Le défi consiste à comprendre comment la méthylation agit dans les processus (physio)physiologiques en identifiant et en quantifiant la méthylation de la protéine arginine. La plupart des approches actuelles utilisent des anticorps pour détecter les arginines méthylées. Cependant, ces anticorps sont toujours spécifiques au contexte et pourraient ne pas reconnaître différents motifs des protéines méthylées de l’arginine25,26. Dans le protocole décrit, tous les dérivés de l’arginine mentionnés ci-dessus peuvent être quantifiés de manière fiable par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), c’est-à-dire seuls, en combinaison ou, comme dans la plupart des cas, dans des matrices biologiques complexes comme les cellules eucaryotes (par exemple, de levure, de souris ou d’origine humaine) et les tissus27, ainsi que le sérum28. Pour les protéines et ces matrices complexes, l’hydrolysedes protéines 29 est une condition préalable à la génération d’acides aminés libres (modifiés), tels que l’arginine, le MMA, la SDMA et l’ADMA. L’extraction en phase solide (SPE)30 permet l’enrichissement des composés d’intérêt. Enfin, la spectroscopie 1H-RMN permet la détection parallèle de l’arginine et de tous les principaux dérivés méthyliques de l’arginine. La spectroscopie RMN présente l’avantage d’être véritablement quantitative, hautement reproductible et d’être une technique robuste31,32. Les mesures RMN finales peuvent être effectuées par la suite lorsque de nombreux échantillons ont été prélevés et préparés. Enfin, ce protocole se concentre principalement sur la préparation des échantillons car cela ne nécessite pas de spectromètre RMN propre. Il peut être effectué dans la plupart des laboratoires biochimiques. Néanmoins, quelques indices sur lesquels les mesures de spectroscopie RMN devraient être effectuées sont fournis dans ce travail.

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Protocole

Des hydrolysats de protéines de levure ont été utilisés comme échantillons pour les résultats représentatifs de ces travaux. L’ensemble du protocole est résumé à la figure 1.

1. Préparation des matériaux et des réactifs

  1. Méthanol/eau : préparer un mélange de deux parties de méthanol à 99 % (MeOH) et d’une partie deH2O, désigné comme MeOH/H 2O. Entreposer le MeOH pur et le MeOH/H2Oà -20°C pour minimiser l’évaporation de l’alcool et augmenter la stabilité de l’échantillon.
  2. Acide chlorhydrique (HCl) : diluer 9 mol/L de HCl concentré (12,0 mol/L ou 37 %) ainsi que 0,1 mol/L de HCl. La solution concentrée plus élevée (9 mol/L) est utilisée pour l’hydrolyse des protéines, tandis que la solution concentrée plus faible (0,1 mol/L) est utilisée pour l’extraction en phase solide.
    ATTENTION : Travaillez à l’intérieur de la hotte.
  3. Préparer une solution de remplacement pour SPE contenant 10 % d’une solution d’ammoniac saturée (stock : 30 % p/p d’ammoniac), 50 % de méthanol et 40 % d’eau (v/v).
  4. Tampon RMN : Dissoudre 5,56 g d’hydrogénophosphate disodique (Na2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sel de sodium de l’acide 3-(triméthylsilyl)propionique-2,2,3,3-d4 (PTS, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) d’azoture de sodium (NaN3) dans 500 mL de dioxyde de deutérium (D2O) et ajuster à pH7,4 (en utilisant HCl ou NaOH, respectivement) (voir le tableau des matières). Vérifier la pureté de chaque nouveau lot tampon par spectroscopie RMN.
    REMARQUE : La quantité de contaminants (p. ex. éthanol) doit être aussi faible que possible.
  5. Remplir les tubes de mise en pâte avec des billes d’oxyde de zirconium (les tubes de 2 mL et les billes de 1,4 mm conviennent à la plupart des applications, mais différentes variantes sont disponibles) (voir le tableau des matériaux). Remplissez environ 10 à 20 perles à la main ou achetez des tubes préremplis, qui sont également disponibles.
  6. Gardez les pipettes et les embouts respectifs prêts dans la plage de 10 à 1 000 μL.
    REMARQUE : De l’eau très pure, désignéeH 2 O, définie par une résistance élevée de ≥18,2 MΩ·cm-1, a été utilisée tout au long des travaux. Elle correspond à de l’eau distillée double.

2. Prélèvement et stockage des échantillons

  1. Congeler rapidement les échantillons liquides (sérum/plasma, surnageant de culture cellulaire, etc.) avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
  2. Préparez les matériaux solides comme mentionné ci-dessous.
    1. Recueillir les cellules à partir de cultures cellulaires (3 à 5 millions de cellules) soit en collectant des cellules adhérentes, après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate froid, grattage et centrifugation, soit par centrifugation directe des cellules cultivées en suspension.
    2. Retirer les surnageants cellulaires (qui peuvent être collectés pour une analyse plus approfondie, soit par mesure directe consécutive, voir étape 6, soit après précipitation des protéines solubles, voir étape 3.1), puis congeler les pastilles avec de l’azote liquide et les conserver à -80 °C. Pour un traitement plus approfondi, voir l’étape 3.2.
    3. Stocker et collecter les tissus conformément à l’objectif de l’étude. Pour les tissus très homogènes, tels que le foie ou le muscle, analysez n’importe quelle partie de celui-ci. Par exemple, dans le cas d’un cerveau de souris, déterminer la méthylation globale de l’arginine de l’ensemble du cerveau ou des sections du cerveau.
      REMARQUE: Le poids idéal des tissus à traiter est de 30 à 60 mg. Il est conseillé de congeler et de pulvériser tout le cerveau et d’utiliser des aliquotes de celui-ci. Alternativement, des parties spécifiques du cerveau (par exemple, frontal, cervelet, régions occipitales ou un hémisphère, pesant ~ 250 mg) peuvent être utilisés.

3. Préparation préliminaire de l’échantillon

REMARQUE: Effectuez le travail sur la glace, en gardant MeOH froid. Les échantillons doivent également être conservés sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines.

  1. Pour les échantillons liquides, ajouter 400 μL de méthanol glacé à 200 μL de l’échantillon. Passez à l’étape 3.3.
    REMARQUE: Si moins d’échantillon est disponible, ajustez les volumes en conséquence; La sensibilité RMN est généralement suffisamment élevée pour des échantillons plus petits, mais doit être testée individuellement.
  2. Dans le cas des matériaux solides, préparer suffisamment de tubes de 1,5 mL pour les lysats (utiliser pour la centrifugation après homogénéisation).
    1. Soigneusement, mais soigneusement, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 600 μL de MeOH/H2O et transférer toute la phase liquide dans les tubes de réduction en pâte.
    2. Placez les mouchoirs dans des tubes de réduction en pâte (vous pouvez les peser directement dans les tubes) et ajoutez 600 μL de MeOH/H2O (pour 30-60 mg; ajuster si le poids diffère considérablement).
    3. Mettez les tubes dans l’homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux) et homogénéisez une fois pendant 20 s avec agitation importante (pour les granulés cellulaires, les tissus mous) ou deux fois pendant 20 s chacun (ou plus si nécessaire) avec un intervalle de 5 minutes entre les deux (pour les tissus rigides).
    4. Après homogénéisation, remettre immédiatement les échantillons sur la glace et transférer les lysats entiers dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.
  3. Conserver les échantillons pendant au moins 30 minutes (jusqu’à plusieurs jours) à -20 °C avant de poursuivre le traitement.
  4. Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. En attendant, préparez suffisamment de tubes de 1,5 mL pour recueillir les surnageants.
    REMARQUE : Ce surnageant (désigné « (1) » dans la figure 1) peut être jeté, lyophilisé et directement traité pour la RMN (étape 6) ou analysé autrement.
  5. Dans ce protocole, le précipité de MeOH (= pastille obtenue après l’étape 3.1 ou 3.2.2, respectivement) est utilisé pour des analyses ultérieures contenant, entre autres, des composants tels que des acides nucléiques et des lipides, des protéines méthylées à l’arginine. Poursuivre l’hydrolyse des protéines ou conserver les granulés à -20 °C pendant quelques jours.

4. Hydrolyse des protéines

  1. Ajouter 500 μL de 9 mol/L de HCl à chaque échantillon. Ensuite, tronquez les bouchons de chaque tube avec des ciseaux et placez-les dans les tubes de culture en verre (figure 2A). Fermez soigneusement mais fermement les bouchons rouges (vérifiant ainsi l’étanchéité).
    REMARQUE: Avant utilisation, vérifiez toujours chaque étanchéité (feuille PTFE grise à l’intérieur des bouchons à vis rouges) pour un serrage approprié et nettoyez-les régulièrement avec de l’eau.
  2. Une fois terminé, placez les tubes dans un bécher partiellement rempli de sable (pour un meilleur transfert de chaleur) et hydrolysez les échantillons pendant environ 16 h à 110 °C dans une chambre de séchage.
  3. Après hydrolyse, refroidir les échantillons (~1 h).
  4. Après cela, lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à vide poussé (inférieur à 100 Pa).
  5. Dissoudre les pastilles - si elles sont complètement sèches (sinon, poursuivre la lyophilisation) - dans 1 mL de 0,1 mol/L de HCl et ajouter 50 μL de chloroforme (CHCl3) dans chaque tube; Dissoudre soigneusement la pastille avec une pipette de 1 000 μL, mélangeant ainsi les liquides, puis transférer le volume complet dans un nouveau tube.
    ATTENTION: Toujours travailler avec de petites quantités pour minimiser l’évaporation importante
  6. Ensuite, centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
  7. Recueillir soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique contenant la fraction soluble dans l’eau (Figure 2B, la fraction de densité inférieure) à l’aide d’une pipette et la remplir dans de nouveaux tubes. Utiliser des tubes de 1,5 mL pour l’EPS manuelle (section 5.2) ou des flacons en verre pour l’EPS robotisée (section 5.3 et figure 2D). Éviter de renverser la CHCl3 et son contenu (figure 2C).

5. Extraction en phase solide (SPE)

  1. Avant la première utilisation, nettoyer les cartouches SPE deux fois avec 1 mL de la solution de remplacement (étape 1.3) suivie d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL). Ils peuvent être utilisés 10 à 20 fois chacun.
  2. SPE manuelle
    1. Préconditionner les cartouches (voir le tableau des matériaux) à chaque passage avec 1 mL de méthanol pur et 2 x 1 mL de PBS, suivi à chaque fois d’une centrifugation à 800 x g pendant 1 min à température ambiante (placées dans des tubes de 15 mL).
    2. Ensuite, chargez les échantillons (à partir de l’étape 4.7) sur les cartouches SPE et centrifugez-les à 600 x g pendant 2 min à température ambiante.
    3. Ensuite, appliquez un cycle de lavage comme mentionné ci-dessous.
      1. Ajouter trois fois 1 mL deH2O(chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
      2. Ajouter cinq fois 1 mL de 0,1 mol/L de HCl (chacun suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
      3. Ajouter deux fois 1 mL de MeOH (suivi d’une centrifugation pendant 1 min à 800 x g à température ambiante).
    4. Ensuite, éluer l’arginine et ses dérivés avec 3 x 1 mL de solution de remplacement (suivie d’une centrifugation 1 min à 800 x g à température ambiante) dans un seul tube de 15 mL.
      NOTE: La solution de remplacement sert d’éluant pour l’arginine et ses dérivés et est également utilisée pour nettoyer les cartouches (toutes les substances sont soit éliminées avant élution, soit à la valeur de pH de base de la solution de remplacement). Néanmoins, pour éviter la contamination au fil du temps, la réutilisation doit être limitée (voir étape 5.1).
  3. SPE robotique
    NOTE: Ici, un robot de pipetage (la partie principale consistant en une aiguille de pipetage, une station de lavage pour l’aiguille, une alimentation en réactif et des positions pour les échantillons et les éluats, voir Tableau des matériaux) est fourni avec un porte-cartouche pour les colonnes SPE. Pour les autres instruments, assurez-vous d’être entièrement équipé avec tout ce qui est énuméré.
    1. Remplir le surnageant (à partir de l’étape 4.7) directement dans des flacons en verre avec un scellage en PTFE (Figure 2D), préparer suffisamment de réactifs (100 mL de chaque, c’est-à-dire une solution de remplacement, 99 % de MeOH, PBS, H 2 O et 0,1 de HCl mol/L), des tubes de 5 mL pour l’élution et une solution delavage pour l’aiguille du robot (habituellement H2O).
    2. Utiliser une application ou une méthode dans le logiciel du robot en se basant précisément sur les étapes décrites pour l’EPS manuelle (étape 5.2).
      REMARQUE: Les détails peuvent varier considérablement d’un fournisseur d’instruments à l’autre, reportez-vous donc au manuel du logiciel du robot respectif pour la programmation. Un robot de pipetage fonctionne généralement en appliquant une pression d’air sur les cartouches au lieu de la centrifugation, ce qui est la principale différence. Si le protocole est établi et exécuté pour la première fois, inclure des contrôles (par exemple, L-arginine de concentration connue) pour vérifier un flux de travail optimal.

6. Préparation finale pour la RMN

  1. Lyophiliser les échantillons pendant la nuit pour compléter la sécheresse afin de se débarrasser de l’ammoniac et deH2O.
  2. Dissoudre chaque échantillon dans 500 μL de tampon RMN (étape 1.4) et transférer dans des tubes RMN. Il est important de noter que le volume doit être le même dans tous les tubes et que les échantillons doivent être homogènes (exempts de résidus et de lipides, qui ont tendance à s’agréger).
    NOTE: Les détails de la spectroscopie RMN vont au-delà de cet examen de la méthode et sont décrits plus en détail ailleurs27. Ici, seules les principales exigences et étapes sont expliquées. La quantification de l’arginine et de ses métabolites est effectuée sur un spectromètre RMN de 600 MHz (voir le tableau des matériaux). En principe, tout autre spectromètre RMN/intensité de champ RMN peut être utilisé, à condition que les signaux RMN de l’arginine et des arginines méthylées puissent être détectés avec une sensibilité suffisante et sans chevauchement de signaux. Toute tête de sonde avec des gradients d’axe z capables d’enregistrer 1spectre H peut être utilisée, à condition que les séquences d’impulsions soient configurées en conséquence.
  3. Enregistrer un spectre 1D en utilisant la séquence d’impulsions CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 balayages, taille de fid 73728, largeur spectrale 11904,76 Hz sur une RMN de 600 MHz, délai de recyclage 4 s) avec suppression du signal d’eau par présaturation.
  4. Dans ces expériences, supprimez les couplages scalaires de 1H par découplage virtuel, réduisant ainsi le chevauchement du signal. Enregistrer des questions spécifiques et/ou des échantillons ou matrices complexes, p. ex., 1 H-13C-hétéronucléaire spectre de cohérence quantique unique (HSQC)27.
    NOTA : Pour les matrices plus complexes dans lesquelles les signaux RMN de 1 H d’arginines méthylées pourraient être partiellement chevauchés avec des signaux RMN de 1 H d’autres métabolites (p. ex. lysine), des spectres homonucléaires résolus en J (JRES)35 de 1H sont requis.
  5. Effectuer une quantification absolue en intégrant les intensités de crête respectives des étalons d’une concentration connue, par exemple, 100 μmol/arginine.
    REMARQUE : Habituellement, l’ADMA, la SDMA et le MMA (voir le tableau des matières) sont déclarés comme un rapport par rapport à l’arginine. Cela présente un avantage significatif qu’aucune normalisation distincte (p. ex. nombre de cellules, masse tissulaire, concentrations de protéines) ne doit être effectuée. Dans ce cas, l’arginine sert d’étalon interne, et la quantification relative est suffisante pour obtenir des informations biologiquement pertinentes.
  6. Pour la différenciation de la SDMA et du MMA, lyophiliser à nouveau les échantillons pour se débarrasser deD2O(s’ils ont été remis en suspension dans un tampon RMN auparavant), qui est ensuite remplacé par du diméthylsulfoxyde deutéré (d6-DMSO), permettant la résolution des résonances méthyliques27. Par conséquent, aspirez les échantillons des tubes RMN avec des pipettes Pasteur, lyophilisez-les et dissolvez-les dans 500 μL de d6-DMSO.

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Résultats

Régulièrement, des projections 1H 1D de spectres RMN 2D résolus en J (JRES), virtuellement découplés, sont utilisées pour les assignations de pics et les quantifications dans notre laboratoire36. La figure 3 montre des spectres JRES représentatifs d’hydrolysats de protéines de levure purifiés à l’aide du protocole SPE actuel. Bien qu’à des concentrations très différentes, les deux substances peuvent être séparées et quantifiées dans une matrice cellulaire. ...

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Discussion

Dans la section suivante, l’accent est mis sur la méthode elle-même; les implications biologiques de la méthylation de l’arginine sont décrites dans la section Introduction.

Tout d’abord, les tissus de rigidité différente peuvent nécessiter un ajustement de la lyse de l’échantillon: les cellules de culture cellulaire (y compris les bactéries, les levures, etc.) et les tissus comme le cerveau, le foie jeune, les muscles lisses, etc., peuvent rapidement être homogénéisés. Pour les tissus de fort...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Le travail a été soutenu par les subventions P28854, I3792 du Fonds autrichien pour la science (FWF), doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (projet phare DYNIMO), les subventions 864690 de l’Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG) et 870454, le Centre de recherche sur le métabolisme intégratif de Graz; Programme d’infrastructure autrichien 2016/2017, gouvernement styrien (Zukunftsfonds) et Fonds de démarrage pour les talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (XRCZX2021020). Nous remercions le Centre de recherche médicale pour l’accès aux installations de culture cellulaire. F.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat en médecine moléculaire de l’Université médicale de Graz. Q.Z. a été formé dans le cadre du programme de doctorat sur les maladies métaboliques et cardiovasculaires de l’Université médicale de Graz.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de 15 mLGreiner Bio One188271
3-(triméthylsilyl)acide propionique-2,2,3,3-d4 sel de sodium (TSP)Alfa AesarA1448
Tubes de 5 mL, fond rondGreiner Bio One115101
Solution d’ammoniac 32 %RothA990.1
Bruker Spectromètre RMN 600 MHz, équipé d’une tête de sonde TXIBruker-
Centrifugeuse, réfrigérée, par ex. 5430 REppendorf5428000010
Chloroform &ge ; 99 % par anRoth3313.1
Fluide caloporteur CryocoolThermo ScientificSCC1pour système SpeedVac
Oxyde de deutérium (D2O)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-10-PK
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-6-1000
Liant de chambre de séchage9090-0018
Tubes de culture DURAN, 13 x 100mm, GL 14, 9 mLVWR International212-0375
Edwards Pompe à huile pour vide profond RV5Thermo Scientific16234611partie du système SpeedVac
Tubes Eppendorf 1,5 mLGreiner Bio One616201
Gilson Robot de pipetage GX-241 AspecGilson Inc.
L-arginineAppliChemA3675
Méthanol &ge ; 99 %Roth8388.4
Milli-Q aparatus d’eauMilliporeZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartouchesWaters186000252https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS)LonzaLONBE17-512F
Precellys 24 homogénéisateur de tissusBertin InstrumentsP000669-PR240-Ahttps://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Tubes Precellys (tubes de mise en pâte)VWR International432-0351
Precellyse 1,4 mm billes d’oxyde de zirconiumVWR International432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Modules de chauffage, d’agitation et d’évaporationThermo ScientificTS-18820
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 Rotor pour tubes de 1,5 mL, FA-45-30-11Eppendorf5427753001
Savant Piège réfrigéréThermo Scientific15996161partie du système SpeedVac
Concentrateur sous vide Savant SpeedVac SPD210Thermo Scientific15906181partie du système SpeedVac ; équipé avec rotor pour tubes de 1,5 ml
Bouchons à vis pour flacons en verre avec étanchéité en PTFE, DN9Dr. R. Forche ChromatographieCT11B3011
SeasandRoth8441.3
Flacons en verre à filetage court 1,5 mL, ND9Dr. R. Forche ChromatographieVT1100309
Azoture de sodium (NaN3)RothK305.1
Hydroxyde de sodium (NaOH)VWRBDH7363-4
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)VWR80731-078
TopSpin 4.0 (Logiciel)Bruker-https://www.bruker.com
&omega ;-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA)Santa Cruz Biotechnologysc-208093
&omega ;-NG-monomethylarginine (MMA)Santa Cruz Biotechnologysc-200739A
&omega ;-NG-NG'-diméthylarginine symétrique (SDMA)Santa Cruz Biotechnologysc-202235A
26150008

Références

  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  3. Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
  4. Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
  5. Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
  6. Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
  7. Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
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