Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

Andrea Cavaliere; Silvia Marchet; Ivano Di Meo; Valeria Tiranti

doi:10.3791/63452

Article de méthode

Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

DOI :

10.3791/63452

⸱

9 mars 2022

Andrea Cavaliere^*¹ , Silvia Marchet^*¹ , Ivano Di Meo¹ , Valeria Tiranti¹

¹Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho⁰ ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.

Résumé

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La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.

Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho⁰) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho⁰ , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.

Introduction

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Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)¹. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique². L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplicatio....

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Protocole

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REMARQUE: L’utilisation de fibroblastes humains peut nécessiter une approbation éthique. Les fibroblastes utilisés dans cette étude ont été dérivés de patients atteints de DM et stockés dans la biobanque institutionnelle conformément aux exigences éthiques. Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules. Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire sous une armoire à flux laminaire stérile à température ambiante (RT, 22-25 °C). Utilisez des solutions filtrées stériles adaptées à la culture cellulaire et aux équipements stériles. Cultiver toutes les lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂. Des te....

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Résultats

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La génération de cybrides nécessite 3 jours de travail en laboratoire plus une période de sélection (~ 2 semaines) et 1-2 semaines supplémentaires pour la croissance des clones. Les étapes critiques sont la qualité des cytoplastes et la période de sélection. La morphologie des cybrides ressemble à celle des cellules donneuses rho⁰. L’attribution de l’ADNmt et de l’ADNn corrects dans les cybrides est obligatoire pour confirmer l’identité des cellules. Un exemple est donné à la figure 2

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Discussion

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L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation¹⁶. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 1988^17,18, et depuis lors, un grand nombre de mutations ont été dé.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été réalisée au Centre d’étude des maladies pédiatriques mitochondriales (http://www.mitopedia.org), financé par la Fondation Mariani. VT est membre du Réseau européen de référence pour les maladies neuromusculaires rares (ERN EURO-NMD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-Bromo-2'-Deoxyuridine	Sigma-Aldrich (Merck)	B5002-500MG
6 puits Plaques	Corning	3516
96 puits Plaques	Corning	3596
Kit d’extraction d’ADN de culture de sang et de cellules	QIAGEN	13323
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Avanti J-25	7 200 rcf, 37 ° ; C
Flacons de centrifugeuse, 250 mL	Beckman Coulter	356011
Cytochalasine B de Drechslera dematioidea	Sigma-Aldrich (Merck)	C2743-200UL
Dialysé FBS	Gibco	26400-036 100mL
DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de Sodium)	EuroClone	ECB7501L
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/ o Calcium sans magnésium)	EuroClone	ECB4004L
Ethanol Absolu Anhydre	Carlo Erba	414601
FetalClone III (Produit de sérum bovin)	Cytiva - HyClone Laboratories	SH30109.03
Pipettes pasteur en verre	VWR	M4150NO250SP4
Microscope de recherche inversé pour la microscopie à cellules vivantes	Nikon	ECLIPSE TE200
JA-14 Rotor à angle fixe en aluminium	Beckman Coulter	339247
Autoclave de laboratoire Vapormatic 770	Labotech	29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)	EuroClone	ECB 3000D
Minimum Essential Medium MEM	Euroclone	ECB2071L
MycoAlert Kit de détection de mycoplasmes	Lonza	LT07-318
PEG (solution de polyéthylène glicol)	Sigma-Aldrich (Merck)	P7181-5X5ML
Pénicilline-Streptomycine (solution 100x)	EuroClone	ECB3001D
Primo TC Dishes 100 mm	EuroClone	ET2100
Primo TC Dishes 35 mm	EuroClone	ET2035
Sodium Pyruvate 100 mM	EuroClone	ECM0542D
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ1000
Trypsine 2,5 % dans HBSS	EuroClone	ECB3051D
Uridine	Sigma-Aldrich (Merck)	U3003-5G

Références

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Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.

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Mots-clés

Mutation de l ADN mitochondrial phosphorylation oxidative complexes de la cha ne respiratoire g n ration de cybrides analyse de l h t roplasmie fusion de fibroblastes analyse des fragments de restriction myopathie mitochondriale

Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

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