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Article de méthode

Étude spectrométrique de masse à multiples facettes des neuropeptides chez Callinectes sapidus

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DOI :

10.3791/63322

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31 mai 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La caractérisation par spectrométrie de masse des neuropeptides fournit des informations de séquence, de quantification et de localisation. Ce flux de travail optimisé est non seulement utile pour les études de neuropeptides, mais aussi pour d’autres peptides endogènes. Les protocoles fournis ici décrivent la préparation des échantillons, l’acquisition de la SEP, l’analyse de la SEP et la génération de bases de données de neuropeptides à l’aide de l’imagerie LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MS.

Résumé

Les neuropeptides sont des molécules de signalisation qui régulent presque tous les processus physiologiques et comportementaux, tels que le développement, la reproduction, l’apport alimentaire et la réponse aux facteurs de stress externes. Pourtant, les mécanismes biochimiques et l’ensemble des neuropeptides et leurs rôles fonctionnels restent mal compris. La caractérisation de ces peptides endogènes est entravée par l’immense diversité au sein de cette classe de molécules de signalisation. De plus, les neuropeptides sont bioactifs à des concentrations 100x - 1000x inférieures à celles des neurotransmetteurs et sont sujets à la dégradation enzymatique après libération synaptique. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil analytique très sensible qui permet d’identifier, de quantifier et de localiser les analytes sans connaissances a priori approfondies. Il est bien adapté pour profiler globalement les neuropeptides et aider à la découverte de nouveaux peptides. En raison de la faible abondance et de la grande diversité chimique de cette classe de peptides, plusieurs méthodes de préparation d’échantillons, paramètres d’acquisition de SEP et stratégies d’analyse de données ont été adaptés à partir de techniques protéomiques pour permettre une caractérisation optimale des neuropeptides. Ici, des méthodes sont décrites pour isoler les neuropeptides de tissus biologiques complexes pour la caractérisation, la quantification et la localisation de séquences à l’aide de la chromatographie liquide (LC)-MS et de la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)-MS. Un protocole pour la préparation d’une base de données de neuropeptides à partir du crabe bleu, Callinectes sapidus, un organisme sans informations génomiques complètes, est inclus. Ces flux de travail peuvent être adaptés pour étudier d’autres classes de peptides endogènes chez différentes espèces à l’aide d’une variété d’instruments.

Introduction

Le système nerveux est complexe et nécessite un réseau de neurones pour transmettre des signaux dans tout un organisme. Le système nerveux coordonne l’information sensorielle et la réponse biologique. Les interactions complexes et alambiquées impliquées dans la transmission du signal nécessitent de nombreuses molécules de signalisation différentes telles que les neurotransmetteurs, les stéroïdes et les neuropeptides. Comme les neuropeptides sont les molécules de signalisation les plus diverses et les plus puissantes qui jouent un rôle clé dans l’activation des réponses physiologiques au stress et à d’autres stimuli, il est intéressant de déterminer leur rôle spécifique dans ces processus physiologiques. La fonction des neuropeptides est liée à leur structure en acides aminés, qui détermine la mobilité, l’interaction des récepteurs et l’affinité1. Des techniques telles que l’histochimie, qui est importante parce que les neuropeptides peuvent être synthétisés, stockés et libérés dans différentes régions du tissu, et l’électrophysiologie ont été utilisées pour étudier la structure et la fonctiondes neuropeptides 2,3,4, mais ces méthodes sont limitées par le débit et la spécificité pour résoudre la grande diversité de séquences des neuropeptides.

La spectrométrie de masse (SEP) permet l’analyse à haut débit de la structure et de l’abondance des neuropeptides. Cela peut être effectué par différentes techniques MS, le plus souvent la chromatographie liquide-ionisation par électropulvérisation MS (LC-ESI-MS)5 et la désorption/ionisation laser assistée par matrice MS (MALDI-MS)6. En utilisant des mesures de masse de haute précision et la fragmentation de la SEP, la SEP offre la possibilité d’attribuer la séquence d’acides aminés et le statut de modification post-traductionnelle (PTM) aux neuropeptides de mélanges complexes sans connaissance a priori pour aider à déterminer leur fonction 7,8. En plus de l’information qualitative, la SEP permet l’information quantitative des neuropeptides grâce à la quantification sans étiquette (LFQ) ou à des méthodes basées sur l’étiquette telles que le marquage isotopique ou isobare9. Les principaux avantages de LFQ comprennent sa simplicité, son faible coût d’analyse et la diminution des étapes de préparation des échantillons, ce qui peut minimiser la perte d’échantillons. Cependant, les inconvénients de LFQ comprennent l’augmentation des coûts de temps d’instrument, car il nécessite plusieurs répétitions techniques pour traiter les erreurs quantitatives de la variabilité d’une exécution à l’autre. Cela conduit également à une diminution de la capacité à quantifier avec précision les petites variations. Les méthodes basées sur l’étiquette sont soumises à des variations moins systématiques, car plusieurs échantillons peuvent être marqués différemment à l’aide d’une variété d’isotopes stables, combinés en un seul échantillon et analysés simultanément par spectrométrie de masse. Cela augmente également le débit, bien que les étiquettes isotopiques puissent prendre beaucoup de temps et être coûteuses à synthétiser ou à acheter. La complexité spectrale des spectres de masse à balayage complet (MS1) augmente également à mesure que le multiplexage augmente, ce qui diminue le nombre de neuropeptides uniques pouvant être fragmentés et donc identifiés. Inversement, le marquage isobare n’augmente pas la complexité spectrale au niveau MS1, bien qu’il présente des défis pour les analytes de faible abondance tels que les neuropeptides. Comme la quantification isobare est effectuée au niveau des spectres de masse d’ions fragmentaires (MS2), les neuropeptides de faible abondance peuvent ne pas être en mesure d’être quantifiés car des composants de matrice plus abondants peuvent être sélectionnés pour la fragmentation et ceux sélectionnés peuvent ne pas avoir une abondance suffisamment élevée pour être quantifiés. Avec le marquage isotopique, la quantification peut être effectuée sur chaque peptide identifié.

En plus de l’identification et de la quantification, les informations de localisation peuvent être obtenues par MS par le biais de l’imagerie MALDI-MS (MALDI-MSI)10. En raster un laser sur une surface d’échantillon, les spectres MS peuvent être compilés dans une image de carte thermique pour chaque valeur m/z . La cartographie de l’intensité du signal neuroptidique transitoire dans différentes régions à travers les conditions peut fournir des informations précieuses pour la détermination de la fonction11. La localisation des neuropeptides est particulièrement importante car la fonction des neuropeptides peut différer selon l’emplacement12.

Les neuropeptides se trouvent en plus faible abondance in vivo que d’autres molécules de signalisation, telles que les neurotransmetteurs, et nécessitent donc des méthodes sensibles pour la détection13. Cela peut être réalisé par l’élimination des composants de la matrice d’abondance plus élevée, tels que les lipides11,14. Des considérations supplémentaires pour l’analyse des neuropeptides doivent être prises en compte par rapport aux flux de travail protéomiques courants, principalement parce que la plupart des analyses neuropeptidomiques omettent la digestion enzymatique. Cela limite les options logicielles pour l’analyse des données sur les neuropeptides, car la plupart ont été construites avec des algorithmes basés sur des données protéomiques et des correspondances de protéines informées par la détection de peptides. Cependant, de nombreux logiciels tels que PEAKS15 sont plus adaptés à l’analyse des neuropeptides en raison de leurs capacités de séquençage de novo. Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour l’analyse des neuropeptides, de la méthode d’extraction à l’analyse des données sur la SEP.

Les protocoles décrits ici comprennent des méthodes de préparation d’échantillons et de marquage isotopique diméthylique, d’acquisition de données et d’analyse de données de neuropeptides par LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MSI. Grâce aux résultats représentatifs de plusieurs expériences, l’utilité et la capacité de ces méthodes à identifier, quantifier et localiser les neuropeptides des crabes bleus, Callinectes sapidus, sont démontrées. Pour mieux comprendre le système nerveux, des systèmes modèles sont couramment utilisés. De nombreux organismes n’ont pas de génome entièrement séquencé disponible, ce qui empêche la découverte complète de neuropeptides au niveau peptidique. Afin d’atténuer ce défi, un protocole d’identification de nouveaux neuropeptides et d’extraction de transcriptomes afin de générer des bases de données pour les organismes sans informations complètes sur le génome est inclus. Tous les protocoles présentés ici peuvent être optimisés pour des échantillons de neuropeptides de n’importe quelle espèce, ainsi que pour l’analyse de tous les peptides endogènes.

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Protocole

Tous les prélèvements de tissus décrits ont été effectués conformément aux directives de l’Université du Wisconsin-Madison.

1. Analyse LC-ESI-MS des neuropeptides

  1. Extraction et dessalement des neuropeptides
    1. Avant l’acquisition tissulaire, préparer du méthanol acidifié (acMeOH) (90:9:1 MeOH:eau:acide acétique) comme décrit aupoint 16.
    2. Prélever le tissu cérébral du crustacé17 et utiliser une pince pour placer immédiatement un tissu chacun dans un tube de 0,6 mL contenant 20 μL d’acMeOH.
      REMARQUE: Les protocoles de dissection tissulaire varient considérablement selon les animaux et les différents types de tissus. Le lecteur est renvoyé au protocole17 pour une description détaillée sur la façon de disséquer le tissu cérébral et plusieurs autres types de tissus du crustacé. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation (idéalement dans les 6 mois). Les volumes décrits sont utilisés pour un seul cerveau de Callinectes sapidus. Les volumes doivent être mis à l’échelle en fonction de la taille des tissus. Les tissus peuvent être congelés immédiatement sans solvant, bien que cela ne soit pas recommandé car les enzymes protéolytiques endogènes ne seront pas inhibées et resteront actives, bien qu’à un rythme plus lent à froid.
    3. Ajouter 150 μL d’acMeOH à l’échantillon. Réglez le temps de sonication total à 24 s, le temps d’impulsion à 8 s, le temps de pause à 15 s et l’amplitude à 50% sur un homogénéisateur à ultrasons et homogénéisez les échantillons sur la glace.
      REMARQUE: Il existe différents systèmes d’homogénéisation disponibles. Ajustez les paramètres et les conditions en fonction du type d’échantillon et de l’équipement.
    4. Centrifuger l’échantillon à 4 °C à 20 000 x g pendant 20 min. À l’aide d’une pipette, transférer le surnageant dans un tube et le sécher dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
      REMARQUE: Les échantillons séchés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation (idéalement dans les 6 mois). Le chauffage du concentrateur à vide doit être effectué avec prudence. Alors que la chaleur raccourcit le temps de séchage, l’échantillon doit être retiré du concentrateur immédiatement après que tout le liquide s’est évaporé pour minimiser la dégradation peptidique. Pour éviter cela, le chauffage peut être omis de cette étape et de toutes les étapes suivantes.
    5. Pour le dessalement, reconstituer l’échantillon de tissu extrait dans 20 μL d’acide formique (AF) à 0,1 %, puits vortex et sonicate dans un bain-marie à température ambiante pendant 1 min.
      REMARQUE: Il existe différents matériaux de dessalement disponibles. Ajustez les solutions et les volumes en fonction de l’identité de la résine et de la quantité de neuropeptides. La quantité totale de peptides peut être estimée à l’aide d’un test commercial de quantification des peptides (voir tableau des matériaux).
    6. Appliquer 0,5 μL d’échantillon sur une bande de pH pour confirmer que le pH < 4. Si le pH est plus élevé, ajouter 1 μL aliquotes de 10% FA jusqu’à ce que le pH < 4.
    7. Suivez le protocole du fabricant pour le dessalage18. Préparer une solution mouillante contenant 100 μL d’acétonitrile à 50 % (ACN), une solution d’équilibrage contenant 100 μL de FA à 0,1 %, une solution de lavage contenant 100 μL de 0,1 % d’AF et des solutions d’élution contenant 20 μL d’ACN à 25 %/0,1 % d’AF, 20 μL d’ACN/0,1 % d’AF à 50 % et 20 μL d’ACN/0,1 % d’AF à 75 %.
    8. Obtenez une pointe de dessalement de 10 μL avec de la résine C18 (voir tableau des matériaux).
    9. Placez la pointe de dessalement sur une pipette de 20 μL réglée sur 15 μL. Une fois que la pointe de dessalement est mouillée, empêchez l’air de passer à travers en gardant la pipette enfoncée lorsqu’elle est hors solution jusqu’à ce qu’elle soit jetée.
    10. Aspirer la pointe 3x avec une solution mouillante et 3x avec une solution d’équilibrage. Aspirer dans l’échantillon 10x suivi d’un lavage 3x en solution de lavage, en jetant chaque lavage. Éluez en aspirant 10x dans chacune des solutions d’élution par ordre d’augmentation de l’ACN.
      REMARQUE: Les fractions d’élution peuvent être séparées ou combinées pour des analyses ultérieures.
    11. Jeter la pointe de dessalement usagée et sécher les neuropeptides élués dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
      REMARQUE: Cela peut être conservé à -80 ° C jusqu’à utilisation (idéalement dans les 6 mois).
  2. Marquage isotopique des neuropeptides dans l’extrait tissulaire
    REMARQUE: Cette étape est facultative et n’est utilisée que lorsque la quantification est souhaitée.
    1. Préparer la solution de marquage diméthylique isotopique 2-plex dans une hotte : 1 % CH2OH2 (13,5 μL de bouillon 37 % poids/poids (p. %) dans une solution aqueuse dans 486,5 μL d’eau), 1 % CH2OD2 (25 μL de bouillon 20 % en poids de solution dans 475 μL d’eau) et 0,03 M de pyridine borane (3,75 μL de solution mère 8 M dans 996,25 μL d’eau).
      ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique, toutes les solutions doivent donc être conservées dans une hotte ventilée. Portez des gants, un manteau de laboratoire, une protection oculaire et des chaussures imperméables. Les lentilles de contact ne doivent pas être portées lorsque vous travaillez avec ce matériau.
      REMARQUE: Il existe différents réactifs isotopiques; sélectionnez les canaux appropriés en fonction du type d’échantillon et du nombre de canaux d’étiquetage souhaités.
    2. Dissoudre l’extrait de neuropeptide brut dans 10 μL d’eau et soniquer pendant 10 min.
    3. Ajouter 10 μL d’une solution de formaldéhyde isotopique différente (c.-à-d. CH2 OH2,CH2OD2, etc.) à chaque condition expérimentale différente à mesurer quantitativement. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    4. Ajouter 10 μL de pyridine borane de 0,03 M à chaque tube d’échantillonnage. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    5. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 °C au bain-marie.
    6. Retirer les échantillons du bain-marie et ajouter 10 μL de bicarbonate d’ammonium de 100 mM. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    7. Mélanger les échantillons marqués pour un échantillon de 2-plex et sécher les neuropeptides dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
    8. Dessalez les neuropeptides marqués en reperformant les étapes 1.1.5 - 1.1.10 et stockez-les jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’acquisition de données.
  3. Acquisition de données
    1. Reconstituer les neuropeptides dessalés séchés dans 12 μL de 3 % D’ACN/0,1 % d’AF, bien vortex, sonicer au bain-marie à 37 °C pendant 1 min et centrifuger brièvement à 2 000 x g. Transférer chaque échantillon dans des flacons d’échantillonneur automatique.
      REMARQUE: Ajuster le volume de l’échantillon en fonction de la quantité de neuropeptide à une concentration d’environ 1 μg de peptide par μL. La quantité totale de peptide peut être estimée à l’aide d’un test commercial de quantification des peptides (voir la table des matériaux).
    2. Utilisez un échantillonneur automatique pour injecter 1 μL d’échantillon dans un instrument nano-LC-MS/MS à haute résolution (voir tableau des matériaux).
    3. Utilisez une colonne C18 en phase inversée (RP) d’environ 15 cm de long (voir tableau des matériaux) pour faire fonctionner l’échantillon avec 0,1 % d’AF dans l’eau en phase mobile A et 0,1 % d’AF en ACN en phase B mobile. Exécutez les échantillons avec un gradient de 3 % à 95 % de B à un taux de 300 nL/min pendant plus de 11 min.
    4. Pour l’instrument MS utilisé ici, utilisez des conditions MS courantes de 2,00 kV pour la tension de pulvérisation et de 275 °C pour la température capillaire.
    5. Acquérir des spectres MS dans la gamme de 200 à 2 000 m/z avec une résolution de 60 000, une cible de contrôle automatique du gain (AGC) de 1 x 106 et un temps d’injection d’ions (IT) maximal de 150 ms.
    6. Sélectionnez les 15 ions les plus intenses (intensité minimale de 3,2 x 104) pour la fragmentation par dissociation de collision (HCD) à plus haute énergie en utilisant une énergie de collision normalisée de 30, une fenêtre d’isolement de 2,0 m/z, une résolution de 15 000, une cible AGC de 2 x 105 et une IT maximale de 250 ms.
    7. Définissez une fenêtre d’exclusion dynamique de 30 s. Excluez les ions avec une charge de 1 ou ≥ 8 et les ions avec des états de charge non reconnus.
  4. Identification et quantification des neuropeptides
    REMARQUE: De nombreux logiciels pour la recherche dans les bases de données et la quantification des peptides (open source et commerciaux) sont disponibles. Ici, PEAKS Studio (logiciel de protéomique)15 sera utilisé.
    1. Effectuez une recherche dans la base de données en suivant les étapes décrites aux points 1.4.2 à 1.4.6.
    2. Créez un nouveau projet et ajoutez les données LC-MS en sélectionnant None pour l’enzyme, Orbitrap pour l’instrument, HCD pour le fragment et acquisition dépendante des données (DDA) pour l’acquisition.
      REMARQUE : Sélectionnez les paramètres appropriés en fonction des paramètres d’acquisition de données.
    3. Sélectionnez Identifications et sélectionnez Correct Precursor [DDA] et Mass uniquement.
    4. Sélectionnez Recherche dans la base de données et définissez une tolérance d’erreur de 20,0 ppm en utilisant la masse monoisotopique pour la masse précurseur et 0,02 Da pour la masse ionique fragmentaire, Aucune pour le type d’enzyme, Non spécifique pour le mode digest, 100 pour le clivage maximal manqué, et les PTM variables suivantes avec la variable maximale autorisée PTM par peptide de 3: Amidation, Oxydation (M), Pyro-glu de E, et Pyro-glu de Q.
    5. Sélectionnez la base de données des neuropeptides, estimez le taux de fausse découverte (FDR) avec la fusion de leurres.
      REMARQUE: L’erreur de tolérance de masse doit être ajustée pour correspondre aux données collectées. Utilisez la base de données appropriée pour le type d’exemple. Lorsqu’aucune enzyme n’est sélectionnée, le paramètre max de clivages manqués n’affecte pas la recherche. Toutefois, un grand nombre de clivages manqués est requis si le logiciel n’a pas le mode Digest non spécifié comme option.
    6. Si vous souhaitez une quantification sans étiquette, sélectionnez Quantification, sélectionnez Sans étiquette et définissez une tolérance d’erreur de 20,0 ppm et une tolérance de temps de rétention de 1,0 min.
    7. Effectuer la quantification des ions précurseurs si l’étape 1.2 pour le marquage isotopique a été effectuée.
      1. Sélectionnez Quantification, sélectionnez Quantification des ions précurseurs, utilisez une plage de temps de rétention de 1,0 min et utilisez un seuil FDR de 1 %.
      2. Sélectionnez une méthode de quantification prédéfinie ou personnalisée dans le menu déroulant Sélectionner une méthode .
      3. Pour créer une méthode personnalisée, cliquez sur Configuration de la fenêtre > > Méthode Label Q > Nouveau. Nommez la nouvelle méthode et sélectionnez Quantification des ions précurseurs pour Type de méthode. Sélectionnez Ajouter une ligne et sélectionnez modification dans la liste Options PTM.
      4. Ajoutez les données LC-MS et sélectionnez Condition de référence pour être la modification sur les neuropeptides de l’état de contrôle de l’expérience.
    8. Évaluez les résultats de la recherche comme décrit aux étapes 1.4.9 à 1.4.11.
    9. Filtrez les résultats dans l’onglet récapitulatif pour les peptides et les protéines avec -10lgP ≥ 20, sélectionnez ≥ 1 peptide unique et sélectionnez la case intitulée With Significant Peptides.
    10. Évaluez les résultats de recherche dans la base de données où Protein.csv représente les identifications de neuropeptides et Peptide.csv représente les identifications de fragments de neuropeptides.
    11. Inspectez la recherche dans la base de données pour les scores de protéines et de peptides, la précision de la masse et la couverture de séquence.
      REMARQUE: Chaque logiciel de recherche de base de données utilise des algorithmes de notation uniques et peut devoir être évalué en conséquence. Les identifications peuvent être évaluées en inspectant manuellement les spectres observés pour les peptides identifiés contenant la série complète d’ions fragments.

2. Analyse de repérage MALDI-MS des neuropeptides

  1. Préparation des échantillons
    1. Suivez l’étape 1.1 ou les étapes 1.1 à 1.2 si la quantification est souhaitée, à l’exclusion de l’étape 1.2.8 (le dessalement après marquage isotopique n’est pas nécessaire avant l’analyse MALDI-MS).
    2. Reconstituer les neuropeptides dessalés séchés dans 5 μL de 0,1 % FA, bien vortex, soniquer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et centrifuger brièvement à 2 000 x g.
    3. Pour repérer les neuropeptides dans les tissus des crustacés, préparer 150 mg/mL d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) dans du méthanol (MeOH) à 50 % / 0,1 % FA (v/v) comme matrice.
    4. Pipeter une gouttelette d’échantillon de 3 μL sur un film hydrophobe (voir Tableau des matériaux) et pipeter 3 μL de la matrice directement sur la gouttelette de l’échantillon. Pipette de haut en bas pour mélanger.
    5. Pipette 1 μL du mélange matriciel de l’échantillon 1:1 dans un puits de la plaque cible en acier inoxydable MALDI. Utilisez la pointe de la pipette pour étaler chaque mélange sur les bords du puits de l’échantillon. L’échantillon doit toucher les bords de la gravure du puits pour faciliter une distribution uniforme (Figure 4A).
    6. Spot 1 μL de mélange calibrant:matrice 1:1 (mélange d’étalonnage commercial ou personnalisé, matériaux polymères (c.-à-d. phosphore rouge dissous dans meOH) ou ions d’amas matriciels communs)12 dans un puits près de l’échantillon.
      REMARQUE: Le phosphore rouge n’a pas besoin d’être mélangé avec la matrice avant de le repérer.
  2. Acquisition de données
    1. Insérez la plaque cible contenant des points d’échantillon séchés dans l’instrument MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (voir tableau des matériaux).
    2. Pour la matrice DHB, réglez la puissance du laser sur 95 %, sélectionnez Gain optimal automatique du détecteur et Mode de mouvement du porteur d’échantillon intelligent - Échantillon complet . Acquérir des spectres MS compris entre 200 et 3200 m/z et ajouter plusieurs spectres de chaque point ensemble pour augmenter le rapport signal/bruit des neuropeptides.
      REMARQUE: Optimisez le pourcentage de puissance laser, le gain du détecteur et sélectionnez le mode de mouvement du porteur d’échantillon approprié afin que chaque acquisition couvre à peu près tout le spot et que les acquisitions ultérieures ne remontent pas aux positions précédentes.
    3. Calibrez l’instrument.
      REMARQUE: Ajustez la plage de masse pour englober la gamme de neuropeptides souhaitée.
  3. Analyse des données
    1. Ouvrez le fichier MALDI-MS dans le logiciel d’analyse de données (voir Table des matériaux) et cliquez sur Soustraction de base pour le logiciel utilisé ici.
    2. Effectuez la sélection des pics en cliquant sur Rechercher une liste de masse. S’il y a trop peu de pics, modifiez manuellement la liste de masse en sélectionnant Modifier la liste de masse et cliquez sur les pics du spectre pour les ajouter à la liste de masse.
    3. Effectuez une correspondance de masse précise en comparant la liste de masse avec la base de données de neuropeptides contenant des valeurs [M + H] + m / z (± erreur de 200 ppm). 
      REMARQUE : Les adduits de sel courants, tels que [M+K]+, [M+Na]+ et [M+NH4]+, doivent également être inclus dans la liste précise des cibles de correspondance de masse.
    4. Pour vérifier les pics identifiés, générez une liste de m/z d’intérêt et effectuez des expériences MS/MS.

3. Analyse par imagerie MALDI-MS des neuropeptides

  1. Préparation des échantillons
    REMARQUE: Les étapes d’intégration et de sectionnement ne sont pas nécessaires pour les tissus trop minces pour être sectionnés.
    1. Remplir un demi-gobelet de cryostat avec de la gélatine (37 °C, 100 mg/mL dans de l’eau désionisée) et laisser se solidifier à température ambiante. Gardez les restes de gélatine liquide au chaud dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Prélever le tissu neuronal souhaité de l’animal et utiliser une pince pour tremper immédiatement le tissu dans un tube de 0,6 mL contenant de l’eau désionisée pendant 1 s.
      REMARQUE: Reportez-vous à l’étape 1.1.2 NOTE pour la dissection du tissu neuronal.
    3. Placez le tissu sur la gélatine solide et remplissez le reste de la tasse de cryostat avec de la gélatine liquide. Utilisez des pinces pour positionner le tissu.
    4. Placez la tasse de cryostat sur une surface plane et congelez-la avec de la glace carbonique.
      REMARQUE: Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation (idéalement dans les 6 mois).
    5. Pour la préparation du sectionnement, séparez l’échantillon incorporé à la gélatine du moule de cryostat en coupant le moule.
    6. Montez le tissu incorporé sur un mandrin de cryostat en pipetant une gouttelette d’eau désionisée de 1 mL sur le mandrin et en appuyant immédiatement sur le tissu incorporé sur la gouttelette.
    7. Une fois congelé, pipettez plus d’eau désionisée autour du tissu pour le fixer davantage au mandrin. Effectuez ces étapes à l’intérieur de la boîte de cryostat (voir Tableau des matériaux) réglée à -20 °C.
    8. Couper le tissu à une épaisseur approximative d’une cellule (8-20 μm selon le type d’échantillon) et décongeler monter chaque section sur une lame de verre recouverte d’oxyde d’indium-étain (ITO) en plaçant un côté de la lame près de la section et en plaçant un doigt de l’autre côté de la lame pour réchauffer lentement le verre et permettre à la section de coller à la lame.
      REMARQUE: Les sections de tissu peuvent également être décongelées en ramassant un bord de la gélatine avec une pince à épiler (refroidie à -20 ° C), en la plaçant sur la lame en verre revêtue d’ITO et en plaçant un doigt de l’autre côté de la lame pour réchauffer lentement le verre et permettre à la section de coller à la glissière.
    9. Repérez l’échantillon à utiliser comme calibrant (voir l’étape 2.1.6 pour les options d’étrier) en dessinant un petit cercle près de la section de tissu à l’aide d’un stylo hydrophobe et en repérant l’étrier à l’intérieur du cercle.
    10. Marquez chaque coin de la diapositive avec un stylo blanc avec une petite forme contenant des arêtes vives (c.-à-d. x) à utiliser comme points d’enseignement.
    11. Placez la glissière en verre dans la plaque de l’adaptateur de diapositive MALDI et effectuez une numérisation d’image optique haute résolution (≥2400 DPI) à l’aide d’un scanner.
    12. Matrice de pulvérisation sur la section de tissu à l’aide d’un pulvérisateur automatisé (voir le tableau des matériaux pour les détails et les instructions du pulvérisateur).
    13. Pour le MSI des neuropeptides dans les tissus des crustacés, utilisez 40 mg/mL de DHB dans 50 % de méthanol/0,1 % de FA (v/v) comme matrice, réglez la température de la buse à 80 °C, la vitesse à 1 250 mm/min, le débit à 0,1 mL/min, le nombre de passes à 12 et 30 s entre chaque passage pour le pulvérisateur automatique.
  2. Acquisition de données
    1. Insérez la plaque cible complètement séchée contenant des sections de tissu montées sur le dégel qui ont été pulvérisées avec la matrice.
    2. Configurez les paramètres du fichier d’acquisition d’imagerie MS de sorte que le diamètre du laser soit inférieur à la taille de l’étape raster.
    3. Chargez l’image optique numérisée et calibrez la plaque d’échantillonnage à l’aide des points d’apprentissage x. Définissez les zones tissulaires d’intérêt à mesurer légèrement plus grandes que la section tissulaire réelle pour inclure également les zones contenant uniquement de la matrice.
    4. Calibrez l’instrument et acquérez des spectres compris entre 200 et 3200 m/z. Ajustez la plage de masse pour englober la gamme de neuropeptides souhaitée.
  3. Analyse des données
    1. Pour traiter les données, importez le jeu de données d’imagerie MS dans le logiciel souhaité, sélectionnez un algorithme de suppression de base et normalisez les données à l’aide du nombre total d’ions.
      REMARQUE : La sélection de différents algorithmes de normalisation, tels que la médiane, la valeur quadratique moyenne racine (RMS) ou l’intensité d’une valeur m/z de référence, modifiera probablement la distribution spatiale de nombreuses valeurs m/z . Choisissez l’algorithme de normalisation le mieux adapté aux analytes souhaités.
    2. Pour générer une image pour chaque valeur m/z à partir d’une liste de pics théoriques, téléchargez un fichier CSV (valeurs séparées par des virgules) contenant les neuropeptides [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, etc. Obtenez des valeurs m/z en cliquant sur Fichier > Importer > liste de pics. Nommez la liste des pics.
    3. Pour estimer le seuil d’erreur ppm approprié, identifiez d’abord manuellement un pic de neuropeptide dans le spectre de la SEP et comparez-le avec la masse théorique du neuropeptide. Calculez l’erreur ppm et cliquez sur Fichier > Propriétés du fichier > Largeur d’intervalle et erreur ppm d’entrée.
    4. Sélectionnez la liste des pics dans le menu déroulant et cliquez sur Créer des images m/z pour chaque intervalle de la liste des pics.
    5. Enregistrez chaque image m/z en cliquant sur Enregistrer la capture d’écran de chaque image m/z.
      REMARQUE: L’identification présumée des neuropeptides peut être effectuée en identifiant des images m / z où le signal de l’analyte n’est localisé que dans le tissu et non dans la matrice environnante.
    6. Pour vérifier l’identité des pics, générez une liste de m/z d’intérêt et effectuez des expériences MS/MS.

4. Découverte de nouveaux neuropeptides putatifs à l’aide du séquençage de novo

  1. Effectuez les étapes 1.4.2 à 1.4.5.
  2. Exportez uniquement des peptides de novo.csv du logiciel PEAKS avec un score moyen de confiance locale (ALC) de ≥ 75.
    REMARQUE: Il existe de nombreux logiciels disponibles pour effectuer un séquençage de novo , chacun avec ses propres algorithmes de notation et doit être évalué en conséquence.
  3. Recherchez dans la liste des peptides des motifs de séquence connus indiquant des neuropeptides appartenant à des familles de neuropeptides spécifiques19.
    REMARQUE: Bien que les motifs soient généralement bien conservés dans toutes les espèces, les motifs recherchés doivent être sélectionnés en tenant compte de l’organisme échantillon.

5. Extraction de transcriptome pour les séquences de neuropeptides prédites

REMARQUE: Cette étape est facultative et n’est utilisée que pour ajouter à une base de données de neuropeptides existante ou créer une nouvelle base de données de neuropeptides.

  1. Choisissez une séquence d’acides aminés préprohormone connue qui vous intéresse et utilisez tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) pour rechercher une séquence de préprohormones de requête dans des bases de données telles que nr/nt, Refseq_genomes, EST et TSA.
    REMARQUE : Pour rechercher des séquences de requête dans une base de données de protéines, utilisez BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Sélectionnez l’organisme cible (ID de taxe) et modifiez les paramètres de l’algorithme Expect Threshold à 1000 pour inclure les alignements de score faible.
    2. Exécutez le programme BLAST , puis vérifiez les résultats pour des scores d’homologie élevés entre les séquences de requête et de sujet produisant des alignements significatifs. Enregistrez le fichier FASTA contenant la séquence nucléotidique.
      REMARQUE: S’il existe plusieurs séquences de sujets avec des scores d’homologie similaires, effectuez un alignement MAFFT pour affiner les séquences putatives20,21.
  2. Traduisez la séquence nucléotidique de préprohormone en séquences peptidiques de préprohormone à l’aide de l’outil Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Pour C. sapidus, sélectionnez Invertébré mitochondrial pour le code génétique.
  3. Vérifiez la séquence peptidique du signal et les sites de clivage des prohormones dans les séquences peptidiques à l’aide de SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    REMARQUE: L’homologie des schémas connus de traitement des préprohormones peut également être utilisée pour identifier les sites de clivage des prohormones. D’éventuelles modifications post-traductionnelles pour les peptides de signal peuvent être prédites si vous le souhaitez. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) peut être utilisé pour prédire l’état de sulfatation des résidus de tyrosine. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) peut être utilisé pour prédire la connectivité des liaisons disulfures.

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Résultats

Le flux de travail pour la préparation des échantillons et l’analyse de la SEP est illustré à la figure 1. Après la dissection du tissu neuronal, l’homogénéisation, l’extraction et le dessalement sont effectués pour purifier les échantillons de neuropeptides. Si une quantification isotopique basée sur l’étiquette est souhaitée, les échantillons sont ensuite étiquetés et dessalés à nouveau. L’échantillon résultant est analysé par LC-MS/MS pour l’identification et la quantification des neurope...

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Discussion

L’identification, la quantification et la localisation précises des neuropeptides et des peptides endogènes présents dans le système nerveux sont cruciales pour comprendre leur fonction23,24. La spectrométrie de masse est une technique puissante qui peut permettre d’accomplir tout cela, même dans des organismes sans génome entièrement séquencé. La capacité de ce protocole à détecter, quantifier et localiser les neuropeptides des tissus prélevés sur C. sapidus...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation (CHE-1710140 et CHE-2108223) et les National Institutes of Health (NIH) grâce à la subvention R01DK071801. A.P. a été soutenu en partie par la subvention de formation à l’interface chimie-biologie des NIH (T32 GM008505). N.V.Q. a été soutenu en partie par les National Institutes of Health, dans le cadre du Ruth L. Kirschstein National Research Service Award du National Heart Lung and Blood Institute au Centre de recherche cardiovasculaire de l’Université du Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. tient à remercier les subventions R56 MH110215, S10RR029531 et S10OD025084 des NIH, ainsi que le soutien financier d’une chaire Vilas Distinguished Achievement et d’une chaire Charles Melbourne Johnson avec un financement fourni par la Wisconsin Alumni Research Foundation et l’Université du Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
d’acide >
Optima LC/MS FisherChemicalA955-500
Borane, pyridine, Sigma-Aldrich, 179752
Bruker, mélange d’étalonnage peptidiqueBruker DaltonicsNC9846988
CapillairePolymicro1068150019pour fabriquer une colonne nano-flux (75 µ ; m diamètre intérieur x 360 & micro ; m diamètre extérieur)
Tasse cryostatSigma-AldrichE6032n’importe quelle tasse ou moule devrait fonctionner
  ; Tubes de microcentrifugationEppendorf30108434
FormaldéhydeSigma-Aldrich252549
Formaldéhyde - D2Sigma-Aldrich492620
Acide formique Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA117-50
GélatineDifco214340place dans 37 ° ; C Bain d’eau pour fondre
Stylo barrière hydrophobeVector Labs15553953
Lames de verre recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (ITO)TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0,8 mm (largeur x longueur x épaisseur)
Flacons LC-MSThermoTFMSCERT5000-30LVW
Méthanol Optima LC/MS GradeFisher ChemicalA456-500
ParafilmSigma-AldrichP7793Film hydrophobe
Bandes indicatrices de pHSupelco109450
Grappes de phosphore rougeSigma-Aldrich343242
Matériau C18 en phase inverseWaters186002350emballé manuellement dans une colonne nanoflow
Stylo Wite-outBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
Instruments and Tools
Système de pulvérisation matricielle automatique- M5HTX Technologies, LLC
Centrifugeuse - 5424 REppendorf05-401-205
Cryostat- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
DessiccantDessicante2088701
PinceWPI501764
MALDI plaque cible en acier inoxydableBruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µ ; L
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
Nettoyeur à ultrasonsBransonic2510R-MTHpour sonication
Homogénéisateur à ultrasonsFisher ScientificFB120110FB120 Sonic Dismembrator avec sonde CL-18
Pompe à vide - Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976pression ultime = 1 x 10-4 Torr
Vortex MixerCorning6775
Bain-marie (37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
Logiciel d’analyse de données
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMMES=tblastn& PAGE_
TYPE=BlastSearch& SHOW_
DEFAULTS=on& LINK_LOC
=blasthome
Matrice 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) < forte <> Chemical Optima Bicarbonate d’ammonium Sigma-Aldrich 9830 , , Delta

Références

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60(2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

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