Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.
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Article de méthode
Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’estimation du taux de calcium présynaptique est une tâche clé dans l’étude de la transmission synaptique, car l’entrée de calcium dans la cellule présynaptique déclenche une cascade d’événements conduisant à la libération de neurotransmetteurs. De plus, les changements dans les niveaux de calcium présynaptique médient l’activité de nombreuses protéines intracellulaires et jouent un rôle important dans la plasticité synaptique. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives. La jonction neuromusculaire est un modèle approprié pour étudier la plasticité synaptique, car elle n’a qu’un seul type de neurotransmetteur. Cet article décrit la méthode de chargement d’un colorant sensible au calcium à travers le faisceau nerveux coupé dans les terminaisons nerveuses motrices des souris. Cette méthode permet l’estimation de tous les paramètres liés aux changements intracellulaires du calcium, tels que le taux de calcium basal et le calcium transitoire. Étant donné que l’afflux de calcium de l’extérieur de la cellule dans les terminaisons nerveuses et sa liaison / déliaison au colorant sensible au calcium se produisent dans un délai de quelques millisecondes, un système d’imagerie rapide est nécessaire pour enregistrer ces événements. En effet, les caméras à haute vitesse sont couramment utilisées pour l’enregistrement des changements rapides du calcium, mais elles ont des paramètres de faible résolution d’image. Le protocole présenté ici pour l’enregistrement transitoire du calcium permet une très bonne résolution spatio-temporelle fournie par la microscopie confocale.
Introduction
Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante ....
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Protocole
Des expériences ont été réalisées sur des préparations isolées de muscles nerveux de releveur auris longus (m. LAL) provenant de souris BALB/C (20-23 g, 2-3 mois)41. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université fédérale de Kazan et de l’Université médicale de Kazan, conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental répondait aux exigences de la directive 86/609/CEE du Conseil des Communautés européennes et a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Kazan.
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Résultats
Après chargement de la préparation avec un colorant selon la technique présentée, la plupart des synapses situées à proximité du moignon nerveux présentaient un niveau de fluorescence suffisant (voir Figure 2). Après chargement de la préparation avec le colorant et application de la méthode décrite d’enregistrement et de traitement de l’image, on a obtenu des transitoires calciques avec la résolution spatiale et temporelle souhaitée (voir figure 4). Le calcium t.......
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Discussion
La méthode de chargement d’un colorant sensible au Ca2+ dans les terminaisons nerveuses de souris à travers le moignon nerveux et d’enregistrement d’un transitoire calcique rapide à l’aide d’un microscope confocal est présentée dans cet article. À la suite de la mise en œuvre de cette méthode de charge, la plupart des synapses situées près du moignon nerveux avaient un niveau de fluorescence suffisant pour permettre l’enregistrement de l’entrée du calcium dans les terminaisons nerveuses en réponse à la stimula.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les études de fluorescence de ces travaux ont été réalisées avec le soutien financier de la subvention de la Fondation scientifique russe (projet n ° 19-15-00329). La méthode a été développée grâce au financement de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La recherche a été développée avec l’utilisation de l’équipement du Centre fédéral de recherche « Kazan Scientific Center of RAS ». Les auteurs tiennent à remercier le Dr Victor I. Ilyin pour la lecture critique de ce manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Verre capillaire | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Système de microscope confocal et multiphotonique Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Allemagne | ||
| Extracteur de micropipette flamboyant/brun P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Régulateur de débit | KD Medical GmbH Hospital Products, Allemagne | KD REG | Kit de perfusion jetable avec régulateur de débit |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Système d’éclairage Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Allemagne | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Allemagne | ||
| Leica Microsystems, Heidelberg, Allemagne | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | ||
| Support magnétique avec tube d’aspiration | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Lettonie | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Outils de sciences fines, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Lettonie | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 | pentapotassium salt Sondes moléculaires, États-Unis | O6806 | 500 &mu ; g |
| Pipette | Biohit, Russie | 720210 | 0.5-10 & micro ; L |
| Pointe de pipette | Biohit, Russie | 781349 | 10 & micro ; L |
| Pâte à modeler | Producteur | ||
| Aiguilles hypodermiques à usage unique | Bbraun | 100 Sterican | 0.4× ; Tableur 40 mm |
| Microsoft, États-Unis | Microsoft Office Excel | ||
| Stéréomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems, Allemagne | ||
| Électrode d’aspiration | Kazakov A. ÉLECTRODE D’ASPIRATION SIMPLE POUR LA STIMULATION ÉLECTRIQUE D’OBJETS BIOLOGIQUES / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Revue internationale de recherche. ;- 2015. - N° 9 (40) Partie 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 élastomère | Dow Corning, USA | ||
| Seringue | producteur | 0,5 mL | |
| Seringue | producteur | 60 mL |
Références
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
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Réimpressions et autorisations
