Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.
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Article de méthode
qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes
Dans cet article
Résumé
Résumé
La PCR en temps réel (qPCR) est une technique remarquablement sensible et précise qui permet d’amplifier des quantités infimes de cibles d’acides nucléiques à partir d’une multitude d’échantillons. Il a été largement utilisé dans de nombreux domaines de recherche et a atteint une application industrielle dans des domaines tels que le diagnostic humain et la sélection de caractères dans les cultures d’organismes génétiquement modifiés (OGM). Cependant, la qPCR n’est pas une technique à l’épreuve des erreurs. Le mélange de tous les réactifs en un seul mélange maître distribué par la suite sur 96 puits d’une plaque qPCR ordinaire peut entraîner des erreurs de l’opérateur telles qu’un mélange incorrect des réactifs ou une distribution inexacte dans les puits. Ici, une technique appelée gélification est présentée, par laquelle la majeure partie de l’eau présente dans le mélange maître est remplacée par des réactifs qui forment un mélange sol-gel lorsqu’ils sont soumis à un vide. En conséquence, les réactifs qPCR sont efficacement conservés pendant quelques semaines à température ambiante ou quelques mois à 2-8 °C. Les détails de la préparation de chaque solution sont présentés ici avec l’aspect attendu d’une réaction gélifiée conçue pour détecter l’ADN satellite de T. cruzi (ADNsatellite). Une procédure similaire peut être appliquée pour détecter d’autres organismes. Le démarrage d’une qPCR gélifiée est aussi simple que de retirer la plaque du réfrigérateur, d’ajouter les échantillons à leurs puits respectifs et de commencer l’exécution, réduisant ainsi le temps de configuration d’une réaction sur plaque complète au temps nécessaire pour charger les échantillons. De plus, les réactions PCR gélifiées peuvent être produites et contrôlées pour la qualité par lots, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs courantes de l’opérateur lors de l’exécution de réactions PCR de routine.
Introduction
La maladie de Chagas a été découverte au début du 20èmesiècle dans les régions rurales du Brésil, où la pauvreté était répandue 1,2. Même aujourd’hui, la maladie continue d’être liée aux déterminants sociaux et économiques de la santé dans les Amériques. La maladie de Chagas est biphasique, comprenant une phase aiguë et une phase chronique. Elle est causée par une infection par le parasite Trypanosoma cruzi, transmise par des insectes vecteurs, des transfusions sanguines par voie congénitale ou l’ingestion orale d’aliments contaminés 3,4.
Le diagnostic de la maladie de Chagas peut être effectué par l’observation des symptômes cliniques (en particulier le signe Romaña), la microscopie par frottis sanguin, la sérologie et les tests moléculaires tels que la PCR en temps réel (qPCR) ou l’amplification isotherme 4,5,6,7,8,9. Les symptômes cliniques et la microscopie par frottis sanguin sont utilisés dans les cas suspects d’infections aiguës, tandis que la recherche d’anticorps est utilisée comme outil de dépistage chez les patients asymptomatiques. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité, il a été suggéré que la qPCR soit utilisée comme outil de surveillance pour les patients chroniques, pour les patients en phase aiguë subissant un traitement mesurant la charge parasitaire dans le sang et comme marqueur de substitution de l’échec thérapeutique 6,8,10,11,12 . Bien que plus sensibles et spécifiques que les tests actuellement disponibles, la qPCR est effectivement empêchée d’être connue comme outil de diagnostic dans les régions défavorisées du monde entier en raison de l’exigence de températures de congélation pour le transport et le stockage13,14,15.
Pour contourner cet obstacle, des techniques de conservation telles que la lyophilisation et la gélification ont été explorées16,17. Bien que la lyophilisation assure la conservation pendant des années, elle nécessite des réactifs spécialement fabriqués sans la présence de glycérol, qui est couramment utilisé pour la stabilisation / conservation des enzymes18. Bien qu’il ait été démontré que la gélification assure la conservation pendant des mois, elle permet l’utilisation de réactifs réguliers19. La solution de gélification comprend quatre composants, chacun ayant des rôles spécifiques dans le processus: les sucres tréhalose et mélézitose protègent les biomolécules pendant le processus de dessiccation en réduisant les molécules d’eau libre dans la solution, le glycogène produit une matrice protectrice plus large et l’acide aminé lysine est utilisé comme piégeur de radicaux libres pour inhiber les réactions oxydantes entre le carboxyle de la biomolécule, groupes amino et phosphate. Ces composants définissent un mélange sol-gel qui empêche la perte de la structure tertiaire ou quaternaire pendant le processus de dessiccation, aidant ainsi à maintenir l’activité des biomolécules lors de la réhydratation19. Une fois stabilisées à l’intérieur des tubes de réaction, les réactions peuvent être conservées pendant quelques mois à 2-8 °C ou quelques semaines à 21-23 °C au lieu des -20 °C normales. Cette approche a déjà été intégrée dans des tests conçus pour aider à diagnostiquer des maladies telles que la maladie de Chagas, le paludisme, la leishmaniose, la tuberculose et la cyclosporose13,14,15,20.
Le présent travail décrit toutes les étapes pour préparer les solutions requises pour la procédure de gélification, les pièges du processus et l’aspect final attendu d’une qPCR gélifiée prête à l’emploi à l’intérieur de bandes à huit tubes. Le même protocole peut être adapté pour les tubes simples ou les plaques à 96 puits. Enfin, la détection de l’ADN de T. cruzi sera présentée sous forme de contrôle.
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Protocole
1. Préparation des solutions mères et du mélange de gélification
REMARQUE : Quatre solutions mères seront préparées (400 mg/mL de mélezitose, 400 mg/mL de tréhalose, 0,75 mg/mL de lysine et 200 mg/mL de glycogène) et mélangées selon la proportion indiquée au tableau 1 pour produire le mélange de gélification. Bien que le protocole décrive 10 ml de production de solutions mères, il peut être adapté à des volumes plus ou moins élevés.
- Solution de mélezitose
- Peser 4 g de mélezitose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vorter à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume final à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 4 g de mélezitose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vorter à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de tréhalose
- Peser 4 g de tréhalose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 4 g de tréhalose dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de glycogène
- Peser 2 g de glycogène dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Maintenir la solution au repos à 2-8 °C pendant 8-12 h car la solubilisation du glycogène produit beaucoup de bulles (Figure 1). Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 6 mois.
- Peser 2 g de glycogène dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau exempte de nucléases et vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Solution de lysine
- Peser 7,5 mg de lysine dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau sans nucléase. Vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
NOTE: Plus d’eau peut être ajoutée pour faciliter la solubilisation, en prenant soin de ne pas dépasser le volume final (voir ci-dessous). - Porter le volume à 10 mL avec de l’eau sans nucléase et filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C pendant une période allant jusqu’à 6 mois.
- Peser 7,5 mg de lysine dans un tube en plastique de 15 mL, ajouter 6 mL d’eau sans nucléase. Vortex à la vitesse maximale de l’instrument jusqu’à ce que la poudre soit solubilisée.
- Mélange de gélification (GM)
- Dans un tube en plastique de 50 mL, mélanger les volumes de solutions mères conformément au tableau 1.
- Mélanger les réactifs par dix inversions bout à bout du tube.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’effectuer une étape de filtration si cette étape est effectuée dans une hotte de sécurité à flux laminaire. Si cette étape n’est pas effectuée dans un environnement propre, filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm avant de la transférer dans une fiole ambrée. - Transférer la solution dans une fiole ambrée ou la protéger de la lumière. Étiqueter et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à 3 mois.
REMARQUE : À titre d’étape de contrôle de la qualité pour la préparation du mélange de gélification, s’assurer que les valeurs mesurées de pH, de conductivité et de densité se situent dans les plages suivantes : pH 5,55-6,66; conductivité 0,630-0,757 mS/cm; et densité 1,08-1,11 g/cm3. Toutes les mesures doivent être effectuées à 25 °C.
2. Préparation du mélange maître qPCR pour la gélification
REMARQUE: Dans cette étape, le mélange maître qPCR pour la gélification est préparé. Par conséquent, de l’eau n’est pas ajoutée au mélange, mais le mélange de gélification est ajouté (tableau 2).
- Décongeler les réactifs dans un contenant réfrigéré. Mélanger les réactifs dans un tube de 1,5 mL conformément au tableau 2. Un exemple de réaction avec un volume final de 25 μL contenant 5 μL d’échantillon d’ADN est montré ici.
NOTE: L’échantillon d’ADN n’est pas ajouté au mélange à cette étape; il est utilisé ici uniquement pour calculer les volumes finaux de chaque réactif du mélange maître qPCR. Des échantillons d’ADN doivent être ajoutés juste avant le début de l’exécution (voir l’étape 4 ci-dessous).
3. Gélification des réactifs sur les cuves de réaction
- Multiplier de façon appropriée les volumes indiqués au tableau 2 pour la préparation d’une bande à huit tubes ou d’une plaque à 96 puits.
- Piper 18,5 μL du mélange maître de gélification illustré au tableau 2 sur chaque puits de réaction.
REMARQUE : Ce volume représente les volumes de mélange d’oligonucléotides, de tampon PCR et de mélange de gélification utilisés pour une réaction (selon le tableau 2) et varie en fonction de la concentration des réactifs et du volume nécessaire pour une réaction. Le volume final du mélange principal de gélification est différent du volume d’un mélange maître régulier parce que de l’eau n’est pas ajoutée. - Placez les tubes ou la plaque dans le support conducteur de chaleur (p. ex. aluminium) à l’intérieur du four à vide.
REMARQUE: Le support thermoconducteur est facultatif. L’opérateur doit s’assurer que le fond des tubes est en contact avec l’étagère du four à vide pour permettre un équilibre thermique rapide. - Placez un sac d’argile bentonite pour deux assiettes de 96 puits.
NOTE: Les sacs d’argile bentonite sont utilisés pour absorber l’eau retirée du mélange principal de gélification par la pression différentielle exercée par le vide. Les sacs d’argile bentonite se sont avérés inutiles pour moins de deux plaques de 96 puits. - Soumettre les tubes/plaques contenant le mélange principal de gélification à trois cycles de vide (30 ± 5 mBar) de 30 min chacun, en alternance avec la libération sous vide jusqu’à ce que la pression atmosphérique soit atteinte (900-930 mBar), sous température contrôlée (30 °C ± 1 °C) (figure 2).
REMARQUE : L’instrument utilise un logiciel pour contrôler les paramètres, et un exemple du cycle est illustré à la figure 2. L’utilisateur doit créer le profil pour l’exécution, en indiquant les paramètres choisis. - Une fois le cycle terminé, vérifier la gélification des réactifs dans les tubes/plaques en s’assurant que le volume est visiblement réduit (Figure 3) et que les liquides ne bougent pas en tapotant les tubes/plaques avec les doigts.
REMARQUE : Si aucune gélification ne se produisait, la solution éclaboussait les parois des tubes lorsque les tubes sont taraudés (figure 3). - Sceller et conserver les tubes/plaques à 2-8 °C pendant 8-12 h avant utilisation.
4. Utilisation d’une qPCR gélifiée
- Retirez la bande ou la plaque tubulaire du réfrigérateur et ouvrez-la dans un poste de travail pour la manipulation des échantillons. Ajouter 15 μL d’eau exempte de nucléases dans chaque cuve de réaction.
NOTE: Le volume de réactifs gélifiés est considéré comme étant d’environ 5 μL. Ainsi, avec le volume de l’échantillon d’ADN (voir ci-dessous), le volume de réaction final est de 25 μL. - Ajouter 5 μL d’échantillon d’ADN.
REMARQUE: N’importe quel modèle d’ADN de qualité qPCR peut être utilisé. Dans le présent travail, l’ADN a été extrait de 10 épimastigotesdeT. cruzi (souche Dm28c) et a été dilué en série à un rapport de 1:10 à l’aide d’un tampon TE. - Scellez les tubes/plaques et passez à l’équipement de votre choix. Exécutez l’expérience et procédez à une analyse régulière des données.
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Résultats
Trois des réactifs qui forment le mélange de gélification sont facilement solubilisés lors d’un tourbillon vigoureux. Cependant, le glycogène nécessite un tourbillon minutieux pour s’assurer que la poudre a été complètement solubilisée. Malheureusement, un tourbillon vigoureux produit beaucoup de bulles, ce qui rend difficile la détermination du volume réel de la solution (Figure 1A-B). Par conséquent, il est essentiel de laisser la solution de glycogène rep...
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Discussion
Ces dernières années ont mis en évidence la nécessité de trouver des technologies plus sensibles et spécifiques pour aider à diagnostiquer les maladies tropicales et négligées. Bien qu’importants pour le contrôle épidémiologique, les tests parasitologiques (microscopie optique) et sérologiques ont des limites, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et l’applicabilité au point de service. Les techniques d’amplification de l’ADN telles que la PCR, l’amplification isotherme et les variations respectives sont utili...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à Aline Burda Farias pour l’assistance technique avec le four à vide, ainsi qu’à l’administration de l’Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brésil) pour avoir permis l’accès audit équipement. Ces travaux ont été partiellement financés par la subvention CNPq 445954/2020-5.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sacs d’argile bentonite (activé) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelone, Espagne) | 026157/STD | À ne pas confondre avec les packs de gel de silice |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 Lysine | |
| Acros Organic | Cat# 365650250 | ||
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Eau | sans nucléasesfournisseur | ||
| Oligonucléotides | fournisseur | ||
| PCR mastermix | fournisseur privilégié ou Instituto de Biologia Molecular do Paraná ; (IBMP, Curitiba, Brésil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycleur | préféré | ||
| pour four à vide | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi | ADN de parasites cultivés en interne, ou acheté auprès de fournisseurs accrédités tels que ATCC | ||
| Four sous vide | Memmert Gmbh | VO-400 |
Références
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Réimpressions et autorisations
