Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

Jack Northrop; Donald B. Oliver; Ishita Mukerji

doi:10.3791/63433

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Article de méthode

Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

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DOI :

10.3791/63433

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16 mars 2022

Jack Northrop¹ , Donald B. Oliver¹^,² , Ishita Mukerji¹^,²

¹Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, ²Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Dans cet article

Résumé

L’étude détaille la méthodologie de la cartographie FRET, y compris la sélection des sites d’étiquetage, le choix des colorants, l’acquisition et l’analyse des données. Cette méthodologie est efficace pour déterminer les sites de liaison, les changements conformationnels et les mouvements dynamiques dans les systèmes protéiques et est plus utile si elle est réalisée en conjonction avec les informations structurelles 3D existantes.

Résumé

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est une méthode établie basée sur la fluorescence utilisée pour mesurer avec succès les distances dans et entre les biomolécules in vitro ainsi qu’à l’intérieur des cellules. Dans FRET, l’efficacité du transfert d’énergie, mesurée par les changements d’intensité de fluorescence ou de durée de vie, est liée à la distance entre deux molécules ou étiquettes fluorescentes. La détermination de la dynamique et des changements conformationnels à partir des distances ne sont que quelques exemples d’applications de cette méthode aux systèmes biologiques. Dans certaines conditions, cette méthodologie peut ajouter et améliorer les structures cristallines de rayons X existantes en fournissant des informations sur la dynamique, la flexibilité et l’adaptation aux surfaces de liaison. Nous décrivons l’utilisation du FRET et des déterminations de distance associées pour élucider les propriétés structurelles, par l’identification d’un site de liaison ou les orientations des sous-unités dimères. Grâce à un choix judicieux des sites de marquage et souvent à l’utilisation de plusieurs stratégies de marquage, nous avons appliqué avec succès ces méthodes de cartographie pour déterminer les propriétés structurelles globales d’un complexe protéine-ADN et du système de translocation de protéines SecA-SecYEG. Dans le système SecA-SecYEG, nous avons utilisé des méthodes de cartographie FRET pour identifier le site de liaison des préprotéines et déterminer la conformation locale de la région de séquence de signaux liés. Cette étude décrit les étapes à suivre pour effectuer des études de cartographie FRET, y compris l’identification des sites d’étiquetage appropriés, la discussion des étiquettes possibles, y compris les résidus d’acides aminés non natifs, les procédures d’étiquetage, la façon d’effectuer des mesures et l’interprétation des données.

Introduction

Pour les protéines, l’élucidation de la dynamique ainsi que les connaissances structurelles en 3 dimensions (3D) conduisent à une meilleure compréhension des relations structure-fonction des systèmes biomoléculaires. Les méthodes structurelles, telles que la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique cryogénique, capturent une structure statique et nécessitent souvent la détermination de plusieurs structures pour élucider les aspects de la liaison et de la dynamique des biomolécules¹. Cet article décrit une méthode basée sur une solution pour mapper des éléments structurels globaux, tels que des sites de liaison ou des interac....