Article de méthode

Une approche in vitro pour étudier le dysfonctionnement mitochondrial : un modèle cybride

DOI :

10.3791/63452

⸱

9 mars 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les cybrides transmissibles sont des cellules hybrides obtenues en fusionnant des cellules appauvries en ADN mitochondrial (ADNmt) (cellules rho0 ) avec des cytoplastes (cellules énucléées) dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux. Ils permettent de déterminer l’origine nucléaire ou mitochondriale de la maladie, d’évaluer l’activité biochimique et de confirmer le rôle pathogénétique des variantes liées à l’ADNmt.

Résumé

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La carence en complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale qui effectuent la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est le marqueur biochimique des troubles mitochondriaux humains. D’un point de vue génétique, l’OXPHOS représente un exemple unique car il résulte de la complémentarité de deux systèmes génétiques distincts : l’ADN nucléaire (ADNn) et l’ADN mitochondrial (ADNmt). Par conséquent, les défauts OXPHOS peuvent être dus à des mutations affectant les gènes codés nucléaires et mitochondriaux.

Les travaux révolutionnaires de King et Attardi, publiés en 1989, ont montré que les lignées cellulaires humaines appauvries en ADNmt (nommées rho0) pouvaient être repeuplées par des mitochondries exogènes pour obtenir les soi-disant « cybrides transmitochondrials ». Grâce à ces cybrides contenant des mitochondries dérivées de patients atteints de troubles mitochondriaux (MD) et des noyaux de cellules rho0 , il est possible de vérifier si un défaut est lié à l’ADNmt ou à l’ADNn. Ces cybrides sont également un outil puissant pour valider la pathogénicité d’une mutation et étudier son impact au niveau biochimique. Cet article présente un protocole détaillé décrivant la génération, la sélection et la caractérisation des cybrides.

Introduction

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Les troubles mitochondriaux (MD) sont un groupe de syndromes multisystémiques causés par une altération des fonctions mitochondriales due à des mutations de l’ADN nucléaire (ADNn) ou mitochondrial (ADNmt)1. Elles font partie des maladies métaboliques héréditaires les plus courantes, avec une prévalence de 1:5 000. Les maladies associées à l’ADNmt suivent les règles de la génétique mitochondriale : héritage maternel, hétéroplasmie et effet de seuil, et ségrégation mitotique2. L’ADNmt humain est un cercle d’ADN double brin de 16,6 kb, qui contient une courte région de contrôle avec des séquences nécessaires à la réplication et à la transcription, 13 gènes codant pour les protéines (toutes les sous-unités de la chaîne respiratoire), 22 ARNt et 2 gènes d’ARNr3.

Chez les individus en bonne santé, il existe un seul génotype d’ADNmt (homoplasmie), tandis que plus d’un génotype coexiste (hétéroplasmie) dans des conditions pathologiques. Les mutations hétéroplasmiques délétères doivent franchir un seuil critique pour perturber OXPHOS et provoquer des maladies pouvant affecter n’importe quel organe à tout âgede 4 ans. La double génétique d’OXPHOS dicte l’hérédité : autosomique récessive ou dominante et liée à l’X pour les mutations de l’ADNn, maternelle pour les mutations de l’ADNmt, plus des cas sporadiques à la fois pour l’ADNmt et l’ADNmt.

Au début de l’ère de la médecine mitochondriale, une expérience historique de King et Attardi5 a établi la base pour comprendre l’origine d’une mutation responsable d’un MD en créant des cellules hybrides contenant des noyaux de lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’ADNmt était entièrement épuisé (cellules rho0) et les mitochondries de patients atteints de DM. Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) n’étaient pas disponibles à cette époque, et il n’était pas facile de déterminer si une mutation était présente dans le génome nucléaire ou mitochondrial. La méthode, décrite en 1989, a ensuite été utilisée par plusieurs chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine mitochondriale 6,7,8,9; un protocole détaillé a été récemment publié10, mais aucune vidéo n’a encore été réalisée. Pourquoi un tel protocole devrait-il être pertinent de nos jours alors que NGS pourrait identifier précisément et rapidement où se trouve une mutation? La réponse est que la génération de cybrides est toujours le protocole de pointe pour comprendre le rôle pathogène de toute nouvelle mutation de l’ADNmt, corréler le pourcentage d’hétéroplasmie avec la gravité de la maladie et effectuer une investigation biochimique dans un système nucléaire homogène dans lequel la contribution du fond nucléaire autochtone du patient est absente11, 12,13.

Ce protocole décrit comment obtenir des cytoplastes à partir de fibroblastes confluents dérivés de patients cultivés dans des boîtes de Petri de 35 mm. La centrifugation des plats en présence de cytochalasine B permet l’isolement des cytoplastes énucléés, qui sont ensuite fusionnés avec des cellules rho0 en présence de polyéthylène glycol (PEG). Les cybrides résultantes sont ensuite cultivées en milieu sélectif jusqu’à l’apparition de clones. La section des résultats représentatifs montre un exemple de caractérisation moléculaire des cybrides résultantes pour prouver que l’ADNmt est identique à celui des fibroblastes des patients donneurs et que l’ADNn est identique à l’ADN nucléaire de la lignée cellulaire tumorale rho0 .

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Protocole

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REMARQUE: L’utilisation de fibroblastes humains peut nécessiter une approbation éthique. Les fibroblastes utilisés dans cette étude ont été dérivés de patients atteints de DM et stockés dans la biobanque institutionnelle conformément aux exigences éthiques. Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules. Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire sous une armoire à flux laminaire stérile à température ambiante (RT, 22-25 °C). Utilisez des solutions filtrées stériles adaptées à la culture cellulaire et aux équipements stériles. Cultiver toutes les lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Des tests de mycoplasmes doivent être effectués chaque semaine pour s’assurer que les cultures sont exemptes de mycoplasmes. Les cellules 143BTK- rho0 peuvent être générées comme décrit précédemment5.

1. Culture de cellules

  1. Avant de commencer toute procédure, vérifier la présence de la mutation dans les fibroblastes dérivés de patients MD et quantifier le pourcentage d’hétéroplasmie ou d’homoplasmie par polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) et / ou des analyses de séquençage d’ADNmt entier14.
  2. Ensemencez des fibroblastes dans quatre boîtes de Petri de 35 mm, contenant chacune 2 mL de milieu de culture complet (tableau 1). Laissez les cellules croître jusqu’à 80% de confluent (48 h).
  3. Cultiver 143BTK- rho0 cellules dans 8 mL de milieu de culture supplémenté (tableau 1) dans une boîte de Petri de 100 mm.
  4. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  5. Vérifier l’absence d’ADNmt dans les cellules rho0 par des techniques de séquençage14.

2. Énucléation des fibroblastes

  1. Stériliser quatre bouteilles de 250 mL adaptées à la centrifugeuse par stérilisation autoclave à 121 °C pendant un cycle de 20 minutes. Séchez-les dans un four de laboratoire ou à RT.
  2. Préchauffer la centrifugeuse à 37 °C.
  3. Lavez deux fois les plats de 35 mm contenant les fibroblastes, en utilisant 2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans (sans) calcium ni magnésium.
  4. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle avec 70% d’éthanol et attendez que l’alcool s’évapore.
  5. Retirez les couvercles de la vaisselle et les bouchons à vis des bouteilles. Placez chaque plat, sans le couvercle, à l’envers au fond de chaque bouteille de centrifugeuse de 250 ml.
  6. Ajouter lentement 32 mL de milieu d’énucléation à chaque bouteille (tableau 1), ce qui permet au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules. Retirez toutes les bulles de la vaisselle à l’aide d’une longue pipette Pasteur en verre, en recourbant la pointe dans une flamme Bunsen.
    REMARQUE: Il est important d’enlever les bulles pour permettre au milieu d’entrer dans le plat et d’entrer en contact avec les cellules.
  7. Fermez chaque bouteille avec le bouchon à vis et transférez-les à la centrifugeuse.
  8. Centrifugeuse pendant 20 min à 37 °C et 8 000 × g, accélération max, décélération lente. Faites attention à équilibrer la centrifugeuse : contrebalancez chaque bouteille. Si nécessaire, ajustez le poids en ajoutant un volume approprié de milieu d’énucléation.
  9. Pendant la centrifugation, utilisez le vide ou une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer et jeter le milieu des plaques de culture 143BTK-rho 0 et les laver deux fois en utilisant 4 mL de 1x PBS sans calcium et magnésium.
  10. Ajouter 2 mL de trypsine pour recouvrir complètement la monocouche cellulaire.
  11. Placez les plats dans un incubateur à 37 °C pendant environ 2 min.
  12. Retirez les plats de l’incubateur, observez le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectifs 4x ou 10x) et inhibez l’activité enzymatique en ajoutant 2 mL de milieu de culture supplémenté.
  13. Aspirer les 4 mL de la suspension cellulaire dans le plat avec une pipette de 10 mL et la transférer dans un tube conique de 15 mL.
  14. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre hémocytométrique Burker ou d’un compteur automatisé.
  15. À la fin de la centrifugation (étape 2.8), aspirez le fluide des bouteilles et jetez-le.
  16. Retirez la vaisselle en inversant les bouteilles sur une gaze stérile préalablement pulvérisée avec 70% d’éthanol. Nettoyez la surface extérieure de la vaisselle et de leurs couvercles avec 70% d’éthanol. Attendez que l’alcool s’évapore, puis fermez la vaisselle.
  17. Avant de continuer, vérifiez la formation de cytoplastes (fantômes) à l’aide d’un microscope inversé pour les cellules vivantes (objectif 4x ou 10x). Recherchez des fibroblastes extrêmement allongés en raison de l’extrusion de leurs noyaux induite par la cytochalasine B.
  18. À chaque plat de 35 mm, ajouter 1 × 106 de 143BTK- rho0 cellules remises en suspension dans 2 mL de milieu de culture 143BTK- rho0 complété par 5% de sérum fœtal bovin (FBS).
  19. Laissez la vaisselle pendant 3 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 et laissez les cellules 143BTK-rho0 se déposer sur les fantômes. Ne pas déranger la vaisselle.

3. Fusion des fibroblastes énucléés avec des cellules rho 0

  1. Après 3 h d’incubation, aspirer et jeter le milieu des plats.
  2. Lavez les cellules adhérentes deux fois avec 2 mL de glucose élevé DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco sans sérum ou avec un milieu essentiel minimum (MEM).
  3. Aspirer et jeter le milieu.
  4. Ajouter 500 μL de solution de PEG (voir le tableau des matériaux) aux cellules et incuber pendant exactement 1 min.
  5. Aspirer et jeter la solution peg.
  6. Lavez les cellules trois fois en utilisant 2 mL de DMEM à glucose élevé sans sérum ou avec MEM.
  7. Ajouter 2 mL de milieu de fusion (tableau 1) et incuber toute la nuit dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.

4. Sélection et expansion de Cybride

  1. Après une incubation d’une nuit, retirez les plaques de l’incubateur, trypsinisez les cellules comme décrit ci-dessus (étapes 2.9-2.13) et transférez le contenu de chaque plat de 35 mm dans un plat de 100 mm.
  2. Ajouter 8 mL de milieu de sélection (tableau 1) et placer les plaques dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Changez le milieu tous les 2-3 jours.
  4. Attendez environ 10 à 15 jours de sélection jusqu’à ce que des colonies de cellules apparaissent.
  5. Congelez l’une des quatre boîtes de Pétri en collectant tous les clones et en générant une culture « massive » comme sauvegarde des cybrides, qui peut éventuellement être reclonée et utilisée pour des recherches plus approfondies.
  6. Trypsiniser les cellules dans les boîtes de culture restantes, compter et ensemencer dans une ou plusieurs boîtes de Petri à 50-100 cellules / boîte dans le milieu de culture supplémenté (tableau 1) jusqu’à ce que des clones apparaissent. Laissez-les grandir pendant quelques jours.
  7. Abattez les cellules restantes par centrifugation à 1 200 × g pendant 3 min à TA et jetez le surnageant.
  8. Extraire l’ADN de la pastille (voir la Table des matériaux).
  9. Effectuer le génotypage par nombre variable d’analyses répétées en tandem (VNTR), comme indiqué précédemment15.
  10. Ramassez les clones de la boîte de Pétri avec des cylindres de clonage ou une pointe de pipette, à l’aide d’un stéréomicroscope pour éviter la mise en commun de différents clones, et transférez-les dans une plaque de 96 puits, chaque puits contenant 200 μL de milieu de culture supplémenté (tableau 1).
  11. Développez chaque clone jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de cellules pour congeler et extraire l’ADN.
  12. Vérifiez le pourcentage de mutation de chaque clone par RFLP ou d’autres méthodes de séquençage. Idéalement, essayez d’obtenir à la fois des clones avec de l’ADNmt de type sauvage (mutation à 0%) et des clones avec des pourcentages de mutation différents, les deux s’ajoutant à l’ADNmt mutant homoplasmique (mutation à 100%). Voir la Figure 1 pour un diagramme schématique du protocole de génération cybride.

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Résultats

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La génération de cybrides nécessite 3 jours de travail en laboratoire plus une période de sélection (~ 2 semaines) et 1-2 semaines supplémentaires pour la croissance des clones. Les étapes critiques sont la qualité des cytoplastes et la période de sélection. La morphologie des cybrides ressemble à celle des cellules donneuses rho0. L’attribution de l’ADNmt et de l’ADNn corrects dans les cybrides est obligatoire pour confirmer l’identité des cellules. Un exemple est donné à la figure 2

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Discussion

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L’ADNmt a un taux de mutation très élevé par rapport à l’ADNn en raison de l’absence d’histones protectrices et de son emplacement à proximité de la chaîne respiratoire, ce qui expose la molécule à des effets oxydatifs dommageables qui ne sont pas efficacement contrecarrés par les systèmes de réparation16. Les premières mutations pathogènes de l’ADNmt ont été identifiées en 198817,18, et depuis lors, un grand nombre de mutations ont été dé...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été réalisée au Centre d’étude des maladies pédiatriques mitochondriales (http://www.mitopedia.org), financé par la Fondation Mariani. VT est membre du Réseau européen de référence pour les maladies neuromusculaires rares (ERN EURO-NMD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 puits PlaquesCorning3516
96 puits PlaquesCorning3596
Kit d’extraction d’ADN de culture de sang et de cellulesQIAGEN13323
CentrifugeuseBeckman CoulterAvanti J-257 200 rcf, 37 ° ; C
Flacons de centrifugeuse, 250 mLBeckman Coulter356011
Cytochalasine B de Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Dialysé FBSGibco26400-036 100mL
DMEM High Glucose (sans L-Glutamine W/Pyruvate de Sodium)EuroCloneECB7501L
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline - PBS (w/ o Calcium sans magnésium)EuroCloneECB4004L
Ethanol Absolu AnhydreCarlo Erba414601
FetalClone III (Produit de sérum bovin)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Pipettes pasteur en verreVWRM4150NO250SP4
Microscope de recherche inversé pour la microscopie à cellules vivantesNikonECLIPSE TE200
JA-14 Rotor à angle fixe en aluminiumBeckman Coulter339247
Autoclave de laboratoire Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Essential Medium MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Kit de détection de mycoplasmesLonzaLT07-318
PEG (solution de polyéthylène glicol)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Pénicilline-Streptomycine (solution 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Dishes 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Dishes 35 mmEuroCloneET2035
Sodium Pyruvate 100 mMEuroCloneECM0542D
StéréomicroscopeNikonSMZ1000
Trypsine 2,5 % dans HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Références

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Mots-clés

Mutation de l ADN mitochondrialphosphorylation oxidativecomplexes de la cha ne respiratoireg n ration de cybridesanalyse de l h t roplasmiefusion de fibroblastesanalyse des fragments de restrictionmyopathie mitochondriale

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