La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris implique généralement un accès par les os du crâne et est guidée par des repères du crâne. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative pour cibler le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la cisterna magna qui repose sur la visualisation directe des repères du tronc cérébral.
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Article de méthode
Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris est généralement guidée par des repères crâniens. L’accès est ensuite obtenu par des trous de bavure percés à travers le crâne. Cette approche standard peut être difficile pour les cibles du tronc cérébral caudal et de la moelle cervicale supérieure en raison de défis anatomiques spécifiques, car ces sites sont éloignés des points de repère du crâne, ce qui entraîne une imprécision. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative via la cisterna magna qui a été utilisée pour cibler des régions discrètes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. La cisterna magna s’étend de l’os occipital à l’atlas (c’est-à-dire le deuxième os vertébral), est remplie de liquide céphalo-rachidien et est recouverte de dure-mère. Cette approche fournit une voie d’accès reproductible à certaines structures du système nerveux central (SNC) qui sont autrement difficiles à atteindre en raison de barrières anatomiques. En outre, il permet une visualisation directe des repères du tronc cérébral à proximité des sites cibles, augmentant ainsi la précision lors de l’administration de petits volumes d’injection dans des régions restreintes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Enfin, cette approche offre l’occasion d’éviter le cervelet, ce qui peut être important pour les études motrices et sensorimotrices.
Introduction
La chirurgie stéréotaxique standard pour cibler les sites cérébraux chez la souris1 implique généralement la fixation du crâne à l’aide d’un ensemble de barres auriculaires et d’une barre buccale. Les coordonnées sont ensuite estimées sur la base des atlas de référence 2,3 et des repères crâniens, à savoir bregma (le point où les sutures des os frontaux et pariétaux se rejoignent) ou lambda (le point où les sutures des os pariétaux et occipitaux se rejoignent; Figure 1A,B). Grâce à un trou de bavure dans le crâne au-dessus de la cible estimée, la région cible peut alors être atteinte, soit pour la livraison de microinjections, soit pour l’instrumentation avec des canules ou des fibres optiques. En raison de la variation de l’anatomie de ces sutures et des erreurs dans la localisation de bregma ou lambda 4,5, la position des points zéro par rapport au cerveau varie d’un animal à l’autre. Bien que les petites erreurs de ciblage, qui résultent de cette variabilité, ne soient pas un problème pour les cibles grandes ou proches, leur impact est plus important pour les petites zones d’intérêt éloignées des points zéro dans les plans antéropostérieur ou dorsoventral et / ou lors de l’étude d’animaux de taille variable en raison de l’âge, de la tension et / ou du sexe. Il existe plusieurs défis supplémentaires qui sont uniques pour la moelle oblongée et la moelle cervicale supérieure. Tout d’abord, de petits changements dans les coordonnées antéropostériennes sont associés à des changements significatifs des coordonnées dorsoventrales par rapport à la dure-mère, en raison de la position et de la forme du cervelet (Figure 1Bi)2,6,7. Deuxièmement, la moelle cervicale supérieure n’est pas contenue dans le crâne2. Troisièmement, la position inclinée de l’os occipital et la couche sus-jacente des muscles du cou2 rendent l’approche stéréotaxique standard encore plus difficile pour les structures situées près de la transition entre le tronc cérébral et la moelle épinière (Figure 1Bi). Enfin, de nombreuses cibles d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la corde cervicale sont petites2, nécessitant des injections précises et reproductibles 8,9.
Une approche alternative à travers la cisterna magna contourne ces problèmes. La cisterna magna est un grand espace qui s’étend de l’os occipital à l’atlas (Figure 1A, c’est-à-dire le deuxième os vertébral)10. Il est rempli de liquide céphalo-rachidien et recouvert dedure-mère 10. Cet espace entre l’os occipital et l’atlas s’ouvre lors de l’antéroflexion de la tête. On peut y accéder en naviguant entre les ventres appariés sus-jacents du muscle longus capitis, exposant la surface dorsale du tronc cérébral caudal. Les régions d’intérêt peuvent ensuite être ciblées en fonction des points de repère de ces régions elles-mêmes si elles sont situées près de la surface dorsale; ou en utilisant l’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le ventricule IV, comme point zéro pour que les coordonnées atteignent des structures plus profondes. Cette approche a été utilisée avec succès chez une variété d’espèces, y compris le rat11, le chat12, la souris 8,9 et le primate non humain13 pour cibler le groupe respiratoire ventral, la formation réticulaire médiale médullaire, le noyau du tractus solitaire, la zone postrema ou le noyau hypoglosse. Cependant, cette approche n’est pas largement utilisée car elle nécessite des connaissances en anatomie, une boîte à outils spécialisée et des compétences chirurgicales plus avancées par rapport à l’approche stéréotaxique standard.
Nous décrivons ici une approche chirurgicale étape par étape pour atteindre le tronc cérébral et la moelle cervicale supérieure via la cisterna magna, visualiser les points de repère, définir le point zéro (Figure 2) et estimer et optimiser les coordonnées cibles pour l’administration stéréotaxique de microinjections dans les régions discrètes du tronc cérébral et de la moelle épinière d’intérêt (Figure 3). Nous discutons ensuite des avantages et des inconvénients liés à cette approche.
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Protocole
L’auteur déclare que le protocole suit les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Préparation des instruments chirurgicaux et du cadre stéréotaxique
REMARQUE: La chirurgie est effectuée dans des conditions aseptiques. La stérilité est maintenue à l’aide de la technique de la pointe stérile.
- Installez le bras stéréotaxique avec une micropipette ou une seringue remplie d’un injectable de votre choix (virus adéno-associé (AAV) ou traceur conventionnel) sur le cadre stéréotaxique et préparez l’adaptateur de souris (Figure 2A).
- Préparez des instruments chirurgicaux autoclavés (table des matériaux) et placez-les sur une surface stérile.
2. Induction de l’anesthésie et préparation de la souris
- Allumez O2 à 0,5 L / min et réglez le vaporisateur isoflurane à 4,0, en vous assurant que le flux d’O2 est dans la boîte à induction.
ATTENTION : Assurez-vous que la boîte d’induction de l’isoflurane est placée dans une hotte et que l’isoflurane est récupéré loin du site chirurgical. - Placez la souris (mâle C57BL/6J âgé de 10 semaines) dans la chambre d’induction.
- Une fois que la respiration a ralenti, ouvrez la chambre d’induction et soulevez légèrement la souris. Utilisez des tondeuses pour enlever les poils de la tête aux épaules.
3. Positionnement de la souris dans le cadre stéréotaxique
- Déplacez la souris sur le cadre stéréotaxique et placez le nez dans un cône de nez flexible. À ce stade, assurez-vous que le flux d’O2 est maintenant dirigé vers le cône du nez.
- Placez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille uniquement.
REMARQUE: Assurez-vous que les barres d’oreille sont égales et que la tête est de niveau. - Antéroflex la tête de la souris à un angle de 90° en guidant manuellement le nez. Pour sécuriser cette position, placez une barrière en plastique entre les piliers de la barre d’oreille de l’adaptateur de souris, parallèlement aux piliers. La partie plate du crâne sert de référence, similaire à l’approche du crâne plat en chirurgie stéréotaxique conventionnelle.
REMARQUE: Ne fléchissez pas trop la tête (c’est-à-dire au-delà d’un angle de 90 ° entre le plan de l’os frontal du crâne et le plan de la surface de la table) car cela entrave la circulation de l’air dans les voies respiratoires supérieures. Si la circulation de l’air est entravée, repositionnez la souris en vous assurant que le corps est soutenu sous le tronc et qu’une carte en plastique est placée à 90 ° entre le plan de l’os frontal du crâne et le plan de la surface de la table comme indiqué à la figure 2A, C. - Placez le coussin chauffant sous la souris, puis assurez-vous que le cou et le reste du corps sont positionnés au même niveau (c.-à-d. à environ 180 ° ou parallèlement à la table). La boîte à outils qui contient les ciseaux à ressort peut être utilisée pour soulever le corps à cette position.
REMARQUE: Cette étape est importante car le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure se déplacent en fonction de la position, contrairement aux parties plus rostrales du SNC qui sont maintenues en place par le crâne. - Injecter une dose unique de 4 mg/kg de méloxicam à libération lente (SR) par voie sous-cutanée (c.v.s.) à un volume de 2 μL/g de poids corporel et placer le lubrifiant sur les yeux.
- Nettoyez d’abord le site d’incision chirurgicale avec un tampon de préparation à 70% d’alcool, puis avec un tampon de préparation à la bétadine, puis à nouveau avec un tampon de préparation à l’alcool et laissez sécher.
- Placez un drapé sous le corps.
- Désinfectez-vous les mains et mettez des gants stériles.
- Placez un drapé sur le site chirurgical.
4. Chirurgie pour accéder à la cisterna magna
- Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pinçant les orteils ou en vérifiant le réflexe cornéen.
- Réduire l’isoflurane à des niveaux d’entretien (2.0).
- Faites une incision de 1 à 1,2 cm avec la lame chirurgicale #10 du bord de l’os occipital vers les épaules en un seul mouvement lisse.
- Faites une incision dans le raphe médian du muscle trapèze. Cela expose les muscles appariés de longus capitis.
REMARQUE: Chez la souris, le muscle trapèze est un muscle très mince, presque transparent. Assurez-vous de rester dans la ligne médiane et de ne pas couper dans les muscles sous-jacents, car cela entraînerait des saignements inutiles. - Placez les deux crochets d’enrouleur entre les muscles du longus capitis appariés, l’un orienté vers la gauche et l’autre vers la droite. Le poids des hémostats fournit une tension aux crochets de l’enrouleur qui peut être modifiée en réajustant la position des hémostats.
- Placez le microscope chirurgical en place pour mieux visualiser le champ chirurgical.
- Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les ventres gauche et droit du muscle longus capitis apparié, en commençant par l’occiput, où la ligne médiane est facilement visible. Guidez les pinces contondantes à travers l’os de l’occiput dans la ligne médiane jusqu’à l’endroit où il rencontre la dure-mère cisternale, puis continuez à travers la dure-mère jusqu’à l’atlas.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de couper à travers les muscles de longus capitis appariés car rien ne les maintient ensemble dans la ligne médiane; cela provoquera des saignements inutiles. - Repositionnez les rétracteurs et ajustez la tension en repositionnant les hémostats, ouvrant ainsi la vue de la cisterna magna.
- Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les muscles plus loin dans la ligne médiane afin d’obtenir une bonne fenêtre de vision du tronc cérébral et du cervelet.
- Répétez les étapes 4.7 à 4.9 au besoin jusqu’à ce que le cervelet et le tronc cérébral apparaissent sous la dure-mère.
- À l’aide de pinces à laminectomie contondantes, dégagez la dure-mère des petits brins de tissu conjonctif en déplaçant la pince de la ligne médiane dans une direction latérale, jusqu’à ce qu’il y ait une vue claire du tronc cérébral et pour créer plus d’espace latéral, au besoin pour la cible.
5. Ouverture de la membrane cisternale
- Utilisez la pince Dumont inclinée (#4/45) pour saisir la dure-mère, qui s’étend de l’os occipital à l’atlas. Attrapez la dure-mère près de l’os occipital et utilisez les ciseaux à ressort pour faire une petite ouverture (~0,5 à 1,5 mm) dans la dure-mère.
REMARQUE: À cet endroit rostral, l’espace entre le tronc cérébral et la dure-mère sus-jacente est le plus large, offrant suffisamment d’espace pour une manipulation sûre de la dure-mère. - Utilisez les ciseaux à ressort pour soulever la dure-mère et ouvrir davantage la dure-mère. La taille de la fenêtre dépend de la cible.
REMARQUE: Une fenêtre plus grande sera nécessaire lors de plusieurs injections longitudinales ou bilatérales; une petite fenêtre sera suffisante lors de l’injection unilatérale unique ou médiane. - Une fois la dure-mère ouverte, drainez l’excès de liquide céphalo-rachidien avec une pointe stérile.
6. Identification des points de repère et du point zéro
- Visualisez la surface dorsale du tronc cérébral avec des repères détaillés à travers la dure-mère ouverte. L’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le ventricule IV, est le point zéro standard antérieur-postérieur et médiolatéral.
7. Coordonnées de la cible
REMARQUE : Pour diverses cibles, nous avons inclus une liste de coordonnées standard avec des coordonnées postérieures antérieures (AP) et médiolatérales (ML) par rapport aux coordonnées bregma et cisterna magna du point zéro avec les coordonnées AP et ML par rapport à l’obex du point zéro afin de faciliter la transition entre les méthodologies (tableau 1). Les coordonnées dorsoventrales (DV) sont relatives à la surface du cerveau ou du cervelet (approche standard) ou à la surface du tronc cérébral ou de la corde cervicale supérieure (approche cisterna magna) au point d’entrée AP et ML. La planification doit être faite avant la chirurgie.
- Utilisez les trois ensembles de coordonnées pour déterminer la cible : AP, ML et DV. En raison de la position de la tête, l’orientation relative des structures du tronc cérébral varie selon l’emplacement.
- Pour la distance cible >0,4 mm entre le caudal et l’obex (Figure 1B, vert), effectuez les opérations suivantes.
- AP : Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard (p. ex., Paxinos et Franklin atlas2) ou des séries de tissus découpés dans le plan transversal pour estimer la distance AP entre obex et la cible.
- ML : Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard ou série de tissus découpés dans le plan transversal pour estimer la distance ML entre obex et la cible.
- DV : Estimer les coordonnées par rapport à la surface du cerveau ou du cervelet au point cible AP et ML. Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard ou série de tissus coupés dans le plan transversal pour estimer la distance entre la surface du tronc cérébral aux coordonnées AP et ML souhaitées et la cible.
- Pour la distance cible <0,4 mm entre le caudal et l’obex (Figure 1B, orange), effectuez les opérations suivantes.
- AP: Ajustez les coordonnées pour tenir compte de l’antéroflexion du tronc cérébral. Pour les coordonnées ventrales et rostrales, le point d’entrée du tronc cérébral AP sera plus caudal par rapport à la coordonnée AP cible dans le plan standard.
- ML : Dériver les coordonnées de la cible à partir d’un atlas de référence stéréotaxique standard ou d’une série de tissus découpés dans le plan transversal. Les coordonnées seront relatives à la ligne médiane visualisée au niveau du point d’accès cible.
- DV : Estimer les coordonnées par rapport à la surface du tronc cérébral au point cible AP et ML. Ajuster la VQ pour tenir compte de l’antéroflexion du tronc cérébral. Pour les coordonnées ventrales et rostrales, les coordonnées DV seront plus grandes que la distance de la surface dorsale du tronc cérébral dans le plan standard.
- Pour la distance cible >0,4 mm entre le caudal et l’obex (Figure 1B, vert), effectuez les opérations suivantes.
8. Injection de la cible
- Abaissez la pipette ou la seringue jusqu’à la cible à l’aide du bras stéréotaxique et injectez la solution comme pour les approches stéréotaxiques standard. Laisser en place pendant 1 à 5 minutes après l’injection, pour éviter une trace d’aiguille lors de l’utilisation de volumes compris entre 3 et 50 nL. Ensuite, soulevez la pipette ou la seringue à l’aide du bras stéréotaxique.
- Répétez l’étape 8.1. pour plusieurs cibles.
9. Fermeture du champ chirurgical
- Retirez soigneusement les crochets du champ chirurgical. Les muscles appariés de longus capitis retomberont dans une position neutre, couvrant entièrement la cisterna magna. Ne fermez pas le muscle trapèze et la dure-mère dans la ligne médiane car ils sont trop fragiles pour tenir les sutures.
- Fermez la peau avec trois sutures en nylon ou en polypropylène (5-0 ou 6-0).
10. Soins postopératoires
- Désactivez l’isoflurane et retirez la souris du cadre stéréotaxique. Placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant et observez jusqu’à ce qu’elle soit éveillée et en mouvement.
- Surveillez l’état de santé, le poids et les sutures les jours postopératoires 1 à 3. Retirez les sutures le jour 10 si elles ne sont pas déjà retirées.
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Résultats
L’approche cisterna magna permet de cibler les structures caudales du tronc cérébral et de la moelle cervicale supérieure qui sont autrement difficiles à atteindre par des approches stéréotaxiques standard ou qui sont sujettes à un ciblage incohérent. La chirurgie pour atteindre la cisterna magna nécessite des incisions de la peau, une fine couche de muscle trapèze et l’ouverture de la dure-mère et est donc bien tolérée par les souris. Il est particulièrement efficace et moins invasif lorsqu’il cible plusieurs s...
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Discussion
La chirurgie stéréotaxique standard s’appuie généralement sur des repères crâniens pour calculer les coordonnées des sites cibles dans leSNC 1. Les sites cibles sont ensuite accessibles par des trous de bavure qui sont percés à travers le crâne1. Cette méthode n’est pas idéale pour le tronc cérébral caudal car les sites cibles sont situés loin des repères du crâne dans les plans antéropostérieur et dorsoventral2 et comme l’anatomie du crâne ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par R01 NS079623, P01 HL149630 et P01 HL095491.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tampon imbibé d’alcool | Med-Vet International | UGS : MDS090735Z | préparation cutanée pour la prévention de l’infection du site opératoire |
| Pince coudée, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | uniquement pour saisir le |
| tampon de bétadine | Dura Med-Vet International | SKU :PVP-PAD | préparation de la peau pour la prévention de l’infection du site opératoire |
| Toxine cholérique sous-unité-b, conjugué Alexa Fluor 488/594 | Thermo Fisher Scientific | 488 : C34775, 594 : C22842 | Traceur fluorescent |
| Tondeuses | Wahl | modèle MC3, 28915-10 | pour le rasage de la fourrure sur le site chirurgical |
| Porte-électrode avec pince d’angle | Kopf | 1770 | pour tenir la pipette en verre |
| Débitmètre | Gilmont instruments | modèle # 65 MM | pour réguler le débit d’isoflurane et d’oxygène vers la souris sur le plan |
| chirurgicalMicrosphères fluorescentes, polystyrène | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Traceur fluorescent |
| Coussin chauffant | Stoelting | 53800M | thermorégulation |
| Chambre à induction avec kit de raccordement de port | Midmark Inc | 93805107 92800131 | fournissant une anesthésie initiale |
| Seringue à insuline | Exelint International | 26028 | pour administrer une solution saline et un analgésique |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU :RXISO-250 | anesthésique inhalant |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporisateur | Midmark Inc | 91305430 | appareil pour l’administration d’anesthésique inhalé |
| Pince à laminectomie, Dumont #2 | FST | 11223-20 | uniquement pour nettoyer dura |
| Air médical, comprimé | Linde | UN 1002 | Utilisé avec stimulateur & PicoPump pour fournir de l’air pour l’injection de solution de précision |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgésique |
| Microhématocrite verre borosilicaté tube capillaire pré-calibré | Globe Scientific Inc | 51628 | pour la transfection du matériau aux coordonnées désignées |
| Adaptateur de souris | Stoelting | 0051625 | ; adaptation du cadre stéréotaxique du rat pour la chirurgie |
| la souris Porte-aiguille, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | pour la suture |
| Régulateur d’oxygène | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | réguler les niveaux d’oxygène du réservoir d’oxygène |
| Réservoir d’oxygène, comprimé | Linde | USP UN 1072 | fourni avec l’anesthésie à l’isoflurane |
| Carte en plastique | non applicable | non applicable | toute carte en plastique ferme, découpée pour s’adapter au cadre stéréotaxique (par exemple carte d’identité) |
| PicoPump pneumatique (ou similaire) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | Pour l’injection de solution |
| de précision Saline, stérile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | pour remplacer les fluides corporels perdus pendant l’opération |
| Manche de scalpel, #3 | FST | 10003-12 | à tenir bistouri |
| Ciseaux, Wagner | FST | 14070-12 | pour couper la suture en polypropylène |
| Ciseaux à ressort, Vannas 2,5 mm avec boîte d’accompagnement | FST | 15002-08 | ciseaux uniquement pour ouvrir la dure-mère, boîte pour élever le corps |
| Micromanipulateur stéréotaxique | Kopf | 1760-61 | fixé au porte-électrode pour ajuster la position en fonction des coordonnées |
| Ensemble de cadre stéréotaxique en « U » et plaque de base intracellulaire | Kopf | 1730-B, 1711 | cadre pour la chirurgie |
| Applicateurs stériles à embout en coton | Puritan | 25-806 10WC | absorbant le sang du champ opératoire |
| Champs stériles non fenêtrés | Henry Schein | 9004686 | pour champ opératoire stérile |
| Pommade ophtalmique stérile | Puralube | P1490 | oculaire lubrifiant |
| Stimulateur & Tube | Grass Medical Instruments | S44 | pour fournir de l’air présurveillé contrôlé pour l’injection de solution |
| de précision Lame chirurgicale #10 | Med-Vet International | SKU : 10SS | pour incision cutanée |
| Pince chirurgicale, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | pour maintenir la peau |
| Gants chirurgicaux | Med-Vet International | MSG2280Z | pour la chirurgie |
| asceptiqueMicroscope chirurgical | Leica | modèle M320/ F12 | pour grossissement 5X-40X du site chirurgical |
| Suture 5-0 polypropylène | Oasis | MV-8661 | pour fermer la peau |
| Tegaderm | 3M 3M | ID 70200749250 | fournit une barrière stérile |
| Pince universelle et poteau de support | Kopf | 1725 | fixé au cadre stéréotaxique en U et à la plaque de base intracellulaire |
| Crochet de plaie avec hartman hémostatiques | FST | 18200-09, 13003-10 | pour séparer les muscles et fournir une fenêtre chirurgicale |
Références
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Réimpressions et autorisations
