Article de méthode

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

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DOI :

10.3791/63260

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28 décembre 2021

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1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Résumé

La phototransduction de la drosophile est l’une des voies de signalisation couplées à la protéine G les plus rapides connues. Pour assurer la spécificité et l’efficacité de cette cascade, le canal cationique perméable au calcium (Ca2+), le potentiel récepteur transitoire (TRP), se lie étroitement à la protéine de l’échafaudage, l’inactivation sans potentiel Après potentiel D (INAD), et forme un grand complexe protéique de signalisation avec la protéine kinase C (ePKC) spécifique à l’œil et le potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA). Cependant, les propriétés biochimiques du canal TRP de la drosophile restent floues. Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, une purification d’affinité modifiée et une stratégie de compétition ont été développées pour purifier le canal endogène TRP. Tout d’abord, le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué à l’histidine (His) a été lié à des perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire le complexe protéique endogène de l’INAD des homogénats de tête de drosophile. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 purifié excessif marqué par la glutathion S-transférase (GST) a été ajouté aux perles de Ni pour concurrencer le canal TRP. Enfin, le canal TRP dans le surnageant a été séparé du peptide TRP 1261-1275 excessif par chromatographie d’exclusion de taille. Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP de la drosophile sous des angles biochimiques et structurels. Les propriétés électrophysiologiques des canaux TRP purifiés de la drosophile peuvent également être mesurées à l’avenir.

Introduction

La phototransduction est un processus où les photons absorbés sont convertis en codes électriques des neurones. Il relaie exclusivement les opsines et la cascade de signalisation couplée à la protéine G suivante chez les vertébrés et les invertébrés. Chez la drosophile, en utilisant ses cinq domaines PDZ, l’inactivation de la protéine d’échafaudage sans potentiel postérieur D (INAD) organise un complexe de signalisation supramoléculaire, qui se compose d’un canal de potentiel de récepteur transitoire (TRP), de potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA) et d’une protéine kinase C (ePKC)1 spécifique à l’œil. La formation de ce complexe de signalisation supramoléculaire garantit la localisation subcellulaire correcte, une efficacité élevée et la spécificité de la machinerie de phototransduction de la drosophile. Dans ce complexe, les canaux TRP sensibles à la lumière agissent comme des effecteurs en aval de NORPA et médient l’afflux de calcium et la dépolarisation des photorécepteurs. Des études antérieures ont montré que l’ouverture du canal TRP de la drosophile est médiée par les protons, la perturbation de l’environnement lipidique local ou la force mécanique 2,3,4. Le canal TRP de la drosophile interagit également avec la calmoduline5 et est modulé par le calcium par rétroaction positive et négative 6,7,8.

Jusqu’à présent, les études d’électrophysiologie sur le mécanisme de contrôle des canaux TRP et TRP-like (TRPL) de la drosophile étaient basées sur des patchs membranaires excisés, des enregistrements de cellules entières de photorécepteurs dissociés de type sauvage de la drosophile et des canaux hétéro-exprimés dans les cellulesS2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mais pas sur les canaux purifiés. Les informations structurelles du canal TRP complet de la drosophile restent également floues. Afin d’étudier les propriétés électrophysiologiques des protéines purifiées dans un environnement membranaire reconstitué et d’obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de drosophile sur toute la longueur, l’obtention de canaux TRP purifiés sur toute la longueur est la première étape nécessaire, similaire aux méthodologies utilisées dans les études des canaux TRP des mammifères 14,15,16,17.

Récemment, sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD 18,19,20, une stratégie de purification d’affinité et de compétition a d’abord été développée pour purifier le canal TRP des homogénats de tête de drosophile par des billes de streptavidine 5. Compte tenu de la faible capacité et du coût élevé des perles de streptavidine, un protocole de purification amélioré est introduit ici qui utilise la protéine d’appât marquée His et les perles Ni correspondantes à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée. La méthode proposée aidera à étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP sous des angles structurels et à mesurer les propriétés électrophysiologiques du canal TRP avec des protéines purifiées.

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Protocole

1. Purification du TRP étiqueté GST et des fragments NORPA étiquetés His

  1. Purifier le fragment TRP 1261-1275 étiqueté TPS
    1. Transformez le plasmide10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 en cellules Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu Luria Bertani (LB) et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier les 10 mL de culture d’ensemencement dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
    2. Une fois que la densité optique (OD600) des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
    3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 × g pendant 20 min et remettre en suspension dans 40 mL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS).
    4. Chargez les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur haute pression pré-refroidi à 4 °C. Augmentez lentement la pression de l’homogénéisateur à 800 bars. Ouvrez le robinet d’entrée et laissez les cellules remises en suspension passer circulairement à travers une vanne à fentes très étroites.
      REMARQUE: Les cellules sont homogénéisées par les forces de cisaillement élevées causées par une chute de pression et une cavitation importantes.
    5. Chargez 5 mL de billes de glutathion dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez les billes avec 50 mL de tampon PBS pour un total de trois fois.
    6. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée (40 mL) aux billes de glutathion équilibrées dans la colonne d’écoulement gravitaire et incuber pendant 30 min à 4 °C. Remettez en suspension les perles de glutathion toutes les 10 minutes.
    7. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement. Rincez deux fois les billes de glutathion restantes avec 50 mL de tampon PBS.
    8. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux billes de glutathion et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
    9. Après 30 min d’incubation, éluez le fragment TRP 1261-1275 marqué GST dans un tube conique de 50 mL et chargez-le dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibré à l’aide d’un tampon Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    10. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir les protéines éluées à raison de 5 mL/tube.
    11. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tachez le gel avec coomassie bleu R250.
    12. Concentrer le fragment purifié TRP 1261-1275 marqué GST de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
    13. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment TRP 1261-1275 marqué GST à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    14. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). En règle générale, la culture de 1 L de TRP 1261-1275 marqué GST donne 1 mL de 600 μM de protéines (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 1 pour les matériaux nécessaires.
  2. Purification du fragment NORPA 863-1095 étiqueté His
    1. Transformer le plasmide20 pETM.3C NORPA 863-1095 en cellules E. coli BL21 (DE3) à l’aide de la méthode de transformation par choc thermique CaCl2 21. Inoculer une seule colonie dans 10 mL de milieu LB et croître pendant la nuit à 37 °C. Ensuite, amplifier la culture d’ensemencement de 10 mL dans 1 L de milieu LB à 37 °C.
    2. Une fois que la DO600 des cellules atteint 0,5, refroidir les cellules à 16 °C et ajouter 0,1 mM d’IPTG (concentration finale) pour induire la surexpression de la protéine cible et incuber à 16 °C pendant 18 h.
    3. Après surexpression, pastille 1 L de cellules cultivées par centrifugation à 3 993 x g pendant 20 min et remise en suspension dans 40 mL de tampon de liaison. Ensuite, lyser les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur à haute pression à 4 °C comme décrit à l’étape 1.1.4.
    4. Chargez 5 mL de billes de Ni dans une colonne d’écoulement par gravité et lavez trois fois avec 50 mL de tampon de liaison.
    5. Centrifuger le lysat de cellule de l’homogénéisateur haute pression à 48 384 x g. Ajouter le surnageant du lysat de cellule centrifugée aux billes de Ni équilibrées dans la colonne d’écoulement par gravité et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
    6. Après 30 min d’incubation, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement. Jetez la fraction d’écoulement et lavez les billes de Ni restantes deux fois avec 50 mL de tampon de lavage.
    7. Ajouter 15 mL de tampon d’élution aux ni-billes et incuber pendant 30 min. Resuspendez les perles de Ni toutes les 10 minutes.
    8. Après 30 min d’incubation, recueillir le fragment NORPA 863-1095 marqué His élué dans un tube conique de 50 mL et charger dans une colonne d’exclusion de taille (grade de préparation), qui est équilibrée à l’aide de Tris de 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Maintenir le débit d’élution de la colonne d’exclusion de taille à 3 mL/min. Recueillir la protéine éluée à raison de 5 mL/tube.
    10. Identifier le pic de la protéine cible dans la colonne d’exclusion de taille en analysant les signaux d’absorption UV à 280 nm et vérifier par analyse de gel SDS-PAGE (paramètres d’électrophorèse : 150 V pour le gel empilable ; 200 V pour le gel résolvant). Tassez le gel à l’aide de Coomassie bleu R250.
    11. Concentrer le fragment NORPA 863-1095 purifié de la colonne d’exclusion de taille à 1 mL à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 15 mL centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée de bureau.
    12. Déterminer la concentration de protéines concentrées à l’aide de la loi de Beer-Lambert. Mesurez l’absorption UV du fragment NORPA 863-1095 marqué his à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    13. Obtenir le coefficient d’extinction à 280 nm en important les séquences protéiques dans le programme Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Typiquement, la culture de 1 L du fragment NORPA 863-1095 marqué par His donne 1 mL de 600 μM de protéine (6 x 10-7 mol). Voir le tableau 2 pour les matériaux nécessaires.

2. Préparation des têtes de drosophiles

  1. Recueillir les mouches adultes dans des tubes de centrifugation conique de 50 mL à l’aide de la méthode d’anesthésie au CO2 22,23; congeler immédiatement dans de l’azote liquide pendant 10 min et conserver dans un congélateur à -80°C.
  2. Après avoir recueilli un nombre suffisant de mouches, secouez vigoureusement les tubes coniques congelés de 50 mL à la main pour séparer les pattes, la tête, les ailes et le corps des mouches. Transférer le mélange dans trois tamis en acier inoxydable pré-refroidis séquentiellement (maillage 20/30/40, respectivement) et agiter les tamis.
  3. Ensuite, comme les têtes ne peuvent pas passer à travers le tamis à 40 mailles, utilisez une brosse pour balayer les têtes de mouche du tamis à 40 mailles, transférez-les dans des tubes coniques de 50 mL et stockez-les à −80 °C.
  4. Recueillir en permanence les mouches et leurs têtes et les stocker dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent la quantité requise pour l’expérimentation (0,5 g). En règle générale, pour recueillir 0,5 g de têtes, 35 mL de mouches dans un tube conique de 50 mL sont nécessaires. Voir le tableau 3 pour les matériaux nécessaires.

3. Purification du canal TRP de la drosophile

  1. Peser un total de 0,5 g de têtes et homogénéiser complètement dans l’azote liquide à l’aide d’un pilon de mortier pré-refroidi. Dissoudre les têtes homogénéisées dans un tampon de lyse de 10x v/w (5 mL), incuber dans un agitateur à 4 °C pendant 20 min, puis centrifuger à 20 817 x g pendant 20 min à 4 °C.
  2. Recueillir le surnageant de spin-down (« 20817 g S », Figure 4) et le centrifuger à 100 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Utilisez le surnageant de rotation (« 100 000 g S », figure 4) pour le test de traction suivant.
  3. Ajouter 1 mL de billes de Ni dans la colonne d’écoulement par gravité et laver les billes avec 10 mL deH2O(ddH2O) double distillé à 4 °C pour un total de trois fois. Équilibrer les billes avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse trois fois à 4 °C.
  4. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine NORPA 863-1095 purifiée marquée His-1095 (3 x 10-7 mol) dans la colonne Ni et incuber pendant 30 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
  5. Ouvrez le robinet de sortie de la colonne pour séparer les perles et la fraction de flux. Prenons la fraction de flux pour l’analyse SDS-PAGE (NORPA F, Figure 4). Dans cette section, les protéines d’appât sont immobilisées sur les perles de Ni.
  6. Lavez les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et conservez la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 1, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et conservez l’échantillon pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 2, Figure 4A). Dans cette section, les protéines d’appât excessives sur les perles de Ni sont éliminées.
  7. Ajouter le surnageant de l’homogénat de tête de drosophile après centrifugation de 100 000 x g dans la colonne Ni à 4 °C, où le fragment NORPA 863-1095 marqué par His a été immobilisé.
  8. Incuber le surnageant avec les perles de Ni à 4 °C pendant 30 min. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes. Ensuite, ouvrez le robinet de sortie de colonne pour séparer les perles et la fraction d’écoulement.
  9. Recueillir le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (lyse de tête Dro F, Figure 4A). Dans cette section, les complexes protéiques INAD (INAD/TRP/ePKC) dans les homogénats de tête sont capturés par les fragments NORPA 863-1095 immobilisés sur les ni-billes.
  10. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de lyse (10 mL) à 4 °C et garder le surnageant des précipitations par gravité pour l’analyse SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Répétez les étapes ci-dessus et collectez le surnageant pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 4, Figure 4A). Dans cette section, les protéines non liées sur les perles de Ni sont éliminées.
  11. Ajouter 500 μL de 600 μM de protéine TRP 1261-1275 marquée GST (3 x 10-7 mol) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Resuspendez les perles toutes les 10 minutes.
  12. Recueillir la fraction éluée de la colonne de gravité (TRP E1, Figure 4B), qui contient le canal endogène Drosophila TRP. Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (TRP E2, Figure 4B). Dans cette étape, en utilisant les fragments TRP 1261-1275 marqués GST comme concurrent, les canaux TRP sont élués à partir des complexes protéiques INAD capturés (INAD / TRP / ePKC) sur les perles Ni.
  13. Laver les billes de Ni avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison (10 mL; Tableau 1) à 4 °C et recueillir la fraction de lavage pour l’analyse SDS-PAGE (Lavage 5, Figure 4B).
  14. Ajouter 500 μL de tampon d’élution (tableau 1) dans les billes de Ni et incuber pendant 20 min à 4 °C. Recueillir la fraction d’élution de la colonne d’écoulement gravitaire (NORPA E1, figure 4B). Répétez les étapes ci-dessus et collectez la fraction d’élution (NORPA E2, Figure 4B).
  15. À l’aide du tampon d’élution, éluez le fragment NORPA 863-1095 marqué His accompagné des complexes protéiques INAD/ePKC. Ensuite, remettez en suspension les billes de Ni dans 500 μL de tampon de liaison.
  16. Prenez les billes de Ni remises en suspension pour exécuter la SDS-PAGE (colorée par Coomassie bleu R250) afin d’analyser l’efficacité de l’élution et d’évaluer si le tampon d’élute fonctionne (perles, Figure 4B). Voir le tableau 4 pour les matériaux nécessaires.

4. Purification de la colonne d’exclusion de taille du canal TRP de la drosophile

  1. Installez une colonne d’exclusion de taille (grade analytique) sur le système de purification des protéines. Équilibrez la colonne avec le tampon de colonne (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), qui est filtré par un filtre de 0,45 μm.
  2. Concentrer la fraction TRP E1 et E2 de l’étape 3.14 à l’aide d’une colonne de spin d’ultrafiltration de 4 mL, centrifugée à 3 000 x g à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée.
  3. Rincez la boucle d’échantillon avec le tampon de colonne et chargez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage. Injecter l’échantillon dans la colonne d’exclusion de taille et éluer les protéines avec un débit approprié (0,5 mL/min).
  4. Identifier le pic de la protéine cible par absorption à 280 nm et exécuter un gel SDS-PAGE pour détecter le canal endogène purifié de la Drosophile TRP (Figure 5). Voir le tableau 5 pour les matériaux nécessaires.

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Résultats

Dans cet article, il est démontré qu’une méthode de purification des protéines purifie le canal endogène TRP de la drosophile (Figure 1).

Tout d’abord, l’expression et la purification des protéines recombinantes sont appliquées pour obtenir les protéines d’appât et concurrentes. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 marqué GST est exprimé dans des cellules E. coli BL21 (DE3) en milieu LB et purifié à l’aide de billes de glutathion et d’une colonne d...

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Discussion

INAD, qui contient cinq domaines PDZ, est le principal organisateur des machines de phototransduction de la drosophile. Des études antérieures ont montré que INAD PDZ3 se lie à la queue C-terminale du canal TRP avec une spécificité exquise (KD = 0,3 μM)18. Le tandem INAD PDZ45 interagit avec le fragment NORPA 863-1095 avec une affinité de liaison extrêmement élevée (KD = 30 nM). Ces résultats fournissent une base biochimique solide pour concevoir la stratégie de puri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (n° 31870746), shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) et natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2021A1515010796) à W. L. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souches bactériennes
BL21(DE3) Cellules compétentesNovagen69450Surexpression des protéines
Modèles d’expérience
D.melanogaster : W1118 soucheBloomington Drosophila Stock CenterBDSC :3605Drosophila préparation de la tête
Matériel
20/30/40 tamis en acier inoxydableJiufeng metal mesh companyGB/T6003.1Drosophila préparation de la tête
30 % Acrylamide-N,N&prime ;-Methylenebisacrylamide(29:1)LableadA3291Préparation de gel SDS-PAGE
Persulfate d’ammoniumInvitrogenHC2005Préparation de gel SDS-PAGE
Cocktail inhibiteur de protéaseRoche05892953001Inhibiteur de protéase
Coomassie bleu brillant R-250Sangon BiotechA100472-0025Coloration de gel SDS-PAGE
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Préparation
de tampon de colonne d’exclusion stériqueSel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500 Préparation detampon de colonne d’exclusion stérique
GlycineSangon BiotechA610235-0005Préparation de tampon SDS-PAGE
Glutathion Sepharose 4 Perles à écoulement rapideCytiva17513202Chromatographie d’affinité
ImidazoleSangon BiotechA500529-0001Tampon d’élution préparation pour colonne de nickel
Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Induction de la surexpression des protéines
LB Poudre de bouillonSangon BiotechA507002-0250E.coli. culture cellulaire
L-Glutathion réduit (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GPréparation du tampon d’élution pour billes
de glutathionBilles de Ni-Sepharose excelCytiva17371202Chromatographie d’affinité
N-Dodecyl bêta-D-maltoside (DDM)Sangon BiotechA610424-001Détergent pour la purification des protéines
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE préparation de gel
PBSSangon BiotechE607008-0500Tampon d’homogénéisation pour <>E.coli.
PMSFLableadP0754-25GInhibiteur de protéase
Marqueur protéique précoloré ThermoScientific26619/26616Échelle de protéines précolorées
Colonne d’exclusion de taille (grade de préparation)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 Colonne PG
Colonne d’exclusion de taille (grade analytique)Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 Colonne GL
Chlorure de sodiumSangon BiotechA501218-0001Préparation de tampon de purification de
protéines Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sangon BiotechA500228-0001Préparation de gel/tampon SDS-PAGE
Base TrisSigma-aldrichT1503-10KGPréparation de tampon de purification de protéines Spin
colonneMilliporeUFC901096/801096Concentration en protéines
équipement
Balance analytiqueDENVERAPX-60Mètre de Drosophila tête
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse de bureau pour tubes de centrifugation coniques de 15 ml et 50 mlEppendorf5810RConcentration en protéines
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse de bureau Tubes de centrifugation de 1,5 mlEppendorf5417RCentrifugation du lysat de tête Drosophila après homogénéisation
Colonne d’écoulement par gravité vide (diamètre intérieur = 1,0 cm)Bio-Rad738-0015Purification des protéines TRP
Colonne d’écoulement par gravité vide (diamètre intérieur = 2,5 cm)Bio-Rad738-0017Purification des appâts et des protéines concurrentes à partir de E.coli.
Gel Systèmede documentation Bio-RadUniversal Hood II Gel Doc XRSystème SDS-PAGE imagerie Centrifugeuse
réfrigérée à grande vitesseBeckman SocAvanti J-26 XPCentrifugation des cellules E.coli./lysat cellulaire
Homogénéisateur haute pressionUNION-BIOTECHUH-05Homogénéisation des cellules E.coli.
Réservoir d’azote liquideTaylor-WhartonCX-100Préparation de la tête
Épurateur deprotéinesCytivaPurification des protéines
Réfrigérateur (-80° ; C)Thermo900GPem>Préparation de la tête drosophile
SpectrophotomètreMAPADAUV-1200OD600 Mesure des cellules E.coli.
SpectrophotomètreThermo ScientificNanoDrop 2000cDétermination de la concentration en protéines
UltracentrifugeuseBeckman CoulterOptima XPN-100 UltracentrifugeUltracentrifugation
cellule d’ultrafiltration AKTA <

Références

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  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
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Mots-clés

Canaux TRP de Drosophilapurification de complexes prot iquespurification par affinitchromatographie d exclusion st riquebilles de nickelbilles de glutathionecomplexe prot ique INADvoie de phototransductiontechniques de cryo EM

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