Méthodes in vitro et in vivo pour explorer la mégacaryopoïèse

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

Article de méthode

Méthodes in vitro et in vivo pour explorer la mégacaryopoïèse

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DOI :

10.3791/63286

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17 novembre 2021

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

Dans cet article

Résumé

ARTICLES DISCUTÉS :

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Leucodéplétion filtre les cellules CD34+ dérivées de la leucodélité comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171), E62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolement des progéniteurs mégacaryocytaires de souris. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171), E62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171), E62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Exploration in situ de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dynamique de formation des proplaquettes d’explants de moelle osseuse fraîche de souris. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171), E62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Imagerie in vivo à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettes dans la moelle osseuse du crâne de souris. Journal des expériences visualisées : JoVE. (171), E62515 (2021)

Éditorial

Les plaquettes sont de petites cellules sanguines anulcléées, essentielles à l’hémostase, qui dérivent des mégacaryocytes (MK) dans la moelle osseuse (BM). Au cours de leur différenciation à partir de cellules souches hématopoïétiques, les MK se transforment en cellules géantes dans un processus complexe de différenciation et de maturation qui comprend la polyploïdisation et la maturation cytoplasmique. Au stade final du développement, lorsque les MK sont en contact avec les cellules endothéliales, ils atteignent leur stade de maturité et étendent de longues extensions cytoplasmiques, appelées proplaquettes, dans les vaisseaux sanguins, qui se fragmentent ensuite pour donner naissance aux plaquettes dans la circulation sanguine ^1,2. Les mécanismes qui régulent la maturation des MK et la formation des proplaquettes transendothéliales sont encore incomplètement compris. L’objectif de cette collection est de rassembler des méthodes complémentaires qui contribueront à mieux comprendre la biologie des MK in vitro et in vivo.

L’expansion et la différenciation in vitro des MK sont largement utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents à la biogenèse plaquettaire. Dans le protocole de Pongerard et al., les auteurs décrivent un protocole de culture standardisé pour la différenciation des MK des progéniteurs hématopoïétiques CD34⁺ humains. Ils insistent particulièrement sur le fait que les filtres leucocytaires disponibles dans les centres de transfusion sanguine constituent une source exceptionnelle pour la collecte de cellules CD34⁺. Leur article contient plusieurs directives essentielles sur la façon d’extraire les cellules CD34⁺, d’évaluer leur pureté et l’importance de leur densité d’ensemencement. Les auteurs proposent également une méthode de pipetage calibrée, cinq fois de suite, pour libérer efficacement des plaquettes fonctionnelles. Les applications intéressantes de cette méthode sont la possibilité d’évaluer des composés pharmacologiques ou de manipuler génétiquement des cellules CD34⁺ à l’aide d’une méthode d’édition du génome CRISPR-Cas9 ^3,4. Pour les études sur les souris, Kimmerlin et al. présentent une stratégie de tri cellulaire pour purifier les progéniteurs MK en nombre suffisant compatible avec les tests moléculaires et cellulaires. Les auteurs discutent des avantages d’utiliser la crête iliaque comme source de moelle osseuse contenant un grand nombre de progéniteurs hématopoïétiques et d’effectuer une déplétion magnétique en deux étapes des cellules indésirables avant le tri cellulaire à l’aide d’une combinaison de marqueurs de surface cellulaire. Un avantage majeur de cette méthode est la réduction du nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des progéniteurs MK hautement purifiés, ce qui, par exemple, peut intéresser les chercheurs qui étudient la hiérarchie des progéniteurs hématopoïétiques et leur différenciation. Dans ce contexte, Boscher et al. décrivent une méthode pour faire pousser des progéniteurs dans un milieu 3D composé de 2 % de méthylcellulose afin de mieux imiter l’environnement in vivo. En fait, ces auteurs ont déjà démontré que les MK cultivés dans un hydrogel 3D atteignent un état de maturation plus élevé et une plus grande capacité à former des progéniteurs par rapport à ceux cultivés dans un milieu liquide⁵. Des étapes critiques sont mises en évidence dans ce protocole telles que le volume approprié de méthylcellulose pour obtenir une rigidité moyenne optimale, le nombre de cellules qui doit être équivalent dans chaque condition expérimentale, et le risque de contamination. Pour la vérification fonctionnelle du niveau de maturation, les auteurs expliquent comment remettre en suspension les cellules cultivées en gel dans un milieu liquide le troisième jour de culture et comment fixer les cellules pour une analyse future par immunomarquage, cytométrie en flux ou microscopie électronique. La microscopie électronique à transmission (MET) est l’approche d’imagerie de choix pour fournir une ultrastructure à haute résolution des MK. Ici, Scandola et al. partagent un protocole pour analyser l’ultrastructure des MK dans leur environnement BM naturel, et pour quantifier leur densité cellulaire et noter les différents stades de maturation. Les auteurs utilisent la MET pour analyser les événements cellulaires qui se produisent lorsque les MK interagissent avec la paroi sinusoïdale, tels que leurs courtes protubérances invasives ressemblant à des podosomes pénétrant dans l’endothélium⁶. Une limitation de la méthode est que la phase initiale d’engagement de MK ne peut pas être analysée en raison de l’absence de caractéristiques ultrastructurales spécifiques de ces cellules immatures. Comme nous l’avons noté, cette approche d’imagerie présente l’avantage d’utiliser de petits échantillons de BM permettant de réaliser plusieurs études avec une seule souris. A titre d’exemple, les autres échantillons de moelle osseuse peuvent être utilisés pour la technique d’explant de moelle osseuse qui est présentée dans cette collection par Guinard et al. pour étudier l’extension dynamique des proplaquettes à partir des MK. La force de cette méthode réside dans l’utilisation de MK qui se sont développés dans le BM, évitant ainsi toute erreur d’interprétation potentielle résultant d’artefacts de différenciation cellulaire en culture. En effet, cela a déjà été documenté chez des souris avec une inactivation de MYH9 restreinte par MK, où des résultats divergents ont été trouvés in vitro et ex vivo⁷. Les auteurs soulignent également le caractère simple, reproductible et rapide de cette approche. Une note intéressante de leur protocole est la possibilité d’utiliser des microscopes équipés d’un logiciel de navigation pour faciliter le suivi/quantification des MK étendant les proplaquettes. Une méthode complémentaire du modèle d’explant est l’imagerie à deux photons de MK dans le crâne de souris. L’originalité de cette technique est la possibilité d’étudier in vivo le comportement dynamique des MK marqués par fluorescence dans la moelle osseuse et de visualiser l’extension des proplaquettes. Ce protocole a l’avantage d’être peu invasif, avec des interventions chirurgicales limitées, évitant ainsi les réactions inflammatoires qui ont été signalées comme ayant un impact sur la formation de proplaquettes. Comme le notent Bornert et al., l’une des limites de cette méthode est la faible profondeur qui peut être imagée en raison de la densité de l’os, ce qui impose également l’utilisation de souris plus jeunes. Cette technique peut être appliquée à des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans la formation des plaquettes in vivo. Par exemple, les auteurs ont utilisé cette technique pour démontrer que le rôle des microtubules dans l’allongement des proplaquettes diffère entre^{les conditions} in vitro et in vivo8.

Un développement anormal de MK et une production de plaquettes peuvent entraîner une thrombocytopénie ou une thrombocytémie, augmentant le risque d’hémorragie ou de thrombose, respectivement. Les efforts continus visant à disséquer les mécanismes moléculaires régissant la biogenèse plaquettaire augmenteront notre capacité à développer de nouvelles stratégies pour le traitement de la thrombocytopénie et de la thrombocytémie. Dans le domaine de la recherche transfusionnelle, ces efforts jetteront les bases de la production de plaquettes cultivées comme alternative transfusionnelle dans certaines situations⁹.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), l’Union Européenne à travers le Fonds Européen de Développement Régional (FEDER) et par la subvention ANR-17-CE14-Megaplatprod à H.d.S et ANR-18-CE14-PlatForMechanics à C.L.

Références

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Réimpressions et autorisations

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