Essai biologique d’application topique pour quantifier la toxicité des insecticides pour les moustiques et les mouches des fruits

Résumé

Nous décrivons la méthodologie et l’importance de l’essai biologique d’application topique pour mesurer la sensibilité aux insecticides chez les moustiques et les mouches des fruits. Le test présenté est à haut débit, utilise la masse d’insectes - permettant ainsi de calculer une dose létale relativisée en masse au lieu de la concentration - et a probablement une variabilité plus faible que d’autres méthodes similaires.

Résumé

L’utilisation continue d’insecticides pour la santé publique et l’agriculture a conduit à une résistance généralisée aux insecticides et à une entrave aux méthodes de lutte. La surveillance de la résistance aux insecticides des populations de moustiques se fait généralement par le biais d’essais biologiques en bouteille des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou de tests en tube de l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Cependant, ces méthodes peuvent entraîner un degré élevé de variabilité des données sur la mortalité en raison du contact variable de l’insecticide avec l’insecte, du nombre relativement faible d’organismes testés, de la variation importante de la masse entre les populations et des conditions environnementales en constante évolution, conduisant à des résultats variables. Cet article présente le bioessai d’application topique, adapté en tant que bioessai phénotypique à haut débit pour les moustiques et les mouches des fruits, pour tester un grand nombre d’insectes le long d’une gamme de concentrations d’insecticides.

Ce test 1) assure un traitement et un contact insecticide cohérents avec chaque organisme, 2) produit des courbes dose-réponse très spécifiques qui tiennent compte des différences de masse moyenne entre les souches et les sexes (ce qui est particulièrement important pour les organismes collectés sur le terrain), et 3) permet le calcul de doses létales médianes statistiquement rigoureuses (DL₅₀ ), qui sont nécessaires pour les comparaisons des rapports de résistance - une approche de surveillance alternative à la mortalité par dose diagnostique, qui est également utilisée pour la surveillance de la résistance aux larvicides. Ce test sera un outil complémentaire pour phénotyper avec précision les populations de moustiques et, comme illustré par les mouches des fruits, est facilement adaptable pour une utilisation avec d’autres insectes. Nous soutenons que ce test aidera à combler l’écart entre la résistance aux insecticides génotypiques et phénotypiques chez plusieurs espèces d’insectes.

Introduction

Les moustiques sont responsables de plus de 700 000 décès chaque année dus aux maladies qu’ils transmettent à l’homme, dont plus de la moitié sont dus au paludisme^{seulement 1}. La principale méthode préventive contre la transmission du paludisme et d’autres maladies à transmission vectorielle est l’utilisation d’insecticides, souvent sous la forme de moustiquaires imprégnées d’insecticide ou de pulvérisations à effet rémanent à l’intérieur². Cependant, la résistance aux insecticides est répandue chez les moustiques et autres insectes vecteurs, ainsi que chez les ravageurs agricoles ^3,4. Pour gérer efficacement la résistance, la surveillance est d’une importance capitale⁵. Pour cela, des méthodes de détection de résistance très précises et à haut débit sont nécessaires. Actuellement, les outils de surveillance de la résistance aux insecticides les plus répandus pour les moustiques sont le test^{en tube 6} de l’OMS et le test biologique⁷ en bouteille du CDC. Pour les mouches des fruits, la méthode d’application par contact résiduel (similaire à l’essai biologique en bouteille du CDC) est un essai biologique insecticide couramment utilisé ^8,9,10. Cependant, la variabilité des données de ces méthodes est généralement élevée, avec des mesures de la même souche de moustique de laboratoire allant d’environ 20 à 70% de mortalité dans les tests de bouteille du CDC et de 0 à 50% dans les tests en tube de l’OMS lorsqu’ils sont exposés à des doses sublétales¹¹. Une telle variation est surprenante parce que la variation génétique limitée dans la plupart des souches de laboratoire devrait entraîner une variation limitée de la susceptibilité aux insecticides dans la population. Néanmoins, il y a encore un niveau élevé de variation observée dans les résultats des essais biologiques.

Les sources potentielles de cette variation pourraient être le résultat d’une exposition hétérogène à un insecticide entre les échantillons dans le cadre de l’essai biologique en raison d’une exposition indirecte à l’insecticide par la surface, d’effets environnementaux hétérogènes, d’une variation biologique normale entre des individus du même génotype et d’une variation de la masse des spécimens de la même population¹² . Une méthode rarement utilisée avec une reproductibilité plus élevée est le bioessai d’application topique. Dans ce test, l’insecticide est directement appliqué sur chaque insecte ^13,14, éliminant le facteur d’exposition hétérogène de différents spécimens dans le même test. Cependant, en raison de la nature à débit lent de cette méthode, elle n’est pas couramment utilisée comme outil de surveillance de la susceptibilité aux insecticides pour les populations de moustiques. Cet article présente un protocole modifié pour l’essai biologique d’application topique qui permet des expositions à débit plus élevé tout en corrigeant la variation de la masse d’insectes, un paramètre qui est corrélé aux changements dans la sensibilité aux insecticides¹². Une réduction du bruit et de la variation de masse des données de mortalité résultant d’une exposition variable aux insecticides permettrait une surveillance plus précise de la résistance technique^11,15. Ces données pourraient être utilisées pour associer plus précisément la résistance phénotypique aux marqueurs génétiques, aux paramètres de condition physique et/ou à la compétence vectorielle. De plus, nous démontrons comment ce test pourrait facilement être adapté à d’autres espèces d’insectes en utilisant l’essai biologique d’application topique sur les mouches des fruits, une espèce d’insecte plus petite.

La principale limite des applications de contact résiduel susmentionnées est que l’exposition aux insecticides peut varier d’un échantillon à l’autre dans le même essai. Dans le cas des essais biologiques en bouteille du CDC et de la méthode de contact, l’exposition à l’insecticide peut varier entre les répétitions du même essai. Les insectes sont exposés à un insecticide qui est soit distribué à l’intérieur d’une bouteille en verre (essai biologique en bouteille cdc et méthode de contact), soit sur des papiers imprégnés (test en tube de l’OMS). La concentration d’insecticide sur les deux surfaces (verre et papier) est connue et prédéterminée par le dépistage de différentes espèces de génotypes connus. Cependant, la quantité disponible pour être potentiellement absorbée par l’insecte peut varier considérablement en fonction de la surface utilisée, des composants du mélange d’insecticides et de l’homogénéité avec laquelle l’insecticide est réparti sur le matériau de surface^16,17. Dans le test biologique de la bouteille CDC, le revêtement insecticide à l’intérieur de la bouteille dépend des procédures utilisées par chaque laboratoire et utilisateur. Dans le test en tube de l’OMS, les papiers traités à l’insecticide sont produits de manière centralisée et donc très probablement assez homogènes dans tous les laboratoires. Cependant, dans le test en tube de l’OMS, le tube d’exposition permet aux échantillons d’atterrir et de reposer sur des mailles métalliques non exposées aux insecticides, ce qui entraîne une exposition hétérogène potentielle à l’insecticide parmi les échantillons de chaque essai. La quantité réelle d’insecticide ramassée et absorbée par les spécimens par chaque méthode doit encore être explorée plus avant¹⁸.

En outre, le test biologique en bouteille du CDC, le test en tube de l’OMS et la méthode de contact sont le plus souvent utilisés comme tests de seuil ne testant qu’une seule concentration d’insecticide prédéterminée. Cette approche permet de détecter avec précision la présence de résistance et est utile pour la surveillance de la résistance (en particulier lorsque la résistance se propage). Cependant, les tests de seuil ne peuvent pas quantifier la force de la résistance, ce qui pourrait être plus prédictif de l’efficacité des outils d’intervention. Si plusieurs concentrations d’insecticide sont utilisées avec ces méthodes, elles peuvent être utilisées comme tests d’intensité. Les tests d’intensité pour l’essai biologique en bouteille du CDC et le test en tube de l’OMS ont été introduits en testant 5x et 10x les doses discriminantes prédéterminées pour combler cette lacune dans la surveillance ^6,19. Tout en offrant une plus grande capacité à différencier les populations résistantes, 3-5 doses (prédéterminées) fournissent une résolution limitée pour calculer les concentrations létales. De plus, des moustiques de différentes tailles sont utilisés dans de tels tests. Pourtant, il est important de mesurer la masse car les échantillons plus grands peuvent avoir besoin d’une dose plus élevée pour être tués, car la dose efficace par unité de masse sera beaucoup plus faible que celle d’un organisme plus petit¹². Le calcul d’une dose létale relativisée en masse (quantité d’insecticide par masse d’insecte) serait une mesure plus utile que la concentration létale plus courante (p. ex., quantité d’insecticide par surface) car elle tient compte de la variation de la masse d’insectes entre les sexes, les populations et les génotypes. De telles données aideraient à combler l’écart entre la résistance génotypique et phénotypique en laboratoire et sur le terrain et pourraient également fournir un moyen facile de calculer la concentration d’application nécessaire pour traiter une population d’insectes d’une masse moyenne connue.

L’utilisation de doses létales relativisées en masse qui tuent 50% des échantillons (_{DL 50}) intègre également plusieurs autres avantages. L’évaluation de la toxicité d’un composé spécifique en mg/kg (= ng/mg) est la norme en toxicologie humaine et vétérinaire¹⁴, et les valeurs DL₅₀ figurent sur les fiches de données de sécurité. Les doses létales permettent également une comparaison directe de la toxicité entre différents produits chimiques pour une espèce particulière ou le même produit chimique pour différentes espèces²⁰, ainsi qu’une évaluation de haute qualité de nouveaux insecticides et produits chimiques¹³. De plus, la DL₅₀ peut fournir des rapports de résistance plus significatifs et plus précis que ceux dérivés des résultats de la mortalité par dose diagnostique, ce qui peut entraîner une surestimation du niveau de résistance présent dans une population. Par conséquent, ce test conviendrait aux programmes de surveillance de routine en fournissant une surveillance plus rigoureuse de la résistance basée sur des doses létales relativisées en masse dérivées de plus d’échantillons que celles recommandées pour d’autres essais biologiques²¹.

La méthode d’application topique a été utilisée dans la surveillance de la sensibilité aux insecticides pour les moustiques et les mouches comme alternative aux essais biologiques standard de sensibilité aux insecticides lorsque la résistance est déjà connue ou soupçonnée^22,23, ainsi que pour la surveillance chez certains insectes nuisibles²⁴ afin d’évaluer plus précisément les profils de résistance et la toxicité intrinsèque des insecticides²¹ . Dans les essais biologiques d’application topique, l’insecticide est appliqué sur chaque organisme, ce qui entraîne une variation minimale de l’exposition à l’insecticide. Cet article présente une méthode légèrement adaptée et améliorée qui permet d’appliquer l’exposition à l’insecticide sur un grand nombre d’insectes en peu de temps tout en contrôlant la masse^{d’insectes 22}. Cette méthode à débit plus élevé avec de bons niveaux de reproductibilité pourrait être un outil supplémentaire utile pour la surveillance systématique de la susceptibilité aux insecticides.

Protocole

REMARQUE : Les insecticides peuvent causer des dangers pour l’homme, les animaux et^{l’environnement 25}. La prudence, la formation et l’équipement de protection individuelle sont fortement conseillés. Assurez-vous de suivre les fiches de données de sécurité pour tous les insecticides et solvants utilisés.

1. Spécimens arrière

1. Moustiques adultes arrière de 3 à 5 jours.
   NOTE: Le protocole ci-dessous reflète les conditions d’élevage d’Aedes aegypti , en suivant de près les directives²⁶ de l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture.
   1. Moustiques arrière de tous les stades de la vie à 27 ± 1 °C et 75 ± 5% d’humidité relative avec 12:12 h de cycle clair et sombre.
   2. Faites éclore les œufs de moustiques en les immergeant dans de l’eau désionisée et en ajoutant de la levure²⁶, ou placez les œufs immergés dans une chambre à vide pendant 30 minutes.
      REMARQUE: Les deux méthodes diminuent la teneur en oxygène dans l’eau et augmentent l’éclosion²⁷.
   3. Nourrissez les larves nouvellement écloses avec de la nourriture pour poissons (ou un régime équivalent comme des croquettes de chat moulues) dans des plateaux et gardez la densité larvaire aussi similaire que possible entre les plateaux, car la densité larvaire a une incidence sur le développement¹² (p. ex., 200 à 250 larves par plateau contenant un total de 1,5 L d’eau).
   4. Nourrissez les larves tous les deux jours jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade nymphal (environ 7 à 10 jours), en augmentant la quantité de nourriture au besoin.
      REMARQUE: Lorsqu’elles sont trop peu nourries, la croissance larvaire sera rabougrie et les larves peuvent se manger les unes les autres. Lorsqu’elles sont trop nourries, les larves peuvent mourir, ce qui provoque l’encrassement de l’eau.
   5. Une fois que les nymphes se développent, transférez-les quotidiennement dans un bol d’eau dans des cages à moustiques adultes et fournissez une solution de saccharose à 10% ad libitum.
   6. Enregistrez le premier jour de l’émergence adulte. Retirez les nymphes restantes de la cage 2 jours après le début de l’émergence.
      REMARQUE: Les moustiques mâles émergent plus rapidement. Notez l’émergence des mâles et des femelles séparément et assurez-vous qu’un nombre suffisant d’hommes et de femelles sont disponibles pour chaque test.
   7. Attendez 3 jours après avoir retiré les nymphes pour obtenir des moustiques âgés de 3 à 5 jours pour les tests.
2. Mouches des fruits arrière (suivant vaguement les protocoles de l’Université de Zurich²⁸).
   1. Souches de drosophiles arrière dans des bouteilles de stock à 23 ± 1 ° C et 60 ± 5% d’humidité relative avec 12:12 h de cycle clair et sombre.
      REMARQUE: Les bouteilles de stock de drosophiles doivent contenir 75 mL d’un milieu mouche standard, qui est d’abord versé sous forme liquide dans le fond des bouteilles, puis laissé se solidifier pendant la nuit.
   2. Transférez les colonies dans de nouvelles bouteilles de stock avec des aliments frais toutes les deux semaines pour éviter la surpopulation et la croissance de moisissures. Pour ce faire, abattre les mouches à l’aide d’un distributeur portatif de dioxyde de carbone (CO₂), transférer les mouches anesthésiées sur un papier de pesée sur un sac de glace ou une table froide, et brosser les mouches dans une bouteille fraîche à l’aide d’un pinceau à pointe fine. Assurez-vous de garder les bouteilles sur les côtés pendant ce processus pour éviter que les mouches ne tombent dans la nourriture et ne se noient.

2. Préparer des formulations insecticides en utilisant l’approche gravimétrique

1. Fabriquer la première solution mère en suivant l’approche gravimétrique en utilisant une échelle analytique avec une précision de 0,1 mg à l’intérieur d’une hotte.
   REMARQUE: L’approche gravimétrique utilise la masse pour mesurer les quantités d’insecticide et de solvant ajoutées. La pratique standard (approche volumétrique) exigera une échelle analytique pour mesurer la quantité d’insecticide (solide) ajoutée lors de la préparation de la première solution mère; toutefois, la quantité de solvant ajoutée et toutes les dilutions suivantes ne sont mesurées qu’en volume. L’approche gravimétrique a un niveau de précision plus élevé et est donc préférée.
   1. Déterminer la concentration cible d’insecticide et le volume cible (un maximum de 10 mL est recommandé si vous utilisez des tubes coniques de 15 mL pour éviter tout déversement lors de l’entreposage dans un congélateur) pour la première solution mère et calculer la quantité d’ingrédient actif insecticide (AI) à ajouter à l’aide de Eq (1) :
        (1)
   2. Préparer un tube de stockage (tube conique de 15 mL recommandé pour les grands volumes, tubes à vis de microcentrifugeuse de 1,5 mL recommandés pour les volumes de 1 mL ou moins) et étiqueter avec le nom de l’insecticide et du solvant, la concentration cible et la date de préparation. Placez le tube et le couvercle sur la balance dans un rack ou un support et tarez la balance.
   3. Peser la quantité souhaitée d’insecticide solide ou liquide AI déterminée à partir de l’étape 2.1.1. (p. ex., deltaméthrine utilisée pour les données représentatives) dans le tube et enregistrer la masse.
   4. Tare la balance et ajouter le volume de solvant souhaité (équivalent au volume cible) au tube, fermer le couvercle immédiatement et enregistrer la masse. Fermez le couvercle du tube immédiatement après avoir ajouté le solvant (acétone utilisée ici) pour éviter l’évaporation et mélanger la solution.
   5. Enregistrez la température ambiante. Certains solvants, comme l’acétone, peuvent avoir des changements importants de volume (et par conséquent de densité) en fonction de la température.
   6. En cas de stockage immédiat, enveloppez le couvercle du tube dans un parafilm (pour réduire l’évaporation), placez-le dans un support / support de tube (pour le garder droit et éviter les fuites), couvrez-le dans une feuille d’aluminium (pour éviter l’exposition aux UV), placez-le dans un sac en plastique refermable (pour réduire l’évaporation) et placez le sac dans un congélateur à -20 ° C. S’il n’est pas entreposé immédiatement, assurez-vous que le couvercle est fixé et couvrez-le dans du papier d’aluminium ou un récipient protégé contre la lumière.
   7. Calculer la concentration réelle de la solution mère (mg/mL) en divisant la masse d’insecticide AI ajoutée par le volume de solvant ajouté (et le volume d’insecticide ajouté s’il est sous forme liquide). Pour calculer le volume de solvant ajouté (ou d’insecticide liquide), divisez la masse ajoutée par la densité connue qui convient à la température enregistrée.
   8. Calculer la masse volumique (g/mL) de la solution mère en divisant la masse totale ajoutée (insecticide et solvant) par le volume total ajouté (solvant et insecticide, s’il est sous forme liquide). Voir l’étape 2.1.7 pour convertir la masse liquide en volume.
2. Diluer en série la solution mère initiale par dilutions à 10 %. Si nécessaire, utilisez ces dilutions en série pour créer une courbe dose-réponse initiale afin d’identifier la plage cible des concentrations d’insecticide pour l’essai biologique.
   1. Calculer le volume de la solution mère insecticide et le solvant à ajouter à chaque tube (p. ex., 1 mL de solution insecticide diluée dans 9 mL de solvant pour une dilution de 10 mL de la concentration précédente).
   2. Vortex la solution mère pendant 10 s. Tare un premier tube de dilution prémarqué sur la balance. Ajouter le volume requis de solution mère au premier tube de dilution à l’aide d’une pipette. Fermez immédiatement le couvercle des deux tubes et enregistrez la masse dans le premier tube de dilution.
   3. Tare à nouveau le premier tube de dilution et ajouter le volume de solvant requis. Fermez immédiatement le couvercle, enregistrez la masse du solvant ajouté et vortex la première dilution pendant 10 s.
   4. Répétez les étapes 2.2.2 et 2.2.3 pour les dilutions restantes.
   5. Conserver toutes les dilutions décrites ci-dessus à l’étape 2.1.6.
   6. Calculer les concentrations réelles des dilutions en suivant l’étape 2.1.7.
   7. Calculer la densité de chaque dilution insecticide en divisant la masse totale ajoutée (solution insecticide et solvant) par le volume total ajouté (solution insecticide et solvant). Pour chaque dilution en série, utilisez la densité de dilution du stock d’insecticide précédent pour calculer la densité de la nouvelle dilution suivant Eq (2) :
      (2)
3. Facultatif : Créez des dilutions d’insecticide avec des incréments plus petits par dilution en série.
   1. Sélectionnez les concentrations et les volumes de chaque nouvelle solution à produire à l’aide d’une courbe dose-réponse des dilutions en série initiales, des essais antérieurs ou de la littérature publiée.
      REMARQUE: Les concentrations choisies doivent entraîner une plage de mortalité de 0 à 100%, avec un minimum de trois concentrations de cette plage pour permettre l’analyse Probit.
   2. Utilisez les dilutions en série comme solutions mères pour effectuer chaque nouvelle dilution et suivez l’étape 2.2 pour créer les nouvelles dilutions entre les dilutions 10 fois.
4. Facultatif : Aliquote de la solution insecticide. Si de plus grands volumes de solutions insecticides sont fabriqués, aliquotez les solutions dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 mL pour éviter la contamination, l’évaporation et la dégradation des solutions mères dues à une manipulation fréquente et à une exposition à la lumière.
   1. Aliquot les solutions, en partant de la concentration la plus faible et en travaillant vers la concentration la plus élevée pour réduire la contamination potentielle. Mélanger chaque solution mère en tourbillonnant pendant 10 s avant d’ouvrir et de pipeter le volume souhaité (p. ex., 0,5 mL) dans un tube à bouchon à vis prélabellisé.
   2. Conservez les aliquotes dans un récipient résistant à la lumière dans un congélateur à -20 °C.
      REMARQUE: Il est recommandé de remplacer régulièrement (mensuellement) les aliquotes par de petites aliquotes neuves prélevées directement sur les dilutions de pesticides de base. Cela limitera le risque de contamination à transférer dans d’autres expériences ou de changements dus à l’évaporation ou à la dégradation des UV pendant que les échantillons sont utilisés sur le banc. Le protocole peut être mis en pause ici et redémarré même des années plus tard, à condition que les solutions insecticides soient stockées correctement (voir étape 2.1.6) et conservées dans le congélateur à -20 °C.
5. Utilisez un stylo marqueur permanent pour marquer le ménisque avant de le stocker afin de surveiller l’évaporation du solvant. Lorsque vous retirez la solution insecticide pour faire des aliquotes, marquez le ménisque chaque fois que la solution est retirée.

3. Préparer l’espace de travail d’essai biologique d’application topique

REMARQUE: Il est recommandé de travailler dans une tente de manipulation d’insectes de paillasse pour faciliter la capture des moustiques ou des mouches qui s’échappent. Voir la figure supplémentaire S1 pour des images d’une tente de manipulation d’insectes.

1. Retirez immédiatement les solutions insecticides nécessaires du congélateur, vortex et placez-les dans un récipient résistant à la lumière à température ambiante pour laisser les insecticides se réchauffer à la température ambiante avant de les utiliser.
   REMARQUE: Les IA insecticides peuvent se séparer du solvant à des températures plus froides. De plus, le volume d’acétone change avec la température, ce qui peut modifier la dose d’insecticide appliquée. Mélanger les solutions et leur permettre de se réchauffer à la température ambiante permet d’assurer la cohérence lors de l’utilisation des solutions insecticides.
2. Établissez tous les outils et matériaux nécessaires pour le test d’application topique dans la tente de manipulation des insectes, comme indiqué dans le tableau des matériaux.
3. Nettoyez le barillet et l’aiguille de la seringue avec de l’acétone de qualité analytique en effectuant 5 lavages par aliquote d’acétone. Complétez cela avec 5 aliquotes séparées pour un total de 25 lavages. Voir la figure supplémentaire S2 pour les pièces de pipetteur de seringue et de répéteur.
   1. Posez 5 tubes de microcentrifugation de 0,5 mL d’acétone chacun.
   2. Remplissez le barillet de la seringue avec 0,025 mL d’acétone du premier tube, puis expulsez l’acétone dans un conteneur à déchets en appuyant rapidement sur le piston. Répétez quatre fois de plus pour effectuer un total de cinq lavages à l’acétone à partir de la même aliquote d’acétone. Ensuite, remplissez complètement le barillet de la seringue avec de l’air et expulsez l’air et les restes potentiels d’acétone dans le conteneur à déchets. Répétez deux autres fois pour effectuer trois « lavages » à l’air.
   3. Répétez l’étape 3.3.2 pour les 4 tubes d’acétone restants.
   4. Créez une poche d’air dans le barillet entre le piston de la seringue et le haut de l’aiguille en tirant légèrement le piston dans le canon (~ 5 mm).
      REMARQUE: Cette poche d’air protège le piston du contact avec les solutions insecticides et réduit le transfert d’insecticide.
   5. Mettez la seringue de côté jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée pour une application topique.
4. Créez une clé contenant les doses à appliquer et attribuez des ID aléatoires suivant des générateurs aléatoires de nombres ou de lettres (voir Fichier supplémentaire 1).
5. Étiquetez les gobelets en plastique avec l’ID aléatoire pour l’évaluation de la mortalité à l’aveugle.
   REMARQUE: Si nécessaire, le protocole peut être mis en pause ici et redémarré à un jour et une heure plus tard. Si plus de quelques heures s’écoulent pendant la pause, il est recommandé de répéter l’étape 3.3 pour s’assurer que la seringue est propre et de remettre les solutions insecticides au congélateur jusqu’à environ une heure avant le dosage des insectes, puis de répéter l’étape 3.1.

4. Préparer des échantillons pour l’essai biologique topique. Voir la figure 1 pour un aperçu de la procédure

1. Trier et peser les moustiques
   1. À l’aide d’un aspirateur alimenté par aspiration par inhalation, aspirer le nombre souhaité de moustiques adultes âgés de 3 à 5 jours nécessaires au test, y compris un excès pour tenir compte des individus endommagés. Transférez les moustiques dans un tube conique (jusqu’à 100 moustiques par tube) en plaçant la pointe de l’aspirateur dans le tube avec du coton enroulé autour de la pointe et expirez doucement et tapotez l’aspirateur. Utilisez le coton pour boucher le tube lorsque l’embout de l’aspirateur est retiré, puis coiffez avec le couvercle. Évitez de remplir l’aspirateur et les tubes avec trop de moustiques à la fois, car cela ajoute un stress supplémentaire sur les moustiques et peut causer la mort.
   2. Abattre brièvement les moustiques dans les tubes en les plaçant pendant au moins 10 min à 4 °C ou en les enfouissant sous la glace dans un bac à glace.
      REMARQUE: Les moustiques peuvent être maintenus à 2 ° C pendant plusieurs heures avec une mortalité minimale²⁹; cependant, il est préférable de minimiser la durée pendant laquelle les moustiques sont sur la glace afin de réduire les effets négatifs potentiels.
   3. Transférez les moustiques renversés dans la tente de manipulation des insectes et déposez soigneusement les moustiques sur un plateau en plastique (par exemple, une boîte de Petri) placé sur la glace. Versez seulement environ 50 moustiques à la fois pour vous assurer que chacun touche le plateau frais en dessous et reste renversé.
   4. Triez les moustiques par sexe en les ramassant doucement par la ou les jambes (ou les ailes) avec une pince et placez chaque sexe dans une tasse de maintien séparée. Comptez le nombre de moustiques de chaque sexe lors du tri et arrêtez-vous lorsque le nombre souhaité est atteint. Lors du tri, enlevez tous les moustiques qui sont blessés (p. ex., jambes manquantes) ou qui sont très gros (p. ex., abdomen anormalement élargi) ou petits (facilement reconnaissables à l’œil nu comme étant plus petits que la taille moyenne des moustiques de cette population).
      REMARQUE: La manipulation des moustiques par les appendices réduit les dommages structurels à leur corps primaire mou (par exemple, l’abdomen).
   5. Enregistrez le poids de chaque tasse de moustiques à l’aide d’une balance analytique avec une précision de 0,1 mg.
      1. Placez une tasse vide avec une boîte de Petri comme couvercle sur la balance et tare la balance. Versez les moustiques dans le récipient, placez le couvercle sur le dessus et placez le récipient sur la balance.
      2. Notez le poids et le nombre combinés d’échantillons sur la feuille de pointage (voir le dossier supplémentaire 2). Replacez immédiatement la tasse de spécimens sur la glace pour les garder immobilisés.
      3. Répétez les étapes 4.1.5.1 à 4.1.5.2 jusqu’à ce que toutes les tasses d’échantillons soient pesées.
   6. Divisez les moustiques préparés en groupes de 20 à 25 dans des tasses séparées placées sur de la glace étiquetées avec les identifiants aléatoires. Lors du transfert de moustiques, visez à réduire le stress et les dommages physiques causés par la pince. Idéalement, ramassez les moustiques à l’aide de pinces 1 à 2 fois seulement: une fois pour le tri / pesée et une deuxième fois potentielle pour le transfert dans les tasses expérimentales.
      REMARQUE: Un nombre idéal de moustiques par tasse est de 20-25, ce qui est suffisant pour une réplique, est raisonnable pour évaluer la mortalité et ne devrait pas entraîner de stress / mort induit par la densité dans la tasse.
2. Trier et peser les mouches des fruits
   1. Anesthésier les mouches en utilisant du CO₂ pendant 7 s.
      REMARQUE: Si les mouches sont exposées au CO₂ pendant plus de 7 s, elles peuvent avoir du mal à ramper et à voler lorsqu’elles se réveillent³⁰.
   2. Versez les mouches sur un sac de glace enveloppé dans du papier de banc et utilisez un pinceau à pointe fine pour séparer et compter les mâles et les femelles.
   3. Utilisez le pinceau pour ramasser doucement les mouches choisies et placez-les dans une bouteille propre et vide. Choisissez un nombre égal de mouches des fruits mâles et femelles (p. ex., 15 mâles et 15 femelles) et étiquetez les bouteilles avec le nom de la souche et le total de la mouche des fruits (p. ex., Canton-S, 30 mouches).
      REMARQUE: Il est important d’avoir un nombre égal de mouches des fruits femelles et mâles, car les mouches des fruits mâles peuvent subir une agressivité accrue les unes envers les autres après avoir été retirées de la présence des femelles³¹. Par conséquent, pour éviter la mortalité ou les blessures non insecticides, il est préférable d’avoir un nombre égal de mâles et de femelles (ou d’omettre complètement les mouches des fruits mâles).
   4. Enregistrez le poids de chaque bouteille de mouches des fruits à l’aide d’une balance analytique.
      1. Placez un flacon vide (étiqueté avec un ID aléatoire, reportez-vous à l’étape 3.4) avec une boîte de Petri comme couvercle sur la balance et tare la balance.
         REMARQUE: Les flacons en verre sont recommandés pour une utilisation avec les mouches des fruits car ils réduisent considérablement l’électricité statique.
      2. Anesthésier la bouteille de mouches des fruits correspondant à l’identification aléatoire du flacon en utilisant du CO₂ pendant 7 s.
      3. Versez les mouches des fruits sur du papier de pesée et utilisez le papier comme entonnoir pour introduire les mouches dans le flacon. Placez le couvercle de la boîte de Petri sur le flacon de mouches des fruits et placez-le sur la balance.
      4. Notez le poids et le nombre combinés de spécimens sur la feuille de pointage, puis placez immédiatement le flacon de mouches des fruits dans un plateau de glace, avec le couvercle toujours sur le dessus pour empêcher les mouches de s’échapper.
      5. Répétez les étapes 4.2.4.1 à 4.2.4.4 pour chaque bouteille de mouches des fruits.
3. Lorsque les étapes ci-dessus sont terminées, passez immédiatement à la section suivante.

5. Échantillons de dose

1. Chargez la seringue avec la concentration d’insecticide appropriée. Commencez par la dose la moins concentrée et travaillez à la dose la plus concentrée avec chaque groupe d’organismes. Pour éviter le gaspillage, ne chargez la seringue qu’avec le volume d’insecticide nécessaire plus un supplément recommandé de 2 μL.
2. Basculez les spécimens sur du ou des papiers de pesée placés sur un plateau sur la glace. Séparez les spécimens qui sont proches les uns des autres à l’aide d’un pinceau propre et sans insecticide ou d’un coton-tige pour permettre un accès facile à chaque spécimen pour le dosage. Pour les moustiques, utilisez également le pinceau pour vous assurer que chaque spécimen est couché sur leur dos et que leur surface ventrale est tournée vers le haut.
3. À l’aide de la seringue, appliquez une gouttelette de solution insecticide (ou d’acétone pour le contrôle) sur le thorax ventral et l’abdomen pour les moustiques et le dos pour les mouches des fruits. Appliquez une gouttelette de 0,2 μL (qui nécessite une seringue de 10 μL) pour les insectes de plus petite taille tels que les mouches des fruits et une gouttelette de 0,5 μL (qui nécessite une seringue de 25 μL) pour les moustiques.
   REMARQUE : La sensibilité aux insecticides ne diffère pas de manière significative entre les parties primaires du corps (comme la tête, le thorax et l’abdomen) par rapport aux appendices (comme les ailes, les jambes ou la trompe)³². Par conséquent, le site d’application n’a pas besoin d’être exact tant que la gouttelette de dose est appliquée sur le corps primaire. Le thorax ventral et la région de l’abdomen sont choisis pour les moustiques parce qu’ils reposent souvent sur leur côté dorsal lorsqu’ils sont renversés, tandis que le dos est choisi pour les mouches des fruits parce qu’ils reposent souvent sur leur côté ventral lorsqu’ils sont renversés. Cette diminution de la spécificité du site d’application permet d’augmenter le débit de cette méthode.
4. Versez immédiatement les échantillons dans le gobelet en plastique étiqueté et recouvrez le gobelet avec un filet et un élastique. Placez la tasse dans un plateau de maintien et notez sur la tasse tous les spécimens qui ont été tués, endommagés ou échappés au cours de ce processus (pour les exclure dans le décompte final des spécimens dans cette tasse). Pour la première tasse, notez l’heure à laquelle le dosage est terminé.
5. Remplacer le ou les papiers de pesée sur lesquels les échantillons sont placés pour éviter la contamination insecticide entre les doses.
6. Répétez le dosage pour chaque tasse jusqu’à ce que tous les échantillons aient été dosés avec les concentrations d’insecticide appropriées et notez l’heure de fin lorsque tous les échantillons ont été dosés.
7. Fournir une solution de saccharose à 10% dans chaque tasse via une boule de coton trempée et mettre les tasses de côté jusqu’à ce que la mortalité soit évaluée le lendemain. Conservez les moustiques à 27 ± 1 °C avec 75 ± 5 % d’humidité relative⁵ et les mouches des fruits à 23 ± 1 °C avec 60 ± 5 % d’humidité relative.
   REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous pressez les boules de coton pour éviter la sursaturation ou la sous-saturation. Les boules de coton doivent être humides mais ne pas dégoulinantes. L’écoulement d’eau sucrée dans la tasse peut entraîner la mortalité des spécimens et donc avoir un impact sur l’évaluation de la mortalité de l’insecticide.

6. Évaluer la mortalité

1. Enregistrer la mortalité des échantillons 24 h après le début de l’exposition à l’insecticide. Classez les moustiques comme vivants s’ils peuvent voler et se tenir debout; comme morts s’ils sont immobiles ou ataxiques (incapables de se tenir debout ou de décoller pour voler), comme décrit par l’OMS⁶. Suivez la même évaluation de la mortalité pour les mouches des fruits ^8,33.
   REMARQUE: Pour évaluer la mortalité retardée, la mortalité peut également être évaluée après 48 et 72 h avec des changements quotidiens d’eau sucrée.
2. Une fois la mortalité enregistrée, placer toutes les tasses d’échantillons dans un sac confiné dans un congélateur pendant au moins 1 h pour vous assurer que tous les échantillons sont morts avant l’élimination ou l’utilisation ultérieure (p. ex., analyse moléculaire ou chimique).

7. Effectuer des réplications

1. Répétez les étapes 3 à 6 sur un nouvel ensemble d’échantillons, en prenant soin d’effectuer des répliques à la même heure chaque jour, car la susceptibilité aux insecticides peut changer en fonction de l’heure du jour³⁴.
2. Assurez-vous d’un minimum de 3 répétitions pour chaque concentration afin d’obtenir une estimation précise de la dose létale qui tue 50 % des échantillons (_{DL 50}). Inclure plus de répliques si un niveau élevé de variabilité est observé.
3. Terminez l’analyse une fois que toutes les données ont été recueillies.

8. Analyser les résultats

1. Enregistrez les données dans un tableur et utilisez la clé d’identification aléatoire pour démasquer les données (étape de référence 3.4). Enregistrez les données sous forme de fichier texte (voir exemple de données dans le fichier supplémentaire 3) pour analyse dans le programme statistique R³⁵ (voir l’exemple de code R dans le fichier supplémentaire 4) ou un autre logiciel de choix³⁶.
2. Dans le logiciel, effectuez l’analyse suivante. Voir Fichier supplémentaire 4 pour un exemple de code R.
   1. Calculer la dose d’insecticide (ng) par masse d’échantillon (mg) après Eq (3) ci-dessous :
      (3)
   2. Calculer la mortalité et appliquer la formule³⁷ d’Abbott pour corriger la mortalité par rapport à la mortalité observée dans chaque témoin³⁷. Alternativement, utilisez la formule de Schneider-Orelli (1947) pour corriger la mortalité³⁸. Avec l’une ou l’autre formule, appliquez la correction à toutes les données, quelle que soit la mortalité dans chaque témoin, comme décrit précédemment³⁷ et mis en œuvre³⁹, à moins que les données de contrôle ne soient anormalement élevées (voir la discussion ci-dessous).
      NOTE: La formule d’Abbott et les alternatives équivalentes, telles que la formule de Schneider-Orelli, ajustent les valeurs de mortalité proportionnellement à l’étendue de la mortalité non observée dans les témoins et ne causeront pas de diminution de la mortalité pour les coupes qui avaient une mortalité de 100%. Pour plus d’informations, consultez les références citées pour ces formules.
   3. Transformer les données de mortalité corrigées en valeurs probit (unité de probabilité)⁴⁰ et effectuer une régression linéaire entre la dose d’insecticide et les données de mortalité transformées. Utilisez un test du chi carré pour évaluer l’ajustement du ou des modèles linéaires.
      REMARQUE : Les valeurs de mortalité de 0 (0 % de mortalité) ou de 1 (mortalité de 100 %) sont retirées des données avant la fin de la transformation probit. Ceci est nécessaire en raison de la nature de la transformation probit. Par conséquent, les données illustrées n’incluront pas les témoins positifs ou négatifs ou toute autre donnée qui a entraîné une mortalité de 0 % ou de 100 % (après l’application de la correction d’Abbott).
   4. Calculer les intervalles de confiance (IC) de_{DL à 50} et 95 % par souche, population et/ou sexe d’échantillon en suivant les méthodes 39,41,42 publiées précédemment.
   5. REMARQUE : Si les IC à 95 % de deux souches ne se chevauchent pas, les souches ont des réponses posologiques significativement différentes.
   6. Le cas échéant, calculer les rapports de résistance (RR) en divisant la DL₅₀ de la déformation d’intérêt par la DL₅₀ de la déformation de référence/témoin.

Figure 1 : Diagramme de protocole d’essai d’application topique. Le protocole d’analyse d’application topique commence par (A) le tri des échantillons sur la glace, suivi (B) de la pesée des échantillons sur une balance analytique, (C) du dosage des échantillons avec une ou plusieurs solutions insecticides et (D) une période d’attente de 24 heures après l’exposition à l’insecticide avec accès à une solution de saccharose à 10 % ad libitum (via une boule de coton trempée), suivie d’une évaluation de la mortalité. Les flèches rouges indiquent le lieu d’application de l’insecticide cible pour les moustiques (à gauche) et les mouches des fruits (à droite). Notez que l’image n’est pas à l’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Ces résultats représentatifs présentent deux souches différentes d’Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), et une souche de champ isolée de Floride avec des mutations de résistance à l’élimination connues F1534C et V1016I (génotype IICC). De plus, Drosophila melanogaster (Canton: souche S) est présenté.

La figure 2 et la figure 3 illustrent la dose-réponse de chaque organisme par souche et sexe testés conformément au protocole ci-dessus. Comme aucune différence n’a été observée entre les courbes dose-réponse des moustiques mâles et femelles au sein de chaque souche (t = 1,70, p = 0,098 pour ROCK et t = 0,64, p = 0,527 pour IICC), les données des deux sexes au sein de chaque souche de moustique ont été regroupées. La DL₅₀ relativisée en masse pour ROCK et IICC est de 0,008 ng/mg (IC à 95 % : 0-0,104) et de 0,336 ng/mg (IC à 95 % : 0,235-0,438), respectivement. Les IC à 95 % de ces valeurs ne se chevauchent pas, ce qui indique des réponses posologiques significativement différentes des souches. Le RR de la souche IICC (par rapport à la souche ROCK) est de 41,7, ce qui, selon l’OMS, est considéré comme très résistant⁵. Pour les mouches des fruits canton-S, la DL₅₀ relativisée en masse est de 0,213 ng/mg (IC à 95 % : 0-0,490).

Figure 2 : Données représentatives des moustiques à l’aide d’un essai biologique d’application topique. Données dose-réponse représentatives provenant d’essais biologiques topiques d’application suivant le protocole ci-dessus utilisant de la deltaméthrine et des moustiques : (A) souches femelles Ae. aegypti ROCK (n = 880) et IICC (n = 550), (B) souches mâles Ae. aegypti ROCK (n = 880) et IICC (n = 569). Les concentrations d’analyse de la deltaméthrine variaient de 0,00075 ng /μL à 9,68705 ng / μL, et la dose de deltaméthrine appliquée (ng) par masse moyenne de moustique (mg) est réfléchie sur l’axe des x. La mortalité est indiquée en proportion sur l’axe des y. La ligne noire traversant chaque groupe de points de données représente la régression linéaire spécifique à la souche et au sexe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Données représentatives des mouches des fruits à l’aide d’un essai biologique par application topique. Données dose-réponse représentatives provenant d’un essai biologique topique en application suivant le protocole ci-dessus utilisant la deltaméthrine et les mouches des fruits : souche D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Les concentrations d’essai de deltaméthrine variaient de 0,00499 à 5,02876 ng / μL, et la dose de deltaméthrine appliquée (ng) par masse moyenne de mouche des fruits (mg) est reflétée sur l’axe des x. La mortalité est indiquée en proportion sur l’axe des y. La ligne noire représente la régression linéaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Tente de manipulation d’insectes de paillasse. La tente de manipulation des insectes de paillasse est utilisée pour faciliter la capture des moustiques ou des mouches qui s’échappent pendant le test d’application topique. La structure est fermée en A et ouverte en B. Cette structure a été construite avec un tuyau en PVC et un tissu à mailles fines. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Unité d’applicateur de seringue et de répéteur. Seringue et appareil applicateur de répéteur utilisé pour doser les insectes. Les pièces principales comprennent 1) aiguille, 2) barillet de seringue, 3) piston, 4) répéteur et 5) bouton de répéteur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Script de randomisation : Script de randomisation pour créer des étiquettes non biaisées pour toutes les tasses de chaque expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Feuille de pointage de mortalité : Feuille de pointage de mortalité pour faciliter l’évaluation de la mortalité. La feuille comprend également les endroits où enregistrer toutes les autres informations importantes à enregistrer, telles que référencées dans le protocole, telles que les heures de début et de fin de l’application de l’insecticide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Exemples de données sur la mortalité : Exemple de fichier de données utilisé pour créer la figure 2. Les descriptions des en-têtes de colonne sont les suivantes: « id » = code d’identification de chaque point de données; « espèce » = nom de l’espèce (p. ex., Aedes aegypti); « insecticide » = nom de l’insecticide appliqué par voie topique (p. ex. deltaméthrine); « souche » = nom de la souche de moustique (p. ex., ROCK); « date » = date de début de l’application topique; « sexe » = sexe des moustiques; « âge » = âge des moustiques (jeunes = 3-5 jours; vieux = 4 semaines); « total.mosq » = nombre total de moustiques pesés en lot; « poids » = poids (mg) de tous les moustiques dans le lot; « concentration » = concentration d’insecticide (μg/mL); « seringue » = volume de gouttelettes (mL) de la seringue; « dose » = quantité d’ingrédient actif insecticide appliqué sur chaque moustique (ng); « total » = nombre de moustiques dans chaque tasse; « morts » = nombre de moustiques morts dans chaque tasse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Code d’analyse R : Exemple de code R pouvant être utilisé pour effectuer l’analyse Probit (comme décrit à l’étape 8 du protocole). Les résultats représentatifs (accessibles via l’exemple de fichier de données supplémentaire) peuvent être utilisés avec ce code R. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cet article présente un protocole adapté pour le test d’application topique pour les moustiques et les mouches des fruits. Cette procédure pourrait être facilement adaptée pour être utilisée sur le terrain et avec d’autres organismes car elle nécessite un équipement spécialisé minimal. Vous trouverez ci-dessous les étapes critiques de ce protocole, les modifications potentielles, les conseils de dépannage, les limites de la méthode et l’importance de cette méthode.

Étapes critiques du protocole : Il y a trois étapes critiques dans le protocole qui, si elles ne sont pas effectuées correctement, peuvent avoir un impact considérable sur les résultats de l’essai biologique : la précision de la concentration d’insecticide, l’élimination des échantillons et l’évaluation de la mortalité.

Précision de la concentration d’insecticide:
Il est extrêmement important d’avoir des solutions insecticides précises pour obtenir des courbes dose-réponse reproductibles et des résultats significatifs. L’approche volumétrique de la préparation d’une solution insecticide est plus courante dans la littérature pour le bioessais^{en bouteille 7} du CDC et les applications topiques 13,14,43. Cependant, l’approche gravimétrique décrite ici est intrinsèquement plus précise en raison de la prise en compte de la température par l’inclusion de la densité (spécifique à la température), ce qui conduit à une préparation de formulation plus précise.

Spécimen knockdown:
L’abattage des échantillons est un élément essentiel de cette méthode et permet l’administration précise de l’insecticide et les mesures de poids. Cependant, l’élimination des organismes comporte inévitablement un risque de stress physique et de dommages, comme démontré précédemment³⁰. Par conséquent, soyez prudent et attentif lorsque vous renversez les spécimens pour vous assurer i) que chaque spécimen est renversé pour une durée similaire, ii) que la longueur de l’abattage est réduite au minimum et iii) que la méthode d’abattage est maintenue cohérente dans tous les spécimens. De plus, il est conseillé de tester la méthode knockdown séparément, avant l’application d’insecticide, pour s’assurer que la méthode est efficace et n’induit pas de mortalité de contrôle supérieure à 10%. Le test initial peut prendre plus de temps pour un utilisateur inexpérimenté, ce qui entraîne des temps de knockdown plus longs. Par conséquent, soyez prudent lors de l’interprétation des résultats des premiers essais.

Évaluation de la mortalité :
L’évaluation de la mortalité peut être difficile, surtout lorsque l’insecticide ne tue pas complètement, mais ne fait que renverser ou mutiler le moustique ou la mouche. Par conséquent, il est important de connaître l’impact de l’insecticide sur l’organisme cible et d’avoir une définition claire des organismes « morts » (ou renversés) avant de commencer. De plus, il est recommandé que la même personne évalue la mortalité entre les doses et les répétitions afin de réduire la variation.

Modifications du protocole : Plusieurs modifications décrites ci-dessous peuvent être appliquées à ce protocole pour améliorer sa polyvalence et son accessibilité.

Adaptation du test aux insectes de plus ou moins grande taille :
Lors de l’utilisation d’échantillons plus petits ou plus grands, il est conseillé d’appliquer un volume d’insecticide plus ou moins important, respectivement. À titre d’exemple, nous avons adapté le protocole anti-moustiques aux mouches des fruits en réduisant la dose de 0,5 μL à une dose de 0,2 μL. Assurez-vous que la bonne taille de seringue est choisie pour le volume de dose choisi.

Adaptation du test aux insectes des champs :
Lors de l’utilisation d’insectes de terrain, il peut y avoir plus de variation dans la taille des insectes. Par conséquent, il serait recommandé de peser les insectes en petits groupes (p. ex., par tasse) plutôt qu’en grand groupe (p. ex., tous les insectes utilisés pour une expérience). Cela peut aider à saisir la variation potentielle de la susceptibilité aux insecticides associée aux différences de masse des insectes des champs.

Modifications de l’équipement :
Tente de manipulation d’insectes: Le dosage de l’échantillon peut être effectué sous une tente de manipulation d’insectes qui est simplement construite avec un tuyau en PVC et une moustiquaire. Cela peut être une solution de rechange à une pièce fermée (p. ex., insecticide) et aider à éliminer la contamination insecticide potentielle dans les zones où l’élevage d’insectes pourrait avoir lieu. Cette tente de manipulation d’insectes est facile à construire et peu coûteuse (~ 70 $). Alternativement, une cage de manipulation d’insectes pourrait être achetée (~ 425 $).

Table de refroidissement : Des sacs de glace ou des plateaux de glace peuvent être utilisés pour abattre l’échantillon et/ou garder l’échantillon renversé.

Incubateur: Les incubateurs sont recommandés pour élever l’échantillon et le conserver pendant 24 heures après le traitement insecticide. Si un incubateur n’est pas disponible, il peut être construit. L’équipement nécessaire à la construction de l’incubateur comprend un conteneur isotherme, un humidificateur, des câbles chauffants, un régulateur d’humidité et de température et une lumière, ce qui devrait représenter un coût total d’environ 170 $, suivant et développant les méthodes^{précédentes 44}.

Gobelets de maintien : Bien que des gobelets en plastique soient utilisés pour trier et retenir l’échantillon traité, des gobelets en papier doublés de cire ou des contenants en verre seraient des solutions de rechange appropriées.

Modification de l’organisme et du stade de vie :
Cette méthode est très adaptable pour une utilisation avec d’autres vecteurs, insectes et / ou arthropodes tels que les moustiques Culex quinquefasciatus ³², les mouches domestiques³² et les cafards⁴⁵, ainsi que les stades de vie non adultes, tels que les larves de moustiques⁴⁶.

Modification de l’emplacement de l’application topique :
Cette méthode décrit l’application de l’insecticide sur le thorax ventral et la région de l’abdomen pour les moustiques (et le dos pour les mouches des fruits). Cependant, d’autres emplacements d’application peuvent être utilisés tant que le site d’exposition est cohérent. La cohérence est importante car la sensibilité à l’insecticide peut varier en fonction de l’emplacement d’application³².

Conseils de dépannage : Cette méthode comporte plusieurs étapes qui sont initialement difficiles. Vous trouverez ci-dessous quelques-uns des problèmes les plus courants que l’on pourrait rencontrer.

Solutions insecticides qui fuient/s’évaporent :
Les insecticides sont généralement dissous dans l’acétone, un composé hautement volatil. Cela signifie que l’acétone s’évapore rapidement à température ambiante, augmentant les concentrations d’insecticide au fil du temps. Si les solutions insecticides semblent fuir ou s’évaporer, refaire les solutions, s’assurer que le couvercle du tube est bien verrouillé et vérifier que les protocoles d’entreposage sont correctement respectés (p. ex., un parafilm est utilisé et les tubes sont entreposés à la verticale). Si une fuite persiste, essayez de remplir les tubes avec un volume plus faible pour laisser plus de place au changement de volume que l’acétone éprouve à différentes températures. De plus, si vous utilisez de l’acétone comme solvant, assurez-vous que les tubes sont conçus pour le stockage de l’acétone (p. ex., plastiques FEP, TFE et PFA). Si vous utilisez des insecticides hydrophobes, conservez les solutions dans des flacons en verre (car les insecticides hydrophobes adhèrent moins au verre que le plastique). Il est également recommandé de marquer le ménisque de la solution avant le stockage pour surveiller l’évaporation.

Poids dérivant sur microbalance lors de la pesée des organismes:
Si la lecture du poids sur la balance dérive (montant ou descendant lentement), cela pourrait être dû à la statique. La dérive se produit le plus souvent lors de la pesée d’organismes dans des articles en plastique, car le plastique peut facilement contenir une charge statique. Pour éviter cela, un papier de pesage peut être placé sous le récipient en plastique à peser, ou un récipient non plastique tel que du verre peut être utilisé.

Résultats anormaux de mortalité :
Il existe de nombreuses façons dont les résultats de mortalité peuvent sembler anormaux, comme l’observation d’une mortalité élevée chez les témoins ou d’une mortalité élevée / faible pour toutes les doses d’insecticide. Passez en revue les cas suivants pour résoudre chaque scénario.

Mortalité contrôlée élevée
S’il y a une mortalité élevée dans le groupe témoin (10 % ou plus), évaluez la méthode de renversement et la durée pendant laquelle les échantillons sont renversés. Si possible, raccourcissez la durée pendant laquelle les spécimens sont renversés. D’autres facteurs potentiels à prendre en compte pour une mortalité élevée chez les témoins comprennent i) la vérification si les paramètres de l’incubateur sont corrects – des températures anormales et / ou de l’humidité pourraient entraîner une mortalité accrue. La température et l’humidité doivent être vérifiées à l’aide d’un enregistreur de données indépendant. ii) Évaluation de la manipulation des insectes. Manipuler les insectes trop ou trop grossièrement pourrait entraîner une mortalité élevée. iii) Vérifier s’il n’y a pas de contamination insecticide dans l’acétone à 100 % utilisée pour traiter le groupe témoin ou sur l’instrumentation. Remplacez l’acétone et nettoyez tous les instruments avec de l’acétone ou de l’éthanol. Évitez la contamination en remplaçant fréquemment les gants, en empêchant les déversements et en nettoyant les instruments. Notez que dans le dossier supplémentaire 3, un maximum de deux moustiques sont morts dans les tasses témoins (acétone seulement). Ce niveau de mortalité n’est pas considéré comme élevé (il est inférieur à 10%), et par conséquent, il n’y avait pas lieu de s’inquiéter.

Mortalité élevée dans tous les groupes exposés (mais pas dans les groupes témoins)
Utilisez des concentrations d’insecticide plus faibles ou des volumes de dose plus faibles pour les tests. Les doses utilisées peuvent être supérieures à la dose minimale qui n’induira pas de mortalité. Utilisez plusieurs dilutions 10 fois pour identifier la plage de doses correcte et exclure la contamination. Pour éviter la contamination, commencez à doser avec la concentration la plus faible et travaillez vers la concentration la plus élevée. De plus, assurez-vous que tout l’équipement utilisé est régulièrement nettoyé avec de l’acétone et / ou de l’éthanol, que les doses appliquées à l’échantillon sont très faibles et que même la moindre contamination croisée pourrait avoir un impact sur les résultats.

Faible mortalité dans tous les groupes exposés
Utilisez des concentrations d’insecticide plus élevées. Les doses utilisées peuvent toutes être trop faibles pour causer la mortalité dans la population. Pour identifier la plage de doses correcte, exposez les échantillons à plusieurs doses plus concentrées de 10 fois. S’assurer que les solutions insecticides n’ont pas expiré ou dégradé (potentiellement en raison d’une température élevée ou d’une exposition à la lumière). Si les solutions ont expiré ou sont soupçonnées de s’être dégradées, refaites les solutions et assurez-vous que les conditions de stockage appropriées sont respectées.

Mortalité incohérente entre les répétitions/jours
Le moment de la journée où les insectes sont exposés à l’insecticide pourrait affecter le niveau de résistance exprimé, en particulier pour la résistance métabolique³⁴. Répétez ce protocole pendant la même période de temps chaque jour pour éviter que l’heure de la journée ne soit une variable potentielle contribuant aux changements dans la mortalité. D’autres facteurs potentiels contribuant à une mortalité incohérente entre les répétitions comprennent i) les spécimens élevés différemment entre les expériences. S’assurer que tous les spécimens sont de la même tranche d’âge, élevés à la même température et aux mêmes densités et disponibilités alimentaires. ii) les concentrations d’insecticides se dégradent avec le temps ou deviennent plus concentrées en raison de l’évaporation de l’acétone. Refaites les solutions et assurez-vous de bonnes conditions de stockage. iii) Score de mortalité incohérent. Assurez-vous que la même personne enregistre la mortalité ou élaborez un protocole clair à utiliser de manière cohérente dans l’ensemble de l’équipe. Utilisez la notation à l’aveugle pour réduire le biais dans la notation de la mortalité.

Insectes collant à la surface du plateau de tri:
L’acétone réagit aux plastiques utilisés dans ce protocole, tels que les boîtes de Pétri. L’échantillon adhérera probablement à la surface s’il utilise de l’acétone sur des boîtes de Pétri ou des surfaces en plastique similaires. Cette adhérence peut être évitée en tapissant le bac de tri avec du papier de pesage ou en utilisant un bac de tri non plastique. De plus, la condensation à la surface du plastique dans le plateau de tri ou les gobelets de retenue peut entraîner l’adhérence des insectes à la condensation, ou l’échantillon peut être trop froid et potentiellement geler à la surface. Ajustez la méthode d’élimination pour réduire la condensation tout en évitant que les échantillons ne deviennent trop froids ou gelés (p. ex., placez le papier de pesée entre les échantillons et le bac de tri en plastique).

Erreurs d’analyse R :
Une fois les données sur la mortalité recueillies, diverses complications peuvent survenir au cours de l’analyse. La raison la plus courante pour laquelle un code R ne peut pas effectuer les actions du fichier de données est que le format de données ne correspond pas au code (par exemple, les en-têtes de colonne et/ou les cellules vides). Si des complications plus graves surviennent, reportez-vous aux pages d’aide R intégrées à Rstudio³⁵.

Limites de la méthode d’application topique décrite ci-dessus:
L’absorption d’insecticide par voie d’application topique n’imite pas l’exposition naturelle:
L’application topique sur le corps primaire n’est pas le moyen naturel d’absorption de l’insecticide. Sur le terrain, les insectes absorbent principalement les insecticides par leurs pattes pendant la durée de leur contact avec la surface traitée à l’insecticide ou sur leurs ailes par de petites particules ^{d’aérosol 47,48}, plutôt qu’une exposition rapide sur la surface ventrale. Cependant, l’application directe d’une dose connue d’insecticide établira avec précision une réponse phénotypique aux insecticides, nécessaire pour des études génétiques et évolutives ou des comparaisons de la susceptibilité aux insecticides dans l’espace ou le temps. Par conséquent, cette approche est bénéfique pour tester la résistance technique mais ne mesurera pas directement la résistance pratique (l’efficacité de l’outil d’intervention réel dans un contexte de terrain¹⁵). Cependant, il est important de noter que les méthodes standard actuelles (par exemple, les tests en tube de l’OMS et les essais biologiques sur les bouteilles du CDC) ne peuvent pas non plus capturer ou imiter l’exposition aux aérosols (c’est-à-dire par buée) aux insecticides sur le terrain.

Les essais d’application topique ne peuvent évaluer que les insecticides d’absorption de contact:
Cette méthode est destinée aux insecticides qui agissent par contact et absorption de l’insecticide et non pour une utilisation avec des insecticides oraux, tels que l’acide borique couramment utilisé dans les appâts à sucre toxique attrayants⁴⁹.

Signification de la méthode:
La méthode d’application topique élargit les normes bien établies pour les essais biologiques d’insecticides en calculant la dose létale (et non la concentration) et en mesurant la résistance technique (non pratique)¹⁵. Vous trouverez ci-dessous les avantages et les inconvénients de cette méthode par rapport aux tests de sensibilité aux insecticides existants.

Calcul de la dose létale :
Cette méthode détermine la dose létale de l’insecticide, plutôt que la concentration létale que les essais biologiques du CDC et de l’OMS utilisent pour établir la dose discriminante¹¹. La dose létale est plus significative parce qu’il s’agit d’une quantité quantifiée d’insecticide connue pour provoquer la mortalité. En revanche, la concentration létale ne tient pas compte de la quantité d’insecticide que l’organisme acquiert réellement. Lors de l’utilisation du calcul de la dose létale, les différences entre les profils de susceptibilité dépendant du sexe ou de la taille peuvent être observées et quantifiées avec plus de précision, ce qui rend cette mesure encore plus polyvalente.

Résistance technique :
Cette méthode évalue la résistance technique, qui est la résistance mesurée dans des environnements normalisés et contrôlés. De telles mesures conviennent à la surveillance de la propagation de la résistance aux insecticides et à l’établissement d’un lien entre la résistance phénotypique et les marqueurs potentiels¹⁵. En raison de la diminution de la variation de la mortalité résultant de l’essai biologique d’application topique, il permet une meilleure identification de nouveaux marqueurs de résistance. Cependant, en raison de l’exposition non naturelle des insecticides au moustique, ce test ne convient pas à l’estimation de l’efficacité d’une intervention spécifique dans une population spécifique. D’autres essais sont nécessaires pour mesurer cette résistance pratique¹⁵.

Adaptabilité de l’échantillon :
Cette méthode peut être pratiquée sur d’autres arthropodes importants tels que les ravageurs des cultures (p. ex., le doryphore de la pomme de terre), les parasites domestiques (p. ex., les cafards et les punaises de lit) ou les pollinisateurs (p. ex., les abeilles) avec de simples changements à l’approche de démolition et/ou à la dose, au volume et/ou à la concentration d’insecticide (comme décrit ci-dessus). La facilité d’adaptabilité peut aider à analogiser la recherche sur la résistance aux insecticides dans différents domaines de recherche. L’utilisation d’une valeur LD₅₀ au lieu d’une concentration létale qui tue 50% des spécimens (CL₅₀) permet une comparaison précise entre les espèces.

Coût:
À l’instar des essais biologiques en bouteille du CDC et des tests en tube de l’OMS, les coûts d’exécution du test d’application topique sont minimes (voir le tableau des matériaux). Les pièces d’équipement essentielles sont la seringue (environ 70 $) et le distributeur (environ 100 $), qui sont réutilisables dans tous les essais.

Nombre de spécimens nécessaires :
Un minimum de 20 à 25 échantillons doit être utilisé par tasse d’essai d’application topique. Il est recommandé d’analyser au moins cinq concentrations d’insecticide par expérience, avec un minimum de trois répétitions recommandées pour la procédure. Dans l’ensemble, cela donne un minimum de 300 à 375 échantillons nécessaires pour un test complet, comparable au nombre d’échantillons nécessaires pour effectuer des tests d’intensité de résistance à l’aide de tests en tube de l’OMS ou de tests biologiques en bouteille du CDC. Cependant, si la variabilité réduite est obtenue avec le bioessais d’application topique, le même nombre d’échantillons peut conduire à plus de puissance statistique pour comparer les données de susceptibilité à travers l’espace ou le temps.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Thomas Scientific	20A00L068	Stockage de l’aliquote d’acétone
Tubes à bouchon à vis de 1,5 mL	Thomas Scientific	1182K23	Stockage de dilution d’insecticide
Tubes coniques de 15 mL	VWR	339651	Stockage de dilution d’insecticide
Flacons de verre à scintillation de 20 mL	Fisher Scientific	0334125D	Pesée des mouches des fruits
25 &mu ; Seringue L	Fisher Scientific	14815288	Applicateur topique
Acétone	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99,6 %, 4 L
Aedes aegypti (souche IICC)	USDA CMAVE	NA	Résistant aux
insecticidesAedes aegypti (souche Rockefeller)	CDC	NA	Sensible aux insecticides
Échelle analytique	Fisher Scientific	14-557-409	Précision jusqu’à 0,1 mg
Aspirateur	Amazon	6.49986E+11	Dispositif de collecte de moustiques
Papier de banc	VWR	89126-794	Placer sous l’espace
de travail Cotons-tiges	Amazon	B092S8JVQN	Utilisation pour trier les insectes
Boules de coton	Amazon	B0769MKZWT	Utilisation pour la solution
Distributeur	Fisher Scientific	1482225	Pipeteur à répétition
Drosophila melanogaster (souche Canton-S)	Université du Wisconsin-Madison	NA	Sensible aux insecticides
Pinceaux à pointe fine	Amazone	B07KT2X1BK	Utilisation pour le tri des insectes
Bouteilles de stock pour mouches des fruits	Fisher Scientific	AS355	Utilisation pour l’élevage et le tri mouches à fruits
Distributeur portatif de CO2	Fisher Scientific	NC1710679	Utilisation pour abattre les insectes
Gobelets de maintien	Amazon	B08DXG7V1S	Plastique transparent
Bloc réfrigérant	Amazon	B08QDWMMW5	Utilisation pour abattre les mouches
fruits Bacs à glace	Amazon	9301085269	Utilisation pour abattre les insectes
Insecte pince	Amazon	B07B4767WR	Pince à insectes
Insecticide	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltaméthrine
Autocollants d’étiquetage	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Autocollants à points de couleur
Ruban d’étiquetage	Amazon	B00X6A1GYK	Ruban blanc
	Filet Amazon	B07F2PHHWV	Utilisation pour couvrir les gobelets et les insectes tente de manutention
Boîtes de Pétri	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
Tuyau PVC	Lowe' s	23971	Matériaux de la tente de manipulation des insectes
Élastiques	Amazon	B00006IBRU	Utilisation pour fixer les mailles/filets sur les tasses
Saccharose	Amazon	B01J78INO0	Sucre blanc granulé
Papier de pesée	VWR	12578-165	4 » x 4 »