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Article de méthode

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

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DOI :

10.3791/63308

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1 décembre 2021

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1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.

Résumé

L’estimation du taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique, car l’entrée de calcium dans la cellule présynaptique déclenche une cascade d’événements conduisant à la libération de neurotransmetteurs. De plus, les changements dans les niveaux de calcium présynaptique médient l’activité de nombreuses protéines intracellulaires et jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. La jonction neuromusculaire est un modèle approprié pour étudier la plasticité synaptique, car elle n’a qu’un seul type de neurotransmetteur. Cet article décrit la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium à travers le faisceau nerveux coupé dans les terminaisons nerveuses motrices des souris. Cette méthode permet l’estimation de tous les paramètres liés aux changements intracellulaires du calcium, tels que le taux de calcium basal et le calcium transitoire. Étant donné que l’afflux de calcium de l’extérieur de la cellule dans les terminaisons nerveuses et sa liaison / déliaison au colorant sensible au calcium se produisent dans un délai de quelques millisecondes, un système d’imagerie rapide est nécessaire pour enregistrer ces événements. En effet, les caméras à haute vitesse sont couramment utilisées pour l’enregistrement des changements rapides du calcium, mais elles ont des paramètres de faible résolution d’image. Le protocole présenté ici pour l’enregistrement transitoire du calcium permet une très bonne résolution spatio-temporelle fournie par la microscopie confocale.

Introduction

Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives6. Pour mesurer les changements dans les niveaux de calcium, des colorants fluorescents sensibles au calcium sont couramment utilisés, et les changements dans leur niveau de fluorescence sont analysés 7,8,9.

Le chargement des colorants calciques dans les cellules peut être réalisé de différentes manières. Principalement, les colorants perméables aux cellules sont utilisés10,11. Cependant, dans un tel cas, il est non seulement difficile de contrôler la concentration d’un colorant à l’intérieur de la cellule, mais il est également difficile de sélectionner les cellules cibles pour le chargement. Cette méthode n’est pas applicable à l’étude des terminaisons nerveuses périphériques puisque le colorant pénètre dans les cellules postsynaptiques. Au lieu de cela, les colorants imperméables cellulaires conviennent mieux à de telles préparations. Dans ce cas, les colorants sont délivrés aux cellules par micro-injection ou par une pipette patch12,13,14. Il existe également une méthode de chargement à travers un moignon nerveux. Cette dernière méthode est la plus appropriée pour les préparations de jonction neuromusculaire 15,16,17,18,19,20. Il permet d’effectuer des colorations uniquement pour les cellules d’intérêt. Bien que cette méthode ne fournisse pas une évaluation précise de la concentration du colorant dans la cellule cible, la concentration peut être estimée approximativement en comparant le niveau de fluorescence des cellules au repos dans des solutions avec une concentration connue de calcium21. Dans cette étude, une modification de cette méthode appliquée aux synapses des mammifères est présentée.

L’entrée du calcium pendant la phase dépolarisante du potentiel d’action est un processus rapide, en particulier dans la jonction neuromusculaire; Par conséquent, pour son enregistrement, un équipement approprié est nécessaire1. Une étude récente utilisant un colorant fluorescent sensible à la tension a démontré que la durée du potentiel d’action dans la synapse périphérique d’une souris est d’environ 300 μs22. Le calcium transitoire, évalué à l’aide de colorants sensibles au calcium dans les synapses périphériques de la grenouille, a une durée plus longue: le temps de montée est d’environ 2-6 ms et le temps de désintégration est d’environ 30-90 ms, selon le colorant calcique utilisé23,24. Pour mesurer des processus rapides à l’aide de colorants fluorescents, des caméras CCD ou CMOS sont généralement utilisées, avec des matrices CCD rapides et sensibles. Cependant, ces caméras présentent l’inconvénient d’une faible résolution, limitée par la taille des éléments sensibles de la matrice25,26,27,28. Les caméras les plus rapides avec une sensibilité suffisante pour enregistrer à la fois les potentiels d’action et les transitoires de calcium en réponse à la stimulation à basse fréquence des cellules ont une fréquence de balayage de 2 000 Hz et une matrice d’une dimension de 80 x 8029. Pour obtenir des signaux avec une résolution spatiale plus élevée, la microscopie confocale est utilisée, surtout s’il est nécessaire d’évaluer certains changements volumétriques dans le signal30,31,32. Mais il faut garder à l’esprit que la microscopie confocale a une vitesse de balayage élevée en mode balayage linéaire, mais il existe encore des limitations importantes à la vitesse d’enregistrement des processus rapides lors de la construction d’une image spatiale33. Il existe des microscopes confocaux basés sur des disques de Nipkow rotatifs (microscopie à balayage à fente) et des scanners multipoints, qui ont une vitesse de balayage plus élevée. En même temps, ils sont inférieurs aux microscopes confocaux classiques dans le filtrage d’images confocales (diaphonie de trous d’épingle pour les microscopes avec un disque de Nipkow)32,34,35. L’imagerie confocale avec balayage par résonance peut également fournir une résolution spatio-temporelle élevée requise pour des mesures temporelles élevées36. Toutefois, il faut tenir compte du fait que l’enregistrement de faibles réponses fluorescentes à une vitesse de balayage élevée lors de l’utilisation de scanners à résonance nécessite des détecteurs très sensibles tels que les détecteurs hybrides36.

Cet article présente une méthode permettant d’augmenter la résolution temporelle des signaux enregistrés avec la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) tout en maintenant la résolution spatiale37. La méthode actuelle est un développement ultérieur des méthodes décrites précédemment et transférées à la plate-forme LSCM38,39,40. Cette approche ne nécessite pas de modifications du matériel du microscope et est basée sur l’application d’un algorithme pour enregistrer des signaux fluorescents évoqués périodiquement avec un décalage temporel par rapport au moment de la stimulation.

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Protocole

Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux de releveur auris longus (m. LAL) provenant de souris BALB/C (20-23 g, 2-3 mois)41. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université fédérale de Kazan et de l’Université médicale de Kazan, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental répondait aux exigences de la directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes et a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Kazan.

1. Préparation des solutions Ringer’s et Filing

  1. Préparer la solution de Ringer pour le muscle de mammifère en mélangeant les ingrédients suivants: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) et glucose (11 mM). Faire des bulles à travers la solution avec 95%d’O2 et 5% de CO 2 et ajuster son pH à 7,2-7,4 en ajoutant HCl/NaOH si nécessaire.
  2. Préparez la solution de chargement du colorant.
    1. Préparer la solution HEPES (10 mM) avec un pH compris entre 7,2 et 7,4. 500 μg de colorant commercial sont fournis dans un flacon de 500 μL. Dissoudre le colorant dans 14 μL de la solution HEPES pour obtenir une concentration de colorant de 30 mM. Bien agiter et centrifuger jusqu’à dissolution totale.
    2. Diluer la solution de l’indicateur Ca2+ avec la solution HEPES jusqu’à 1 mM de concentration. Conserver au congélateur (-20 °C) et éviter l’exposition à la lumière.

2. Procédure de chargement du colorant

NOTE: La procédure de chargement du colorant est effectuée conformément au protocole de chargement à travers le moignon nerveux, adapté des protocoles précédemment publiés 19,42,43,44,45,46.

  1. Disséquer le muscle LAL selon la procédure de dissection pour cette préparation telle que décrite dans les protocoles précédemment publiés47,48.
    1. Fixez le tissu légèrement étiré (pas plus de 30% de la longueur initiale) dans la boîte de Petri recouverte d’élastomère avec de fines broches en acier inoxydable et ajoutez la solution de Ringer jusqu’à ce que le muscle soit complètement couvert.
      REMARQUE : La boîte de Petri a été préremplie d’élastomère conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparer la pipette de remplissage
    1. À l’aide d’un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux), préparez une micropipette avec une pointe fine qui est aussi tranchante que possible pour les enregistrements intracellulaires. Utilisez des capillaires sans filaments internes (1,5 mm de diamètre extérieur et 0,86 ou 1,10 mm de diamètre intérieur).
    2. Détacher l’embout de la micropipette après avoir entaillé la conicité avec un abrasif, en laissant l’embout ouvert à environ 100 μm de diamètre. Polir la pointe vers le bas pour limiter le moment où le diamètre intérieur passe de >80 μm à 12-13 μm. Fixez un tube en silicone d’un côté de la pipette de remplissage et une seringue (sans aiguille) de l’autre côté.
  3. Sous un stéréomicroscope, trouvez l’endroit où le tronc nerveux se transforme en branches nerveuses séparées. Placez la pipette de remplissage avec le tube monté et la seringue sur la boîte de Petri à l’aide de cire. Déplacez l’embout de la pipette jusqu’à ce qu’il se trouve au-dessus du nerf.
  4. Avec de fins ciseaux, coupez le nerf près de la fibre musculaire, en laissant un petit morceau du moignon nerveux d’environ 1 mm de long. Aspirez doucement le moignon nerveux avec une solution de Ringer, sans le pincer, dans l’extrémité de la pipette de remplissage. Retirez le tube en silicone de la pipette de remplissage.
  5. Prélever une certaine quantité de la solution de chargement de colorant (~0,3 μL) à l’aide d’une seringue avec un long filament. Ce volume correspond à environ 3 cm du filament.
    REMARQUE: Dans un premier temps, il est nécessaire de fabriquer un filament à partir d’une pointe de pipette d’un volume de 10 μL en tirant sur le feu à l’aide d’une lampe à alcool ou d’un brûleur à gaz.
  6. Insérez délicatement l’embout du filament avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage. Relâchez le mélange directement sur le moignon nerveux. Incuber la préparation à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min.
  7. Après cela, rincer la préparation avec la solution fraîche de Ringer et incuber à 25 °C jusqu’à 2 heures dans un bécher en verre avec 50 ml (ou plus) de solution de Ringer (la préparation doit être recouverte de la solution). Pendant ce temps, le colorant atteindra les synapses.

3. Capture vidéo avec microscopie confocale

REMARQUE : L’enregistrement des transitoires calciques est effectué à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSCM) (voir le tableau des matériaux). Pour enregistrer les transitoires rapides de calcium, un protocole original permettant d’enregistrer des signaux avec une résolution spatiale et temporelle suffisante a été utilisé. La méthode a été décrite en détail dans la publication d’Arkhipov et al37. Le microscope était équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x (1,00 NA). La raie laser de 488 nm a été atténuée à une intensité de 10% et la fluorescence d’émission a été recueillie de 503 à 558 nm.

  1. Montez la préparation dans la chambre expérimentale revêtue d’élastomère de silicium et fixez-la, légèrement étirée, avec un jeu de micro-aiguilles en acier. Rincer abondamment la préparation avec la solution de Ringer.
    REMARQUE : Une simple chambre expérimentale de perfusion sur mesure en verre organique avec le fond de la chambre recouvert d’un élastomère (préparé conformément aux instructions du fabricant; voir le tableau des matériaux) a été utilisée. La chambre dispose d’un tube d’alimentation en solution. La solution est pompée à l’aide d’une aiguille de seringue, montée sur un support magnétique (voir le tableau des matériaux). En tant que chambre expérimentale, une boîte de Petri pourrait être utilisée (comme celle utilisée pour l’incubation de la préparation) mais avec des tubes d’alimentation et d’aspiration attachés.
  2. Installez une électrode d’aspiration qui sera utilisée pour stimuler le nerf.
    REMARQUE: La construction de l’électrode est similaire à ce qui a été publié dans l’article de 2015 par Kazakov et al49. Placez et fixez l’électrode en l’épilant à côté du bain. Déplacez l’embout près du moignon nerveux et aspirez-le dans l’électrode.
  3. Montez la chambre de préparation sur l’étage du microscope et placez les raccords d’entrée et de sortie dans la chambre.
  4. Pour effectuer la préparation, utilisez un système simple entraîné par gravité. Allumez la pompe d’aspiration de perfusion pour retirer l’excès de solution.
  5. Branchez l’électrode d’aspiration stimulante dans un stimulateur électrique et assurez-vous que les contractions musculaires se produisent après les stimuli. Voir rubrique 3.9-3.12 pour les conditions de stimulation et l’enregistrement.
  6. Remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer avec de la d-tubocurarine (10 μM).
    REMARQUE: Cette solution aide à prévenir les contractions musculaires. Des inhibiteurs spécifiques de la D-tubocurarine ou de l’alpha-bungarotoxine des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine sur la membrane postsynaptique bloqueraient complètement ou partiellement les contractions musculaires50. En outre, pour prévenir les contractions musculaires, des bloqueurs spécifiques des canaux sodiques postsynaptiques tels que la μ-conotoxine GIIIB pourraient être utilisés51.
  7. Allumez la pompe d’aspiration de perfusion et démarrez la perfusion de la préparation avec la solution de Ringer contenant de la d-tubocurarine.
  8. Définissez les paramètres d’imagerie dans le logiciel LSCM comme suit.
    1. Dans le logiciel LSCM (LAS AF; voir Tableau des matériaux), choisissez Électrophysiologie.
      REMARQUE: Dans ce mode, lorsqu’une image est capturée au point temporel, une impulsion de synchronisation est envoyée au stimulateur à l’aide de la boîte de déclenchement. Cela permet de générer un potentiel d’action dans la préparation (Figure 1; unité de stimulation).
    2. Sélectionnez Mode d’acquisition. Pour déclencher le stimulateur à l’aide de l’impulsion de synchronisation du microscope, dans les paramètres du menu Tâche , sélectionnez les paramètres de déclenchement . Définissez le champ Trigger Out On Frame sur le canal out1 .
    3. Utilisez les paramètres suivants: Mode de numérisation: XYT, Fréquence de balayage: 1400 Hz, Facteur de zoom: 6.1, Trou d’épingle: complètement ouvert. Assurez-vous que le mode X bidirectionnel transdirectionnel séquentiel est activé.
    4. Définissez le temps minimum pour former une image à 52 ms et les images à collecter dans une vidéo brute à 20 images.
      REMARQUE: Ces paramètres permettent la capture d’image avec une résolution de 128 x 128 pixels tout en prenant une seule image toutes les 52 ms.
    5. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser argon à 488 nm avec 8% de puissance de sortie.

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma de la configuration expérimentale. 1. Microscope confocal à balayage laser (LSCM). 2. Module de synchronisation de LSCM (boîte de déclenchement). 3. Stimulateur. 4. Unité d’isolement. 5. L’échantillon biologique. 6. Électrode d’aspiration pour la stimulation électrique du nerf. 7. Systèmes de perfusion (7a: réservoir de perfusat, 7b: compte-gouttes, 7c: régulateur de débit, 7d: flacon à vide). Les flèches pointent vers la direction de propagation de l’impulsion de synchronisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Appuyez sur le bouton Mode Live pour passer en mode Live , ce qui permet d’obtenir un aperçu des bornes nerveuses chargées avec le colorant.

figure-protocol-2
Figure 2 : Nerf et bornes de souris chargés avec l’indicateur Ca2+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Unité de stimulation
    NOTE: Dans ce travail, le stimulateur décrit dans l’article de Land et al.52 a été utilisé. Cet appareil permet de régler les paramètres temporels de stimulation via le logiciel MatLab.
    1. Créez un nouveau fichier, collez le code de l’article mentionné ci-dessus dans la fenêtre de code MatLab et enregistrez le fichier. Cliquez sur Exécuter, de sorte qu’une fenêtre avec les paramètres de stimulation apparaît. Définissez le délai et la durée du stimulus.
      NOTE: Le délai détermine la résolution temporelle du signal fluorescent reconstitué. L’impulsion électrique d’une durée de 0,2 ms est retardée, puis envoyée à l’unité d’isolement. Ce dernier forme l’amplitude et la polarité de l’impulsion stimulante et isole électriquement l’objet biologique de l’appareil d’enregistrement.
    2. Pour stimuler le nerf, sélectionnez l’amplitude supramaximale de l’impulsion stimulante (25% à 50% supérieure à l’intensité de stimulation maximale nécessaire pour activer toutes les fibres nerveuses).
      REMARQUE: La méthode présentée est basée sur un algorithme spécial pour les enregistrements de signaux fluorescents rapides uniques utilisant LSCM avec le balayage minimisé. À chaque étape de l’algorithme développé, le signal fluorescent enregistré est décalé par rapport au précédent par un intervalle de temps plus court que le balayage du microscope. La valeur des décalages temporels détermine la résolution temporelle du signal requis. Le nombre d’étapes (décalages) dans l’algorithme dépend de la résolution temporelle requise et de la résolution temporelle d’origine. Avec cette méthode d’enregistrement, la stimulation de la préparation est effectuée avec une fréquence de 0,25 Hz.
  2. En mode Live, recherchez le retour sur investissement et obtenez la meilleure mise au point. Exécutez le logiciel d’acquisition de données.
  3. Déplacez le délai sur le stimulateur de 2 ms de moins par rapport à la valeur précédente et exécutez le logiciel d’acquisition de données.
  4. Répétez l’étape 3.11 26 fois pour acquérir 26 séquences, chaque séquence étant décalée de 2 ms par rapport à la précédente.

4. Traitement vidéo

NOTE: Une série d’images vidéo acquises par le microscope confocal est exportée au format TIFF avec le logiciel libre LAS X (voir Tableau des matériaux). Cette série a été divisée en cadres et exportée dans un dossier. Pour générer la séquence d’images avec une résolution temporelle plus élevée, le logiciel ImageJ, qui dispose d’un code initial ouvert pour l’analyse et le traitement des données, a été utilisé. L’algorithme de traitement des signaux est représenté schématiquement à la figure 3.

figure-protocol-3
Figure 3 : Schéma de compilation d’un fichier vidéo haute résolution (2 ms sur image) à partir de fichiers vidéo originaux avec une faible résolution temporelle (52 ms sur image). Les fichiers vidéo originaux et les signaux correspondants sont colorés en noir, magenta et vert. Le fichier vidéo compilé et le signal résultant sont colorés en rouge. Le schéma de droite, ligne par ligne, montre les images vidéo obtenues avec un microscope confocal. À gauche, les signaux de fluorescence correspondants changent par rapport au retour sur investissement sélectionné. La ligne supérieure est formée image par image à partir des images reçues selon le schéma. Le résultat est une image vidéo composée de l’ensemble du tableau d’images de sorte qu’il y a un délai de 2 ms entre les images au lieu de 52 ms. Chaque ligne correspond à un décalage du signal de stimulation par (n - 1) * t, où t est le décalage temporel (2 ms) et n est le nombre d’itérations de décalage. k indique le nombre d’images dans les fichiers vidéo originaux (lignes 2-4) et dépend de la durée du signal enregistré. Dans ce cas, pour enregistrer un signal d’une durée de 1 s, il est nécessaire de sélectionner k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms). t0 est le délai requis avant la stimulation. Pour calculer le nombre d’itérations de décalage n, la résolution temporelle initiale entre les images (52 ms) doit être divisée par la résolution temporelle requise (2 ms). Dans ce cas, n = 26, ce qui correspond à 26 balayages enregistrés. À la suite des manipulations effectuées, une image vidéo composée de n * k = 520 images est obtenue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Exécutez le logiciel LAS X. Ouvrez le projet qui a été créé lors de l’exécution de l’expérience. Cliquez sur Exporter, puis sur Enregistrer sous pour enregistrer les images au format .tiff dans le dossier de destination.
  2. Exécutez le logiciel ImageJ. Cliquez sur Fichier > Importer > séquence d’images.
  3. Dans la fenêtre Ouvrir la séquence d’images , choisissez le dossier de destination et ouvrez la première image.
  4. Dans la fenêtre Options de séquence, dans le champ Image de départ, définissez le numéro d’image sur 1 pour la première image. Dans le champ Incrément, définissez la valeur égale au nombre d’images dans l’enregistrement initial du signal (20 pour le cas présent) et cliquez sur OK.
  5. Pour enregistrer le fichier généré des premières images assemblées dans un dossier séparé, cliquez sur Fichier > Enregistrer > dossier.
  6. Répétez les étapes 4.3 à 4.5 pour les 19 images suivantes. Dans la fenêtre Options de séquence , définissez le numéro d’image correspondant dans le champ Image de départ .
  7. Pour générer la vidéo haute résolution complète, assemblez toutes les images. Pour ce faire, cliquez sur Fichier > Importer > séquence d’images et sélectionnez 1 dans les champs Image de départ et Incrément . Le résultat sera la vidéo finale avec une résolution temporelle accrue. Enregistrez le fichier dans .tiff ou tout autre format approprié.

5. Analyse vidéo

REMARQUE: Dans ImageJ, sélectionnez ROI et arrière-plan. Soustrayez l’arrière-plan du retour sur investissement. Les données sont représentées par le rapport, (ΔF / F 0 - 1) * 100%, où F0 est l’intensité de la fluorescence au repos et ΔF est l’intensité de la fluorescence pendant la stimulation.

  1. Cliquez sur Image > Stacks > Tools > Stack Sorter. Ensuite, cliquez sur Outils d’analyse > > Gestionnaire de retour sur investissement.
  2. Faites glisser et déposez le fichier .tiff enregistré à l’étape 4.7 dans la fenêtre ImageJ. Agrandissez l’image pour une meilleure vue. Pour améliorer la visualisation de l’image, cliquez sur Image > Ajuster > Luminosité/Contraste > Auto. Cette étape n’affectera pas les données.
  3. Placez l’arrière-plan près de la terminaison nerveuse en dessinant le retour sur investissement. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement. Calculez l’arrière-plan en cliquant sur Plus > Multi Mesure. Copiez les valeurs moyennes, collez-les dans le tableur et calculez la moyenne.
  4. Soustrayez la valeur moyenne calculée des piles en cliquant sur Traiter > Principal > Soustraire. Entrez la valeur.
  5. Dessinez le ROI autour d’une terminaison nerveuse via une ligne polygonale. Ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement.
  6. Mesurer l’intensité de la terminaison nerveuse : Cliquez sur Plus > Multi Mesure. Copiez les valeurs moyennes et collez-les dans le tableur.
  7. Calculez le décalage moyen des signaux.
    REMARQUE: Utilisez les points correspondants en fonction du délai avant la stimulation. Cette étape établit la valeur F0 qui sera utilisée dans les calculs ultérieurs.
  8. Divisez les valeurs du signal par la valeur de décalage moyenne.
    REMARQUE: Après cette étape, le signal ne contient pas la contribution du fond et de la fluorescence brute aux valeurs d’amplitude pour le retour sur investissement sélectionné.
  9. Soustrayez 1 des valeurs obtenues à l’étape 5.8, puis multipliez par 100 %.
  10. Tracez un graphique de Ca2+- transitoire et calculez l’amplitude.

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Résultats

Après chargement de la préparation avec un colorant selon la technique présentée, la plupart des synapses situées à proximité du moignon nerveux présentaient un niveau de fluorescence suffisant (voir Figure 2). Après chargement de la préparation avec le colorant et application de la méthode décrite d’enregistrement et de traitement de l’image, on a obtenu des transitoires calciques avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée (voir figure 4). Le calcium t...

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Discussion

La méthode de chargement d’un colorant sensible au Ca2+ dans les terminaisons nerveuses de souris à travers le moignon nerveux et d’enregistrement d’un transitoire calcique rapide à l’aide d’un microscope confocal est présentée dans cet article. À la suite de la mise en œuvre de cette méthode de charge, la plupart des synapses situées près du moignon nerveux avaient un niveau de fluorescence suffisant pour permettre l’enregistrement de l’entrée du calcium dans les terminaisons nerveuses en réponse à la stimula...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les études de fluorescence de ces travaux ont été réalisées avec le soutien financier de la subvention de la Fondation scientifique russe (projet n ° 19-15-00329). La méthode a été développée grâce au financement de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La recherche a été développée avec l’utilisation de l’équipement du Centre fédéral de recherche « Kazan Scientific Center of RAS ». Les auteurs tiennent à remercier le Dr Victor I. Ilyin pour la lecture critique de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Verre capillaireClark Electromedical instruments, UKGC150-10
Système de microscope confocal et multiphotonique Leica TCS SP5 MPLeica Microsystems , Heidelberg, Allemagne
Extracteur de micropipette flamboyant/brun P 97Sutter Instrument, USAP-97
Régulateur de débitKD Medical GmbH Hospital Products, AllemagneKD REGKit de perfusion jetable avec régulateur de débit
HEPESSigma-Aldrich, USAH0887100mL
Système d’éclairage Leica CLS 150XLeica Microsystems, Allemagne
ImageJNational Institutes of Health, USAhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF softwareLeica Microsystems, Heidelberg, Allemagne
Leica Microsystems, Heidelberg, Allemagnehttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Support magnétique avec tube d’aspirationBIOSCIENCE TOOLS, USAMTH-S
Microspin FV 2400Biosan, LettonieBS-010201-AAA
Minutien PinsOutils de sciences fines, Canada26002-20
Multi-spin MSC 3000Biosan, LettonieBS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1pentapotassium salt Sondes moléculaires, États-UnisO6806500 &mu ; g
PipetteBiohit, Russie7202100.5-10 & micro ; L
Pointe de pipetteBiohit, Russie78134910 & micro ; L
Pâte à modelerProducteur
Aiguilles hypodermiques à usage uniqueBbraun100 Sterican0.4× ; Tableur 40 mm
Microsoft, États-UnisMicrosoft Office Excel
Stéréomicroscope, Leica M80Leica Microsystems, Allemagne
Électrode d’aspirationKazakov A. ÉLECTRODE D’ASPIRATION SIMPLE POUR LA STIMULATION ÉLECTRIQUE D’OBJETS BIOLOGIQUES / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Revue internationale de recherche.  ;- 2015. - N° 9 (40) Partie 3. - P. 13-16.http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 élastomèreDow Corning, USA
Seringueproducteur0,5 mL
Seringueproducteur60 mL
local local local

Références

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