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Article de méthode

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

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DOI :

10.3791/63383

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17 juin 2022

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1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

Dans cet article

Résumé

Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Résumé

Comprendre les mécanismes pilotes cliniquement pertinents de la chimio-résistance acquise est crucial pour élucider les moyens de contourner la résistance et d’améliorer la survie chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). Une petite fraction des cellules leucémiques qui survivent à la chimiothérapie ont un état épigénétique posé pour tolérer l’insulte chimiothérapeutique. Une exposition supplémentaire à la chimiothérapie permet à ces cellules persistantes d’atteindre un état épigénétique fixe, ce qui entraîne une altération de l’expression des gènes, entraînant la prolifération de ces populations résistantes aux médicaments et éventuellement une rechute ou une maladie réfractaire. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les modulations épigénétiques qui nécessitent la survie des cellules leucémiques résistantes aux médicaments. Nous détaillons un protocole pour identifier les modulateurs épigénétiques qui médient la résistance à la cytarabine analogue nucléosidique (AraC) en utilisant le criblage de la bibliothèque shRNA regroupée dans une lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine. La bibliothèque se compose de 5 485 constructions d’ARNh ciblant 407 facteurs épigénétiques humains, ce qui permet un criblage de facteurs épigénétiques à haut débit.

Introduction

Les options thérapeutiques dans la leucémie myéloïde aiguë (LAM) sont restées inchangées au cours des cinq dernières décennies, avec la cytarabine (AraC) et les anthracyclines comme pierre angulaire du traitement de la maladie. L’un des défis au succès du traitement de la LAM est la résistance des cellules souches leucémiques à la chimiothérapie, entraînant une rechute de la maladie 1,2. La régulation épigénétique joue un rôle vital dans la pathogenèse du cancer et la résistance aux médicaments, et plusieurs facteurs épigénétiques sont apparus comme des cibles thérapeutiques prometteuses 3,4,5. Les mécanismes de régulation épigénétique affectent la prolifération et la survie en cas d’exposition continue à des médicaments chimiothérapeutiques. Des études sur les tumeurs malignes non hématologiques ont rapporté qu’une petite fraction des cellules qui surmontent l’effet du médicament subissent diverses modifications épigénétiques, ce qui entraîne la survie de ces cellules 6,7. Cependant, le rôle des facteurs épigénétiques dans la médiation de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM n’a pas été exploré.

Le criblage à haut débit est une approche de la découverte de médicaments qui a acquis une importance mondiale au fil du temps et est devenue une méthode standard dans différents aspects pour identifier des cibles potentielles dans les mécanismes cellulaires, pour le profilage des voies et au niveau moléculaire 8,9. Le concept de létalité synthétique implique l’interaction entre deux gènes où la perturbation de l’un ou l’autre gène seul est viable mais des deux gènes entraîne simultanément la perte de viabilité10. L’exploitation de la létalité synthétique dans le traitement du cancer pourrait aider à identifier et à caractériser mécaniquement des interactions génétiques létales synthétiques robustes11. Nous avons adopté une approche combinatoire de criblage d’ARNh à haut débit avec létalité synthétique pour identifier les facteurs épigénétiques responsables de la résistance acquise à la cytarabine dans la LAM.

Les leucémies aiguës provoquées par la translocation chromosomique du gène de la leucémie mixte (MLL ou KMT2A) sont connues pour être associées à une faible survie chez les patients. Les produits chimériques résultants des réarrangements du gène MLL , c’est-à-dire les protéines de fusion MLL (MLL-FP), peuvent transformer les cellules souches /progénitrices hématopoïétiques (HSPC) en blastes leucémiques avec l’implication de multiples facteurs épigénétiques. Ces régulateurs épigénétiques constituent un réseau complexe qui dicte le maintien du programme de leucémie et, par conséquent, pourrait former des cibles thérapeutiques potentielles. Dans ce contexte, nous avons utilisé la lignée cellulaire MV4-11 (hébergeant le gène de fusion MLL MLL-AF4 avec la mutation FLT3-ITD; appelée MV4-11 P) pour développer la lignée cellulaire acquise résistante à la cytarabine, appelée MV4-11 AraC R. La lignée cellulaire a été exposée à des doses croissantes de cytarabine avec une récupération intermittente du traitement médicamenteux, connue sous le nom de vacances médicamenteuses. La concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été évaluée par un test de cytotoxicité in vitro .

Nous avons utilisé la bibliothèque d’ARNh épigénétique groupée (voir Tableau des matériaux) pilotée par le promoteur hEF1a avec une colonne vertébrale lentivirale pZIP. Cette bibliothèque comprend des shRNA ciblant 407 facteurs épigénétiques. Chaque facteur a 5 à 24 shRNA, avec un total de 5 485 shRNA, dont cinq shRNA de contrôle non ciblés. L’échafaudage miR-30 modifié « UltrmiR » a été optimisé pour une biogenèse et une expression efficaces de l’ARNh primaire12,13.

Les grandes lignes de cette expérience sont illustrées à la figure 1A. Le protocole actuel se concentre sur le dépistage de l’ARNi à l’aide de la bibliothèque d’ARNh du facteur épigénétique dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R (Figure 1B), une lignée cellulaire en suspension. Ce protocole peut être utilisé pour dépister n’importe quelle bibliothèque ciblée dans n’importe quelle lignée cellulaire résistante aux médicaments de son choix. Il convient de noter que le protocole de transduction sera différent pour les cellules adhérentes.

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Protocole

Suivez les directives du Comité institutionnel de biosécurité (IBSC) et utilisez l’installation appropriée pour traiter le lentivirus (BSL-2). Le personnel devrait recevoir une formation appropriée à la manipulation et à l’élimination du lentivirus. Ce protocole suit les directives de biosécurité du Christian Medical College, Vellore.

1. Sélection du promoteur le plus puissant pour obtenir une expression persistante et prolongée des shRNA

REMARQUE: Il est essentiel d’effectuer une expérience de transduction en utilisant des vecteurs lentiviraux avec différents promoteurs qui expriment des protéines de fluorescence pour identifier le promoteur qui fournit une expression stable et à long terme des ARNh dans la lignée cellulaire sélectionnée pour l’expérience. Les promoteurs les plus couramment utilisés à cette fin sont les promoteurs hEF1α (facteur d’élongation humaine 1α), hCMV (cytomégalovirus humain) et SSFV (virus formant un foyer de rate) qui expriment la protéine de fluorescence verte (GFP) (Figure 2A).

  1. Effectuez le comptage des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion bleue trypan. Suspendre les cellules MV4-11 AraC R dans un milieu RPMI à 10 % (RPMI avec 10 % de FBS complété par 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine) contenant 8 μg/mL de polybrène. Ensemencer 1 x 106 cellules dans 1,5 mL de milieu/puits d’une plaque de six puits en triples.
  2. Ajouter différents volumes de lentivirus concentrés (par exemple, 10 μL, 20 μL et 40 μL selon le titre des lentivirus) à chaque puits. Faites tourbillonner doucement la plaque pour mélanger le contenu.
  3. Effectuer une spinfection par centrifugation à 920 x g à 37 °C pendant 90 min.
  4. Incuber immédiatement les plaques dans un incubateur à CO2 (5% deCO2 à 37 °C).
  5. Observez l’expression de la GFP après 48 h au microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie.
  6. Quantifier l’expression de la GFP par cytométrie en flux après 72 h pour évaluer l’efficacité de la transduction.
  7. Cultivez les cellules pendant un total de 2 semaines et surveillez périodiquement l’expression de GFP par cytométrie en flux. La réduction de l’expression de GFP mesurée par l’intensité moyenne de fluorescence et le pourcentage de cellules GFP+ indique un silence de promoteur.
  8. Triez les cellules GFP+ le 10ème jour et cultivez les cellules pendant 1 semaine après le tri. Vérifiez périodiquement l’expression GFP pendant la culture.
  9. Utilisez les cellules non traduites pour définir la porte. Une population au-delà de l’échelle1 x 10 1 vers la droite sur l’axe des x est considérée comme une population positive pour la GFP.
  10. Choisissez le promoteur qui montre une expression persistante de GFP dans la culture prolongée des cellules.

2. Préparation d’une bibliothèque d’ARNh de facteur épigénétique humain lentiviral groupé

  1. Culture de cellules 293T (à un faible nombre de passage avec un bon taux de prolifération) dans trois boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 8 mL de milieu DMEM à 10% (DMEM avec 10% FBS contenant 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine) dans chaque plaque.
  2. Une fois que les cellules atteignent 60% de confluence, remplacez le milieu par un milieu complet.
  3. Préparer le mélange de transfection (tel qu’indiqué dans le tableau 1) qui contient un milieu sans sérum, un emballage lentiviral (psPAX2) et un plasmide d’enveloppe (pMD2.G), des plasmides de bibliothèque regroupés et, enfin, le réactif de transfection.
  4. Tapotez le mélange pour bien le mélanger et incubez à température ambiante pendant 15 min.
  5. Ajouter le mélange de transfection aux cellules 293T et mélanger doucement en faisant tourbillonner les plaques. Incuber les plaques dans un incubateur à CO2 (5% deCO2 à 37 °C). Changer le support après 24 h.
  6. Après 48 h, vérifiez l’expression de GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une efficacité de transfection élevée dans les cellules 293T.
  7. Recueillir les surnageants du virus après 48 h, 60 h et 72 h et les conserver à 4 °C. Ajouter un milieu frais (8 mL) à chaque point temporel après avoir recueilli le virus.
  8. Mettez en commun les surnageants du virus. Le volume total des virus regroupés sera de : ~8 mL/plaque x 3 collections= ~24 mL/plaque; ~24 mL/plaque x 3 plaques = ~72 mL à partir de 3 plaques.
  9. Filtrez les virus regroupés avec le filtre de 0,4 μm.
  10. Pour obtenir un titre élevé de virus, concentrez les virus regroupés par ultracentrifugation. Transférer le surnageant du virus filtré dans deux tubes de 70 Ti (32 mL/tube) et centrifuger à 18 000x g pendant 2 h avec une accélération et une décélération lentes. Utilisez un rotor et une centrifugeuse prérefroidis à 4 °C.
  11. Retirez doucement les tubes de la centrifugeuse et retirez complètement le surnageant.
  12. À l’aide d’une micropipette, remettre doucement la pastille dans 400 μL de DMEM (sans FBS ni antibiotiques). Incuber sur la glace pendant 1 h et mélanger les granulés des deux tubes.
  13. Aliquoter les virus et les congeler à −80 °C.
    REMARQUE: Les tubes et les virus doivent être conservés sur la glace pendant les étapes 2.10.-2.13. Évitez de mousser pendant la réutilisation du virus avec le milieu ordinaire. Le milieu doit être maintenu à 4 °C.
  14. Calculer la concentration (x) du virus comme suit :
    Volume total avant concentration = 72 mL (72 000 μL)
    Volume après concentration = 400 μL
    La concentration = 72 000/400 = 180x

3. Estimation de l’efficacité de transduction des lentivirus

  1. Transduire les cellules 293T avec le virus concentré dans différents volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) pour confirmer la préparation réussie des lentivirus.
    REMARQUE: Si les virus concentrés présentent des efficacités de transduction élevées (>50%) dans de petits volumes (1-2 μL), il est conseillé de diluer le virus concentré dans les quantités souhaitées (100x à 75x).
  2. Diluer le virus concentré à 100x avec du DMEM (sans FBS ni antibiotiques) pour effectuer des expériences de titrage dans la lignée cellulaire MV4-11 AraC R.
  3. Ensemencez 1 x 106 cellules (lignée cellulaire MV4-11 AraC R dans 1,5 mL de milieu RPMI à 10 % contenant 8 μg/mL de polybrene) dans un puits d’une plaque de six puits. Préparer quatre puits pour la transduction avec différents volumes de virus.
  4. Ajoutez quatre volumes différents (par exemple, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL et 2,5 μL) de virus 100x.
  5. Effectuer une spinfection par centrifugation de la plaque à 920 x g pendant 90 min à 37 °C.
  6. Après 72 h, mesurez le pourcentage de cellules GFP+ par cytométrie en flux.
  7. Déterminez le volume des virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30 %. Cette faible efficacité de transduction permet d’assurer une intégration unique de shRNA par cellule.

4. Transduction de la bibliothèque d’ARNh épigénétique regroupée dans la lignée cellulaire résistante aux médicaments

  1. Maintenir la lignée cellulaire cible MV4-11 AraC R à une densité de 0,5 x 106 cellules/mL. Assurez-vous que les cellules sont à la phase de croissance exponentielle en culture.
  2. Calculez le nombre de cellules à prélever pour l’expérience comme ci-dessous en fonction du nombre d’intégrants viraux.
    Nombre de cellules nécessaires à la transduction = 5 485 (nombre d’ARNh) × 500 (représentation de l’ARNh) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~ 11 x 106 cellules
  3. Remettre en suspension 1,1 x 107 cellules dans 16 mL de milieu RPMI à 10 %.
  4. Ajouter le polybrene (8 μg/mL) et bien mélanger. Ensuite, ajoutez le volume requis de virus pour obtenir une efficacité de transduction de 30% telle que calculée dans la section précédente.
  5. Ensemencez toutes les cellules sur une plaque de six puits à une densité de 1 x 106 cellules/1,5 mL de milieu RPMI à 10 % par puits.
  6. Centrifuger la plaque pendant 90 min à 920 x g à 37 °C.
  7. Incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur à CO2 (5% de CO2 à 37 °C).
  8. Après 24 h, changer le milieu et transférer les cellules transduites dans une fiole T-75.
  9. Après 48 h, vérifiez la GFP sous un microscope à fluorescence pour assurer une transduction réussie.
  10. Après 72 h, quantifier le pourcentage de cellules GFP+ par cytométrie en flux.

5. Enrichissement des cellules GFP positives

REMARQUE: Dilatez les cellules transduites en les cultivant à une densité de 0,5 x 106 cellules / mL pendant 5-7 jours. Ces cellules sont une population mixte de transductives et non transduites, sélectionnées en fonction de GFP par tri, comme mentionné à l’étape suivante.

  1. Effectuez le tri en flux des cellules transduites GFP+ avec les paramètres de tri en flux définis comme haute pureté et faible rendement. Utilisez les cellules non traduites pour définir la porte. Une population au-delà de 1 x 102 vers la droite est considérée comme une population positive.
  2. Recueillir les cellules triées dans 5% RPMI (RPMI avec 5% FBS complété par 100 U / mL pénicilline et 100 U / mL streptomycine).
  3. Cultivez les cellules triées dans un milieu RPMI à 10%.
  4. Après 72 h, effectuez l’estimation post-tri du pourcentage de cellules GFP+ pour assurer une efficacité de tri de >95%.
    REMARQUE: Assurez-vous d’obtenir ~3-5 x 106 cellules GFP positives après le tri pour obtenir une représentation 450x à ~500x de la bibliothèque shRNA.

6. Dépistage de l’abandon pour identifier les facteurs épigénétiques médiant la résistance aux médicaments

  1. Cultivez les cellules transduites de la bibliothèque shRNA dans 10% RPMI pendant 5 jours. Cryoconserver les cellules transduites pour de futures expériences, si nécessaire, avant le traitement médicamenteux.
  2. Centrifuger 1 x 107 cellules en double à 280 x g pendant 5 min à 25 °C. Jeter le surnageant et conserver les granulés à −80 °C. Ces échantillons serviront de référence pour la bibliothèque épigénétique d’ARNh.
  3. Cultivez les cellules transduites restantes sous forme de doublons (R1 et R2), chacune maintenue à un nombre de cellules qui fournit une représentation 500x de la bibliothèque.
  4. Traiter l’un des doublons avec le médicament (10 μM de cytarabine) (R2) et l’autre sans traitement médicamenteux (R1).
  5. Changer le milieu des flacons avec et sans le médicament toutes les 72 h. Répétez le changement de milieu 3x pour une exposition cumulative au médicament de 9 jours.
  6. Après 9 jours de traitement médicamenteux, vérifiez la viabilité des cellules par la méthode d’exclusion du bleu de trypan.
  7. Centrifuger les cellules restantes à 280 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans du PBS stérile et lavez les cellules. Centrifuger à 280 x g pendant 5 min à température ambiante.
  8. Jeter le surnageant et stocker les granulés à −80 °C pour l’extraction de l’ADN.

7. Amplification des shRNA intégrés par PCR

  1. Extraire l’ADN des cellules de base transduites (T) (étape 6.2.) et des cellules traitées avec le médicament (R2) et non traitées avec le médicament (R1).
  2. Vérifiez la concentration de l’échantillon à l’aide d’un fluoromètre.
  3. Calculez la quantité d’ADN requise pour la PCR comme ci-dessous:
    5 485 (non. des shRNA) × 500 (représentation de l’ARNh) × 1 x 6,6−12 (g/génome diploïde) = 15 μg d’ADN
  4. Soumettre les échantillons à la première série de PCR.
    REMARQUE: Le mélange réactionnel PCR est représenté dans le tableau 2 avec les conditions du cycleur thermique. Les détails des amorces sont fournis dans le tableau supplémentaire 1.
  5. Mettre en place plusieurs réactions contenant 850 ng d’ADN par tube (pour un total de 43 réactions).
    REMARQUE: La première série de PCR amplifie les régions flanquantes de l’ARNh, ce qui donne une taille d’amplicon de 397 pb.
  6. Regroupez les produits PCR et purifiez les produits PCR à l’aide de 3-4 colonnes d’un kit de purification gel/PCR standard.
    REMARQUE : Les détails sont fournis dans le tableau 3.
  7. Éluez le produit dans 50 μL de tampon de chaque colonne et regroupez les éluats.
  8. Quantifiez l’ADN et stockez-le à −20 °C.
    REMARQUE: Les réactifs sont présentés dans le tableau 4 avec les conditions du cycleur thermique. La PCR de deuxième tour utilise les amorces avec la séquence INDEX requise pour le multiplexage dans NGS dans une cellule à flux unique. Ainsi, chaque échantillon doit être étiqueté avec un index différent. Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire 1.
  9. Mettre en place quatre réactions avec 500 ng du produit PCR primaire dans un volume de réaction total de 50 μL pour chaque échantillon et le témoin négatif.
  10. Chargez l’ensemble du produit pour l’électrophorèse à l’aide d’un gel d’agarose TBE à 2% et confirmez la taille de la bande à l’aide d’une échelle moléculaire de 1 kb. La taille de l’amplicon est de 399 pb.
  11. Visualisez les produits PCR sur le système de documentation du gel.
  12. Retirez la bande spécifique et purifiez-la à l’aide d’un kit de purification en gel.
    REMARQUE: Les calculs pour la purification avec le kit sont fournis dans le tableau 3.
  13. Éluter dans un volume final de 30 μL de tampon d’élution. La concentration approximative de chaque éluant sera d’environ 80-90 ng/μL avec un volume total de 30 μL.

8. Séquençage et analyse des données de nouvelle génération

  1. Séquencer le produit purifié au gel à partir de l’étape 7.13. sur un séquenceur de nouvelle génération (p. ex., Illumina) pour obtenir le nombre de lectures pour les shRNA épuisés.
  2. Découpez les séquences d’adaptateurs des lectures FastQ générées à l’aide du kit d’outils Fastx (version 0.7).
  3. Alignez les lectures filtrées sur les séquences de référence à l’aide d’un aligneur bowtie avec le paramètre d’autoriser deux incohérences. Assurez-vous que la longueur de lecture après le rognage de l’adaptateur est d’environ 21 pb.
  4. Chargez les fichiers à l’aide du programme Samtools (version 1.9). Utilisez l’option Flagstat et calculez le résumé de l’alignement.
  5. Chargez les fichiers fastQ découpés dans le logiciel CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) avec les séquences shRNA de référence sous la forme de fichiers FASTA et effectuez l’analyse conformément aux instructions.
    1. Cliquez sur le lien Démarrer l’analyse dans le CC2.
    2. Sélectionnez le type d’écran comme écrans Survie et Abandon. Définissez le nombre de groupes et tapez le nom de chaque groupe.
    3. Téléchargez la bibliothèque de référence au format de fichier FASTA. Les données téléchargées sont traitées. Cliquez sur l’URL de sortie pour obtenir les résultats.
      REMARQUE: Ce logiciel utilise un modèle bêta-binomial avec un test t de Student modifié pour mesurer les différences dans les niveaux d’ARNs sg/ shRNA, suivi du test de probabilité combiné de Fisher pour estimer la signification au niveau du gène. Il calcule les variations globales estimées de2 fois (Log2Fc) des ARNh pour les facteurs épigénétiques entre les échantillons traités (enrichis/épuisés) et les échantillons non traités (de référence) avec des « valeurs p » et des « valeurs FDR ».
  6. Assurez-vous que la valeur FDR est « Négatif » pour un écran Dropout et « Positif » pour un écran Survival.
    REMARQUE: CC2 est une plate-forme d’analyse permettant de compter les lectures et de calculer la représentation du pli (enrichissement ou épuisement) des shRNA entre les échantillons.
  7. Identifier les shRNA significativement enrichis et épuisés (FDR <0,05) à partir des résultats du CC2.
    REMARQUE: Il y a 5-24 shRNA contre chaque facteur. Vérifiez les valeurs FDR pour chacun des shRNA; considérez le FDR, qui est <0,01, et prenez une moyenne pour les shRNA sélectionnés. Considérez les 40 meilleurs hits. Tracez le graphique des facteurs sélectionnés en fonction des valeurs négatives Log2Fc ou FDR. Assurez-vous que les shRNA non ciblés ont également des valeurs FDR significatives pour assurer l’authenticité des données car ils servent de shRNA de contrôle.

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Résultats

Le flux de travail global de sélection est illustré à la figure 1A. La cytotoxicité in vitro du MV4-11 AraC R (48 h) a révélé que la CI50 à la cytarabine dans le MV4-11 AraC R était supérieure à celle du MV4-11 P (Figure 1B). Cette lignée cellulaire a été utilisée dans l’étude comme modèle pour le dépistage des facteurs épigénétiques responsables de la résistance à la cytarabine.

La figur...

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Discussion

L’interférence ARN (ARNi) est largement utilisée pour les études de génomique fonctionnelle, qui comprennent le criblage du siRNA et du shRNA. L’avantage des shRNA est qu’ils peuvent être incorporés dans des vecteurs plasmidiques et intégrés dans l’ADN génomique, ce qui entraîne une expression stable et, par conséquent, une destruction plus prolongée de l’ARNm cible. Un criblage de bibliothèque d’ARNh groupé est robuste et rentable par rapport aux écrans en réseau conventionnels (siRNA). Identifier l’essentialité d’une c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts et rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude est financée en partie par une subvention du Département de biotechnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 à SRV; et Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 et Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS et P.B. sont soutenus par Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 et IA/S/15/1/501842, respectivement. S.D. est soutenu par la bourse CSIR-UGC, et S.I. est soutenu par une bourse de recherche senior ICMR. Nous remercions Abhirup Bagchi, Sandya Rani et le personnel de l’installation centrale de cytométrie en flux du CSCR pour leur aide. Nous remercions également MedGenome Inc. pour son aide dans le séquençage à haut débit et l’analyse des données.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Reagents
100 bp Ladder Hyper LadderBIOLINE BIOLINEBIO-33025
1kb Ladder Hyper LadderBIOLINE BIOLINEBIO-33056
AgaroseLonza Seachekm50004
Bétaïne (5mM)SigmaB03001VL
Acide BoriqueQualigènes12005
Plastique de culture cellulaireCorningcomme appicable
Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside chlorhydrateSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHCryosure DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
Bromure d’éthidiumSigmaE1510-10 mL
Sérum fœtal bovinThermo Fisher Scientific16000044
PurificationMACHEREY-NAGEL REF  ; 740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
Glacial Acetic AcidThermoQ11007
hCMV GFP PlasmidTransOmicsPromoter selection KIT
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics Promoter selection KIT
HEK 293TATCCCRL-11268
Lignée cellulaire HL60ATCCCCL-240
KOD Démarrage à chaud PolyméraseMerck71086
Lignée cellulaire Molm13Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-UnisDana Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-Unis
MV4-11 Lignée cellulaireATCCCRL-9591
Pénicilline streptomycineThermo Fisher Scientific
psPAX2 et pMD2.GAddgenePlasmide Addgene n° 12260 & Addgene plasmide n° 12259
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenREF Q32854
SFFV  ; GFP PlasmideTransomics Sélectionpromoteur TransOmics KIT
shERWOOD-UltrmiR bibliothèque shRNA de TransomicsTransomicsN° de cat. TLH UD7409 ; No de lot : A116. V 132.14
Trans-IT-LTI MirusMirus Numéro de catalogue : MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
Ultra centrifuge TubesBeckman Coulter  ; 103319
Equipments
5 % CO2 incubateurThermo Fisher
BD Aria III trieur de cellulesBecton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- UltracentrifugationBeckman Coulter
CentrifugeThermo Multiguge 3SR+
Système d’imagerie ChemiDoc  ;( Fluro Chem M system)Fluro Chem
Leica AF600Leica
Light MicroscopeZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FluorimètreInvitrogen
Thermal CyclerBioRad
91233354 Gel Kit de 15140122 du

Références

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