Article de méthode

Retrait d’un site de démarrage translationnel interne de l’ARNm tout en conservant l’expression de la protéine pleine longueur

DOI :

10.3791/63405

⸱

16 mars 2022

 ,  ,  , 
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Le protocole actuel décrit une seule mutation M213L dans Gja1 qui conserve la génération Connexin43 pleine longueur mais empêche la traduction de l’isoforme GJA1-20k traduite en interne plus petite.

Résumé

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Le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9, basé sur des mécanismes de réparation du génome, permet la génération de modèles murins modifiés par des gènes plus rapidement et plus facilement par rapport à la recombinaison homologue traditionnelle. Le système CRISPR-Cas9 est particulièrement attrayant lorsqu’une mutation monopoint est souhaitée. La protéine de jonction lacunaire, Connexin 43 (Cx43), est codée par le gène Gja1, qui a un seul exon codant et ne peut pas être épissé. Cependant, Gja1 produit non seulement la protéine Cx43 pleine longueur, mais jusqu’à six isoformes tronquées N-terminus par un processus connu sous le nom de traduction interne, résultat de l’initiation de la traduction ribosomique aux sites de départ internes AUG (méthionine). GJA1-20k est l’isoforme tronquée de Cx43 la plus couramment générée initiée au codon AUG à la position 213 de l’ARNm Gja1. Parce que le résidu 213 se produit à la fin du dernier domaine transmembranaire de Cx43, GJA1-20k est effectivement la queue C-terminus de 20 kDa de Cx43 en tant que protéine indépendante. Des chercheurs antérieurs ont identifié, dans les cellules, qu’un rôle essentiel de GJA1-20k est de faciliter le trafic des hémicanaux de jonction lacunaire Cx43 sur toute la longueur vers la membrane plasmique. Pour examiner ce phénomène in vivo, une souris mutante avec une mutation ponctuelle Gja1 a été générée qui remplace l’ATG (méthionine) au résidu 213 par la TTA (leucine, mutation M213L). Le résultat de M213L est que l’ARNm Gja1 et le Cx43 pleine longueur sont toujours générés, mais la traduction de Gja1-20k est considérablement réduite. Ce rapport se concentre sur le choix du site de l’enzyme de restriction pour développer un modèle murin à un acide aminé muté (Gja1 M213L / M213L). Ce protocole décrit des souris génétiquement modifiées par le système CRISPR-Cas9 et un génotypage rapide en combinant la PCR et les traitements enzymatiques de restriction.

Introduction

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La Connexine 43 pleine longueur (Cx43) et l’isoforme tronquée N-terminus, GJA1-20k, codées par le même ARNm GJA1 mais utilisent des codons de départdifférents 1 pour initier la traduction. La traduction Cx43 se produit au premier codon de début AUG, tandis que la traduction GJA1-20k commence à l’AUG au résidu 213. Il a déjà été constaté que GJA1-20k a des rôles essentiels pour le trafic complet de Cx43, la stabilisation de l’actine et la régulation de la morphologie mitochondriale in vitro 1,2,3.

Pour comprendre le ....

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Protocole

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« Tous les protocoles de soins et d’études sur les animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Cedars-Sinai Medical Center et de l’Université de l’Utah. Des souris femelles C57BL/6J obtenues à partir de sources commerciales à l’âge de 8 à 9 semaines (voir tableau des matériaux) ont été utilisées pour les expériences.

1. Préparation au ciblage génique

  1. Sélectionnez la séquence cible guide autour du site de mutation ciblé codant M213 à l’aide de l’algorithme Web CRISPOR 4,9,10 (voir Tableau de....

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Résultats

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Le système d’édition de gènes CRISPR/Cas9 produit une mutation ATG en TTA et une mutation silencieuse TCC en TCG à 56 264 279 à 56 264 281 et à 56 264 291 à 56 264 293 sur le chromosome 10 de la souris, ou à 869 à 871 et 881 à 883 sur l’ARNm Gja1, respectivement. Ces mutations entraînent une mutation de la méthionine 213 à la leucine (M213L) sur la protéine GJA1 et la mutation TTC en TTG perturbe une séquence PAM voisine pour éviter une édition génétique indésirable (Figure 1). Les détails d.......

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Discussion

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Un modèle murin modifié par un gène est une approche courante pour comprendre la fonction des gènes. Cependant, étant donné que l’isoforme GJA1-20k traduite en interne est traduite à partir du même ARNm Gja1 que Cx43 pleine longueur, une stratégie créative a été conçue pour conserver l’expression Cx43 pleine longueur tout en supprimant l’expression GJA1-20k. L’approche est basée sur une mutation du codon de départ interne de GJA1-20k. Avec une mutation ponctuelle unique, M213 a été basculé en L sur l’ARNm Gj.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Le projet a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 et R01HL159983) à RMS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 mL Tube PCR à 8 bandelettesThomas Scientific1148A28
0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15575-038Pour tampon de micorinjection pronucléaire
10x Tampon CutSmartNew England BiolabsB7204STampon de digestion pour NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027Pour tampon de micorinjection pronucléaire
50x TAE TamponInvitrogen24710-030
Thermocycleur à 96 puitsApplied BiosystemsModèle # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664souche
de souris Système d’imagerie Chemidoc MPBio-radPour prendre une image en gel par lumière UV 302 nm
protéine eSpCas9MilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024STampon de chargement pour électrophorèse
Gants
hCG (gonadotrophine chorionique humaine)MilliporeSigma23-073-425G
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab softwareBio-radPour analyser l’image du gel
Stéréomicroscope inversé avec plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Kits de génotypage de sourisRoche DiagnosticsKK7352Pour la lyse tissulaire ou cellulaire, l’extraction d’ADN et la PCR master mix
KSOMLifeGlobalZEKS-050milieu de culture embryonnaire
Milieu de laboratoire coart
M2MilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125SPour digérer le produit PCR
Eau sans nucléaseAmbionAM9937Pour diluer les réactifs
Huile de paraffineNacalai USA2613785
Plugged 20 &mu ; L pointe de pipette fineFisherScientific02-707-171Pour prélever les blastocytes
PMSG (jument gestante' s gonadotrophine sérique)ProSpec-TanyHOR-272
Chlorure de sodiumInvitrogenAM9760Gmicorinjection pronucléaire
SYBR sans danger DNA Gel StainInvitrogenS33102Pour détecter les bandes dans le gel
tracrRNADharmaconU-002000-120ARN guid
Pour tampon de

Références

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  1. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
  2. Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercal....

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Mots-clés

dition g nique CRISPR Cas9traduction interneconnexine 43mutation ponctuelle Gja1g n ration de mod le muring notypage par PCRdigestion par enzyme de restrictionlectrophor se sur gel d agarosepurification de l oligo donneurefficacit de l dition du g nome

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