Isolement de microvésicules spléniques dans un modèle murin d’infection bactérienne intrapéritonéale

Summary

Les microvésicules excrétées par la membrane plasmique agissent comme des effecteurs cellulaires. Les microvésicules de la rate (SMV) sont des marqueurs de substitution des conditions physiopathologiques. Chez les rats et les souris, le contenu et les propriétés du SMV caractérisent le vieillissement ou l’inflammation et sont modifiés par les traitements cytoprotecteurs, ce qui en fait un outil de surveillance précieux mais abondant pour la recherche préclinique.

Abstract

Les microvésicules (MV) sont des fragments submicroniques libérés par la membrane plasmique des cellules activées qui agissent comme des effecteurs cellulaires pro-inflammatoires et procoagulants. Chez le rat, les MV de la rate (SMV) sont des marqueurs de substitution des conditions physiopathologiques. Des études in vitro antérieures ont démontré que Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), un pathogène parodontal majeur, permet l’excrétion endothéliale et l’apoptose, tandis que le lipopolysaccharide (LPS) favorise l’excrétion des microvésicules dérivées des splénocytes (SMV). Des études in vivo ont montré la faisabilité d’un contrôle pharmacologique de l’excrétion du SMV. Le présent protocole établit une procédure normalisée pour isoler les SMV spléniques à partir du modèle d’infection aiguë murine à P. gingivalis . L’infection à P. gingivalis a été induite chez de jeunes souris C57BL/6 par injection intrapéritonéale (trois injections de 5 x 10⁷ bactéries/semaine). Après deux semaines, les rates ont été recueillies, pesées et les splénocytes ont été comptés. Les SMV ont été isolés et quantifiés par des tests de protéines, d’ARN et de prothrombinase. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide de colorants d’exclusion à l’iodure de propidium ou au bleu de trypan. Après l’extraction des splénocytes, le nombre de neutrophiles a été obtenu par cytométrie en flux après 24 h de culture de splénocytes. Chez les souris injectées de P. gingivalis, une augmentation de 2,5 fois du poids de la rate et une augmentation de 2,3 fois du nombre de splénocytes ont été observées, tandis que le nombre de neutrophiles a été multiplié par 40. La viabilité cellulaire des splénocytes de souris injectées de P. gingivalis variait de 75 % à 96 % et diminuait de 50 % après 24 h de culture, sans aucune différence significative par rapport aux témoins non exposés. Cependant, les splénocytes de souris injectées libèrent des quantités plus élevées de MV par dosage de la prothrombinase ou par mesure des protéines. Les données démontrent que les SMV procoagulants sont des outils fiables pour évaluer une réponse précoce de la rate à l’infection intrapéritonéale à P. gingivalis .

Introduction

Les microvésicules (MV), également appelées microparticules ou ectosomes, sont des fragments de membrane plasmique d’un diamètre de 0,1 à 1,0 μm libérés dans les fluides corporels et l’espace extracellulaire en réponse à divers stimuli cellulaires. D’abord identifiés comme des poussières plaquettaires exposant des phospholipides procoagulants, principalement de la phosphatidylsérine (PSer), les MV constituent une surface supplémentaire pour l’assemblage des complexes de coagulation sanguine ^1,2. Le rôle clé des MV circulants en tant qu’effecteurs procoagulants a été démontré chez des patients atteints du syndrome^{de Scott 2}, une maladie génétique rare qui entraîne une exposition dysfonctionnelle au PSer et des saignements (Figure supplémentaire 1). Les MV ont été largement étudiés en tant que biomarqueurs circulants du risque thrombotique dans les maladies chroniques associées à des troubles cardiovasculaires tels que le diabète, les maladies rénales chroniques, la prééclampsie et l’hypertension ^3,4. Ils sont actuellement reconnus comme de véritables effecteurs cellulaires dans les fluides ou les tissus d’organes comme le myocarde¹. Parce qu’ils transportent des protéines actives, des lipides et des miARN, ils modulent à distance les réponses vasculaires telles que l’hémostase, l’inflammation, l’angiogenèse vasculaire et la croissance vasculaire ou le remodelage tissulaire⁵.

Alors que les études cliniques examinent la valeur pronostique des MV concernant les facteurs de risque, les MV isolés dans les fluides ou les tissus du patient permettent d’évaluer ex vivo leurs propriétés effectrices⁶. Le déchiffrage des mécanismes régissant la biogenèse des MV et les capacités de diaphonie est généralement réalisé dans des modèles de culture cellulaire pour identifier les molécules actives exposées ou encapsulées dans les MV et leur signalisation en aval. Les interactions MV avec les cellules cibles dépendront de la liaison protéine/protéine membranaire, lorsque des contre-ligands appropriés sont disponibles et/ou de la fusion lipidique⁷.

Dans des conditions physiologiques, les MV circulant dans le plasma proviennent principalement des cellules vasculaires, comme l’identifient les marqueurs de différenciation des clusters de lignées (CD)^8,9. Cependant, en pathologie, notamment dans le cancer¹⁰ et le rejet de greffe^11,12, les MV sont éliminés des tissus endommagés et présentent des caractéristiques procoagulantes et pro-inflammatoires nocives. Ceux-ci sont détectés dans la circulation systémique, ce qui en fait des sondes utiles pour surveiller les thérapies de protection ou de rajeunissement, et les cibles pharmacologiques possibles¹³. Étant donné que les MV circulent comme un pool de stockage dynamique reflétant l’homéostasie des cellules vasculaires et tissulaires dans la santé et la maladie, une meilleure compréhension de leur action à distance doit également être étudiée in vivo, après une injection IV ou une instillation nasale chez de petits animaux^14,15. En effet, les MV ont été considérés comme des contributeurs majeurs aux voies complexes couplant l’inflammation exagérée et la thrombose¹⁶.

La parodontite est une maladie inflammatoire d’origine infectieuse affectant les tissus de soutien des dents^17,18 et est associée à un risque thrombotique. Elle se caractérise par des saignements gingivaux, une destruction de l’os alvéolaire, une mobilité dentaire et peut finalement entraîner la perte de dents. La parodontite est très répandue dans le monde entier et touche plus de 50 % de la population, dont 11 % présentent une forme sévère¹⁹. La parodontite est induite par une dysbiose bactérienne des biofilms sous-gingivaux, qui soutiennent une réponse inflammatoire exacerbée qui déclenche la destruction des tissus²⁰. Au cours de la dernière décennie, la parodontite a été liée à des maladies systémiques telles que les troubles cardiovasculaires, le diabète et la polyarthrite rhumatoïde. Les explications possibles sont l’action des agents pathogènes parodontaux à distance et/ou l’augmentation de l’inflammation systémique médiée par les cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine (IL-1, IL-6) et le TNF-α^21,22.

Parmi les agents pathogènes associés à l’apparition et au développement de la parodontite, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ est présent dans la plupart des lésions graves qui récoltent plusieurs facteurs de virulence, y compris les lipopolysaccharides (LPS)²⁴ induisant des réponses inflammatoires médiées par les récepteurs de type Toll (TLR)²⁵ et le recrutement de neutrophiles et de leucocytes polymorphonucléaires (PMN) sur le site de l’infection initiale²⁶. Le LPS de P. gingivalis active TLR-4 ou TLR-2, facilitant la détection immunitaire et l’évasion de la survie bactérienne²⁷. Au niveau vasculaire, l’activation de TLR2 par le LPS est associée à l’immunothrombose. La capacité unique de P. gingivalis à déclencher la signalisation TLR-2 tandis que la reconnaissance dépendante de TLR-4 est significativement altérée favorise une infection persistante de bas grade^28,29.

Les procédures in vivo pour étudier les réponses MV à l’infection chronique et durable d’un agent pathogène de bas grade sont rares. Les approches méthodologiques pour l’extraction des MVs tissulaires sont peu décrites dans la littérature et concernent généralement la récolte de MVs à partir de tissus pathologiques comme les tumeurs solides, la stéatose hépatique, les plaques d’athérothrombotique, ou les greffes 11,29,30, tandis que la rate détecte les bactéries et les virus dans la circulation sanguine. Il stocke également les érythrocytes, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes, les basophiles et les éosinophiles impliqués dans la réponse immunitaire. Les granulocytes comme les neutrophiles de la pulpe rouge génèrent également des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des protéases qui détruisent les agents pathogènes et empêchent l’infection de se propager^31,32. Étonnamment, et au meilleur de notre connaissance, les MV de la rate ne sont pas étudiées dans le contexte des agressions tissulaires induites par des agents pathogènes. Il existe un besoin mondial non satisfait d’étudier les variations des MV tissulaires en physiopathologie.

Les données in vitro de notre laboratoire ont montré que le LPS induit l’excrétion de MV procoagulants à partir des splénocytes de rat, ce qui provoque à son tour la sénescence de cellules endothéliales coronaires en culture et un phénotype endothélial procoagulant pro-inflammatoire et pro-inflammatoire consécutif¹¹. La faisabilité du contrôle pharmacologique des MV de la rate a été démontrée après le traitement de l’animal avec une formule optimisée d’oméga-3. Le gavage oral de rats d’âge moyen et âgés s’est avéré protecteur à la fois contre l’excrétion de MV procoagulants par les splénocytes et contre leurs propriétés nocives prosénescentes envers l’endothélium^{coronaire 33}.

Par rapport au sang, la rate offre l’avantage d’être une source importante de leucocytes chez un individu. De plus, un axe splénique-cardiaque a récemment été proposé ^3,34, faisant de la rate un contributeur possible au risque cardiovasculaire lié à l’infection d’intérêt bénéfique pour le contrôle pharmacologique. L’évaluation des propriétés ou de la libération des SMV est essentielle pour comprendre les réponses induites par les agents pathogènes ou inflammatoires. Il est intéressant de noter qu’elle peut être réalisée chez les animaux traités et dans différents modèles physiopathologiques (âge, hypertension, diabète). En effet, en comparant des rats d’âge moyen et des rats^{âgés 33}, les différences dans les propriétés et la libération des MV de la rate peuvent être mises en évidence après une simple culture de splénocytes de 24 heures.

Compte tenu des preuves ci-dessus de l’altération des propriétés effectrices des MV de la rate avec l’état physiopathologique et de la faisabilité de leur contrôle pharmacologique chez le rat, un protocole normalisé est décrit ici pour l’isolement des MV de la rate murine. La procédure s’adapterait mieux aux études approfondies des mécanismes in vivo soutenant les effets médiés par les SMV, éventuellement chez les souris modifiées. La procédure a été établie chez des souris C57BL/6 à l’aide d’une infection intrapéritonéale locale par P. gingivalis, afin d’établir la preuve d’une action à distance de l’agent pathogène sur les propriétés effectrices du MV de la rate (SMV).

Protocol

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés et ont suivi les directives pertinentes du Comité d’éthique local (APAFIS#28745-2020121815051557) et des soins aux animaux de l’Université d’origine et de l’INSERM. De jeunes souris mâles C57BL/6, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour les expériences. Les souris ont été régulièrement examinées pour évaluer la douleur et le stress, et leur poids a été surveillé quotidiennement. Sauf indication contraire, tous les tampons et solutions d’extraction doivent être stériles et à température ambiante.

1. Préparation des animaux

1. Administrer aux souris six injections intrapéritonéales de P. gingivalis (PG) tous les 2 jours pendant 2 semaines (trois injections de 5 x 10⁷ bactéries/semaine, Dossier supplémentaire 1).
2. Anesthésiez les souris à l’aide d’une combinaison de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine.
3. Sacrifiez les souris anesthésiées et récoltez la rate après laparotomie.
   REMARQUE : Les conditions spécifiques à l’infection à P. gingivalis et au sacrifice des animaux pour le prélèvement de la rate sont détaillées dans la section « expérimentation animale » du Dossier supplémentaire 1. La représentation schématique des étapes du protocole est illustrée à la figure 1.

2. Extraction des splénocytes

1. À l’aide d’un scalpel, hachez le tissu de la rate en tranches de ~1 mm dans une boîte de Pétri déjà remplie de 3 mL de RPMI contenant des antibiotiques (streptomycine (100 U/mL)/pénicilline (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamine (2 mM)), et complétée par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) (voir le tableau des matières).
2. Transférez les tranches dans un tamis (voir tableau des matériaux), qui est préalablement fixé à un tube de polystyrène de 50 ml.
3. Utilisez le piston d’une seringue comme pilon pour écraser les tissus sur le tamis.
4. Rincer le tamis avec le milieu RPMI (3 ml).
5. Centrifuger l’éluat en suspension cellulaire à 450 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant avec prudence par refoulement.

3. Élimination des érythrocytes par choc osmotique

1. Ajouter 1 mL de tampon ACK (voir le tableau des matériaux), bien mélanger, incuber pendant 3 min à température ambiante et agiter doucement par rotation de la main.
2. Diluer en ajoutant 9 mL de RPMI et bien mélanger en utilisant l’aspiration et le reflux.
3. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à température ambiante.
4. Jeter le surnageant par aspiration et refoulement, et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu RPMI.
5. Mélanger délicatement (aspiration/reflux) et éventuellement éliminer les éventuels débris lipidiques par pipetage ou à l’aide d’un tamis.

4. Ajustement de la concentration en splénocytes isolés

1. Remplissez un microtube de 1,5 mL contenant 900 μL de RPMI.
2. À l’aide d’une micropipette, prélever 100 μL de suspension cellulaire, l’ajouter au microtube de 1,5 ml contenant 900 μL de milieu RPMI et bien mélanger.
3. Transférez 10 μL des cellules diluées dans un microtube, ajoutez 10 μL de colorant d’exclusion au bleu de trypan et mélangez bien.
4. Placez 10 μL de la solution (étape 3.3) dans la lame de comptage du compteur automatique de cellules (voir le tableau des matériaux) et déterminez le nombre de cellules.
   REMARQUE : Le logiciel de l’appareil donne deux valeurs : le nombre total de cellules et le nombre et le pourcentage de cellules vivantes.
5. Ajustez la concentration des cellules vivantes à 3 ou 5 x 10⁶ cellules/mL (V_max = 20 mL ; la capacité totale maximale est de 100 x 10⁶ cellules/mL).
6. Ensemencer les cellules dans une fiole de 75 mL contenant du RPMI.
7. Incuber le ballon à la verticale dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant 24 h.
   ATTENTION : Le bleu de trypan est un agent mutagène et cancérigène ^35,36. Assurez-vous de porter des gants pendant le comptage, même à l’extérieur de la cagoule. Jetez immédiatement les pointes et les liquides dans des récipients et lavez la surface de la paillasse.
   REMARQUE : Si les cellules prélevées mesurent moins de 50 x 10⁶, utilisez une fiole de culture de 25 ml. Le numéro de portable ne doit pas beaucoup varier d’un individu à l’autre. Le pourcentage de cellules vivantes est généralement supérieur à 80 % à cette étape.

5. Isolement des microvésicules splénocytaires

1. Après 24 h, verser le contenu de la fiole dans un tube de 50 mL en polypropylène ou en polystyrène.
2. Centrifuger à 450 x g pendant 15 min à température ambiante pour éliminer les cellules et les débris.
3. Après la centrifugation, conserver 100 μL du 1er surnageant (SN1) pour une éventuelle mesure de la concentration initiale en MV afin de calculer le rendement d’isolement. Notez le volume SN1.
4. Centrifugez le SN1 à 450 x g pendant 15 min à température ambiante.
5. Jeter la pastille et centrifuger à nouveau à 450 x g pendant 15 min à température ambiante. Retirez et collectez rapidement SN2 (notez le volume).
6. Transférer SN2 dans des microtubes de 1,8 mL à fond conique. Conservez 100 μL de SN2 pour une mesure éventuelle de la concentration MT initiale afin de calculer le rendement d’isolement au cas où trop de débris finirait par altérer la mesure MT dans SN1.
7. Ajouter 5 mL de milieu RPMI à la pastille (cellules) et compter les splénocytes.
   REMARQUE : La suspension cellulaire peut également être fixée pour la caractérisation par cytométrie en flux dans du paraformaldéhyde à 0,1 % (concentration finale⁾³⁷.
8. Centrifugez SN2 à 14 000 x g pendant 1 h à 4 °C et réfrigérez éventuellement le rotor à l’avance en faisant fonctionner le rotor vide à 4 °C. Cette étape génère SN3.
9. Retirer immédiatement le SN3 de chaque microtube en le retournant sur un seul tube stérile de 50 mL (sous le capot). Notez le volume SN3.
10. Mélangez délicatement SN3 à l’aide d’une pipette sous le capot. Conservez des aliquotes pour les mesures éventuelles dans la suspension.
    REMARQUE : La solution est maintenant appauvrie en MV mais contient les médiateurs solubles et les exosomes.
11. Racler chaque microtube (fermé) sur une grille à pointes pour favoriser mécaniquement la remise en suspension des MVs dans le granulé.
12. Ajouter 200 μL de solution saline équilibrée de Hank sans Ca²⁺ et Mg²⁺ (HBSS) dans le premier microtube (voir tableau des matériaux).
13. Remettre en suspension la pastille MV du premier tube par des cycles doux d’aspiration/refoulement (~10 fois) à l’aide d’une micropipette de 1 mL. Prenez grand soin d’éviter la formation de mousse car cela favorisera l’oxydation des vésicules et autres fractions de la suspension.
14. Récoltez les premiers 200 μL de MV remis en suspension et versez-les dans le deuxième tube sur le granulé. Mélangez doucement comme ci-dessus, puis versez à nouveau dans le troisième tube et mélangez doucement. La suspension devient de plus en plus trouble d’un tube à l’autre. Fermez le troisième tube.
15. Amorcez la collecte des trois microtubes suivants comme ci-dessus (étape 4.14).
16. Rassemblez tous les MV remis en suspension dans un seul (ou deux) microtube collecteur (2 mL avec fond de forme conique). Conservez 50 μL pour le calcul éventuel du rendement de cette étape. Notez le volume de suspension.
17. Centrifuger le tube collecteur à 14 000 x g pendant 1 h à 4 °C. Cette étape génère SN4.
18. Jetez immédiatement le SN4 (versez sur un tube collecteur de surnageant). Conservez une aliquote de SN4 pour calculer le rendement de l’étape de purification et remettez doucement en suspension la pastille dans 500 μL de HBBS (sans Ca²⁺ et Mg²⁺). Conservez une aliquote de 50 μL de la pastille remise en suspension pour calculer le rendement de purification et noter son volume.
19. Conserver la pastille remise en suspension à 4 °C pendant un mois maximum pour les tests fonctionnels dans des conditions stériles ou à -20 °C pour les tests structurels.
20. Calculez le rendement de purification (voir NOTE ci-dessous) de chaque étape ou de l’ensemble de la procédure en mesurant la concentration des MV dans les surnageants et/ou les suspensions de granulés.
    REMARQUE : Rendement de purification ( %) : ([MV1] x volume SN1) / ([MV4] x volume de suspension final) x 100.
    Ce rendement doit être rationalisé en fonction du nombre de splénocytes isolés du ballon de culture et comptés à l’étape 4.4. Le rendement de purification de la présente expérience est de ~70 % à partir de 111 x 10⁶ cellules et 60 mL de surnageant.
    1. Évaluer la perte de SMV causée par la procédure en mesurant les SMV restants dans les surnageants appauvris en SMV et contenant principalement des exosomes (SN2 et SN4).
    2. Mesurer la concentration de MV à l’aide du TRPS ou de l’essai de prothrombinase³⁸ pour une sensibilité et une spécificité élevées.
       ATTENTION : Récoltez les MV après centrifugation par le versement rapide du surnageant à l’envers. L’attente ou l’utilisation de microtubes en forme de U entraînera une perte de MV sur la paroi du microtube. N’utilisez jamais de micropipette pour jeter le surnageant ; Le granulé peut être aspiré à la place. Ne retardez jamais le processus après l’arrêt de la centrifugeuse. La centrifugation à vitesse excessive entraînera la contamination de la pastille MV par des exosomes.
       REMARQUE : Les vitesses et la durée de centrifugation sont optimisées pour un enrichissement MT avec une contamination minimale par les exosomes. Ce protocole n’est pas fiable pour étudier les MV des monocytes/macrophages de la rate, car ces cellules peuvent phagocyter et recapturer rapidement leurs propres MV³⁹. Le protocole ne peut pas être interrompu et redémarré plus tard en raison de la perte de cellules due à la viabilité cellulaire.

Results

Les données fournies donnent une représentation complète de l’ensemble de la procédure, en utilisant deux conditions animales principales : contrôler les jeunes souris C57BL/6 non traitées et leurs compagnons de portée soumis à six injections intrapéritonéales (IP) de PG tous les 2 jours, pendant 2 semaines. Ils montrent également l’action à distance d’une injection intrapéritonéale de PG sur la réponse de la rate après 2 semaines. Les microvésicules splénocytaires ont été quantifiées soit par dosage enzymatique de la pr...

Discussion

La présente étude confirme que la rate est une source majeure et fiable de MV ayant une pertinence physiopathologique par rapport à d’autres sources comme le sang, de volume limité chez la souris. À condition que des précautions soient prises, la méthode est facile à mettre en place et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Étant donné qu’il n’existe pas d’autre méthode que l’évaluation in vivo , le modèle actuel semble être une méthode précieuse pour étudier l’impact des pro-mé...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes de 2 mL type Eppendorf	Dutscher	54816	Fond conique sté ; riel microtubes
Allegra 64 R Centrifugeuse	Beckman Coulter
Compteur automatique de cellules	Biorad
Albumine sérique bovine	Euromedex	04-100-812-E	Préparé, filtré avec 0.22 µ ; m tamisé et stocké à 4 ° ; C dans des conditions stériles en utilisant les formules suivantes : EDTA 2 mM, BSA 0,5 % et PBS
CD11 stérile (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	conjugué à eFluor 450 ; &lambda ; < excitation sub>max 405 nm & lambda ; Émission max 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	EDTA non conjugué
	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Tube Falcon	Étoile	cellulaire 227261	50 mL
Sérum fœtal bovin	Dutscher	S1810-500	Numéro de lot = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		pour tri cellulaire
Cytomètre en flux Fortessa	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Sans rouge de phénol, sans Ca+2 et Mg+2
ICAM-1	abcam	AB171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugué à BUV395 ; &lambda ; max excitation 348 nm, &lambda ; Émission max 395 nm
Érythrocytes tampons de lyse (ACK)	Sigma		Préparé, filtré avec 0,22 & micro ; m tamisé et stocké à 4° ; C dans des conditions stériles à l’aide des formules suivantes : NH4Cl, 0,15 M (molarité), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molarité) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  ; 0,1 mM (molarité), 292,24 (mw), 14,6 g pH : 7,2&ndash ; 7.4
Spectrophotomètre NanoDrop 1000	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Sans Ca+2  ; et Mg+2
Boîte de Pétri			en plastique 100 mm
Tube en polystyrène	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Milieu de culture RPMI 1640 : 2 g/L de glucose	PAN biotech	p04-18047	Supplémenté en streptomycine (100 U/mL) /pénicilline (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamine (2 mM) et FBS 10 %.
Scalpels
Tamis Nylon Falcon	USA	352360	100 µ ; m
Streptomycine/Pénicilline	PAN biotech	P06-07100
Seringue			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380