Ce protocole décrit comment extraire la protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) du rein et du foie de souris. Les méthodes énumérées peuvent être adaptées à d’autres protéines d’intérêt et modifiées pour d’autres tissus.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) est le premier membre identifié de la superfamille FAH chez les eucaryotes, agissant comme oxaloacétate décarboxylase dans les mitochondries. Cet article présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes couvertes sont la chromatographie par échange ionique avec chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), la filtration sur gel préparatif et analytique avec FPLC et les approches protéomiques. Après l’extraction des protéines totales, la précipitation du sulfate d’ammonium et la chromatographie par échange ionique ont été explorées, et FAHD1 a été extrait via une stratégie séquentielle utilisant la chromatographie par échange ionique et par exclusion de taille. Cette approche représentative peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt (exprimées à des niveaux significatifs) et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent favoriser le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques.
Introduction
La protéine 1 eucaryote contenant le domaine FAH (FAHD1) agit sous forme d’oxaloacétate bifonctionnel (OAA), decarboxylase (ODx)1 et d’hydrolase acylpyruvate (ApH)2. Il est localisé dans les mitochondries2 et appartient à la vaste superfamille faH des enzymes 1,2,3,4,5,6. Bien que son activité ApH ne soit que d’une pertinence mineure, l’activité ODx de FAHD1 est impliquée dans la ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. Le rein de porc a été obtenu frais du supermarché local. Des tissus hépatiques ont été prélevés sur des souris de type sauvage C57BL6 conservées à l’Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche, sous la supervision de l’Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, couvert par l’autorisation éthique en tant que chef de projet délivrée en 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). L’entretien et l’utilisation des souris pour le projet sont couverts par l’autorisation éthique n ° 2020-0.242.978 du 5 mai 2020, délivrée par le ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La protéine FAHD1 a été extraite du rein du porc et du foie de souris à l’aide du protocole présenté. Pour les tissus de souris, plusieurs organes sont nécessaires pour obtenir plusieurs μg après l’étape finale de purification. Pour cette raison, cet article se concentre sur l’extraction de FAHD1 à partir de reins de porcs, ce qui est une expérience beaucoup plus exemplaire. L’extraction de FAHD1 du foie de souris est effectuée pour présenter les difficultés et les pièges possibles de ce protocole. Il est généralement re.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Étapes critiques du protocole
Il est essentiel de suivre les directives communes pour la manipulation des protéines, comme le travail sur la glace et à des conditions de pH et de sel modérées. L’utilisation d’inhibiteurs de la protéase est bénéfique pour la méthode, tandis que l’utilisation d’inhibiteurs du protéasome est fortement recommandée. La congélation et la décongélation de l’échantillon peuvent toujours entraîner une précipitation protéique (au moins partielle), de sorte que toute aliquote dé.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs sont très reconnaissants de l’assistance technique d’Ayse Öztürk et Eva Albertini. Les souris utilisées pour la génération de tissu hépatique ont été maintenues sous la supervision de Univ.-Doz. Dr Pidder Jansen-Dürr (Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; unités de filtration m | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0,22 & micro ; m, PES 33 mm, non stéroïde |
| 0,45 & micro ; unités de filtration m | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0,45 & micro ; m, PES 33 mm, non stérile |
| 15 mL Tubes Falcon | VWR | 734-0451 | Tubes centrifuges |
| 50 mL Tubes Falcon | VWR | 734-0448 | Tubes centrifuges |
| 96 puits Microplaque UV | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent à fond plat 96 plaques |
| puits Solution acrylamide/Bis (40 %, rapport 29:1) | BIO-RAD | #1610147 | 40 % acrylamide/bis-acrylamide, solution 29:1 (3,3 % de réticulant) pour couler des gels de polyacrylamide |
| et Auml ; Système KTA FPLC | GE HEALTHCARE Life Sciences / Cytiva-utilisant | le système FPLC de GE Healthcare ; différentes versions personnalisées existent ; ce travail a utilisé le "Ä ; Système KTA pure" | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | filtres centrifuges pour l’enrichissement des protéines ; filtre de masse moléculaire 10 kDa ; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | filtres centrifuges pour l’enrichissement des protéines ; 10 kDa filtre de masse moléculaire ; 4 mL |
| sulfate d’ammonium en poudre | MERCK | A4418 | sulfate d’ammonium pour la biologie moléculaire, &ge ; 99,0 % |
| d’ammonium, 98 % de catalyseur | MERCK | 215589 | pour la polymérisation du gel d’acrylamide. |
| Coomassie Bleu brillant R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Bleu brillant R 250 (C.I. 42660) pour l’électrophorèse Marque déposée d’Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 ° ; C) |
| Tubulure de dialyse membrane cellulosique | MERCK | D9277 | Membranes cellulosiques pour l’échange de tampons par dialyse. |
| Tubes Eppendof 1,5 mL | VWR | 525-1042 | Tubes microcentrifuges ; autoclave |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg Les colonnes préemballées sont destinées à la chromatographie d’exclusion stérique haute résolution des protéines recombinantes |
| Membrane PVDF Immun-Blot | BIO-RAD | #1620177 | Les membranes PVDF sont des membranes de transfert de protéines optimisées pour les applications fluorescentes et fluorescentes multiplexes. |
| Cellule de transfert électrophorétique Mini Trans-Blot | BIO-RAD | #1703930 | Utilisez la cellule Mini Trans-Blot pour le transfert rapide des gels préfabriqués et coulés à la main Mini-PROTEAN. |
| Cellule d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN Tetra pour mini-gels préfabriqués | BIO-RAD | #1658004 | système d’électrophorèse verticale à 4 gels, comprend un ensemble d’électrodes, un module de course compagnon, un réservoir, un couvercle avec câbles d’alimentation, un barrage tampon de mini-cellule. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | colonnes Mono Q sont des colonnes de chromatographie à fort échange d’anions pour l’analyse des protéines ou le polissage à petite échelle et à haute résolution des protéines. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | colonnes Mono S sont des colonnes de chromatographie à fort échange de cations pour l’analyse des protéines ou le polissage haute résolution à petite échelle des protéines. |
| Échelle protéique pré-colorée PageRuler, 10 à 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | Un mélange de 10 protéines colorées en bleu, orange et vert (10 à 180 kDa) à utiliser comme étalons de taille dans l’électrophorèse des protéines (SDS-PAGE) et le western blot. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | Un dosage des protéines à deux composants, de haute précision et compatible avec les détergents, pour la détermination de la concentration en protéines. |
| Sonificateur 250 ; Disrupteur cellulaire à ultrasons avec convertisseur | Branson-Nouveaux | modèles à https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf | |
| Immunoglobulines anti-lapin porcines/HRP (isolé par affinité) | Agilent Dako | P0399 | L’anticorps utilisé pour la conjugaison de la peroxydase de raifort réagit avec les immunoglobulines de lapin de toutes les classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(diméthylamino)éthane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tetramethylethylenediamine) est une molécule qui permet une polymérisation rapide des gels de polyacrylamide. |
| Rouleau de tube | - | Un rouleau rotateur de tube général ; par exemple un nouveau modèle à https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 | |
| Rotateur de | tubes | -- | Une roue de rotateur de tube général ; par exemple un nouveau modèle à https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX ; T 25 digital | IKA | 0003725000 | Nouveaux modèles à https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
Références
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
