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Article de méthode

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

3.8K vues

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DOI :

10.3791/63483

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23 juin 2022

 ,  ,  , 
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Résumé

Ce protocole montre comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser ces cellules dans le but d’étudier la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dans le modèle hSOD1G93A du rat. Tout d’abord, le protocole montre comment isoler et cultiver les astrocytes et les microglies à partir de cortex postnatal de rat, puis comment caractériser et tester la pureté de ces cultures par immunocytochimie en utilisant le marqueur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) des astrocytes et le marqueur microglial de la molécule ionisée liant le calcium 1 (Iba1). Dans l’étape suivante, des méthodes sont décrites pour la charge de colorant (Fluo 4-AM sensible au calcium) des cellules en culture et les enregistrements des changements Ca2+ dans des expériences d’imagerie vidéo sur des cellules vivantes.

Les exemples d’enregistrements vidéo sont les suivants: (1) cas d’imagerie Ca2+ d’astrocytes en culture exposés de manière aiguë à l’immunoglobuline G (IgG) isolée chez des patients atteints de SLA, montrant une réponse caractéristique et spécifique par rapport à la réponse à l’ATP démontrée dans la même expérience. Les exemples montrent également une augmentation transitoire plus prononcée de la concentration intracellulaire de calcium évoquée par les IgG de la SLA dans les astrocyteshSOD1 G93A par rapport aux témoins non transgéniques; (2) imagerie Ca 2+ d’astrocytes en culture lors d’un épuisement des réserves de calcium par la thapsigargine (Thg), un inhibiteur non compétitif de l’ATPase du réticulum endoplasmiqueCa2+, suivie d’une entrée de calcium opérée en magasin provoquée par l’ajout de calcium dans la solution d’enregistrement, qui démontre la différence entre le fonctionnement du magasin Ca2+ dans hSOD1G93A et dans les astrocytes non transgéniques; (3) L’imagerie Ca 2+ de la microglie en culture montrant principalement un manque de réponse aux IgG SLA, tandis que l’application d’ATP a provoqué un changement Ca2+. Cet article met également l’accent sur les mises en garde et les mises en garde possibles concernant la densité cellulaire critique et la pureté des cultures, le choix de la concentration correcte du colorant Ca2+ et les techniques de chargement du colorant.

Introduction

Les techniques de culture cellulaire ont donné lieu à de nombreux progrès dans divers domaines de la neurophysiologie cellulaire dans la santé et la maladie. En particulier, les cultures de cellules primaires, fraîchement isolées du tissu neuronal d’un animal de laboratoire, permettent à l’expérimentateur d’étudier de près le comportement de diverses cellules dans différents milieux biochimiques et configurations physiologiques. L’utilisation de différents indicateurs physiologiques fluorescents tels que les colorants sensibles au Ca2+ en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse permet de mieux comprendre les processus biophysiques et biochimiques cellulaires en temps réel.

La SLA est une maladie neurodégénérative dévastatrice qui affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs1. La maladie présente une pathogenèse complexe de type familial mais surtout de forme sporadique (90% des cas)2. Il est bien connu que les mécanismes autonomes non cellulaires contribuent à la physiopathologie de la SLA, principalement en raison du rôle essentiel des cellules gliales3. La SLA est également bien caractérisée comme une maladie neuroinflammatoire avec implication de facteurs humoraux et cellulaires de l’inflammation.

L’immunoglobuline G est largement utilisée comme marqueur moléculaire de la SLA et d’autres maladies neurodégénératives. L’étude du taux sérique de ce marqueur peut indiquer la présence et le stade de la neuroinflammation dans la maladie 4,5,6, tandis que sa présence dans le liquide céphalorachidien peut indiquer une brèche de la barrière hémato-encéphalique7. Les IgG ont également été identifiées comme des dépôts dans les motoneurones de la moelle épinière de patients atteints de SLA7. Néanmoins, cette approche a montré quelques incohérences dans la corrélation du taux d’IgG avec le stade et les caractéristiques de la maladie6.

Les IgG isolées à partir des sérums de patients atteints de SLA (IgG SLA) peuvent induire une réponse calcique dans les astrocytesnaïfs 8 et la libération de glutamate dans les neurones, ce qui indique un effet excitotoxique - une caractéristique de la pathologie de la SLA9. Cependant, des études sur le modèle de rat hSOD1G93A ALS (contenant plusieurs copies de la mutation humaine SOD110) ont montré un certain nombre de marqueurs du stress oxydatif dans les cellules neurogliales en culture11, les tissus 12,13,14 ou les animaux vivants 13. Il est à noter que les astrocytes cultivés à partir du modèle de rat SLA étaient plus sujets au stress oxydatif induit par le peroxyde que les astroglies de compagnons de portée non transgéniques11.

Les cellules microgliales en culture sont affectées par les IgG de la SLA d’une manière moins apparente. À savoir, une lignée cellulaire microgliale BV-2 a montré une augmentation du signal provenant de marqueurs fluorescents du stress oxydatif en réponse à l’application de seulement 4/11 échantillons de patients atteints d’IgG SLA15. Il est bien connu que la microglie participe à de nombreuses pathologies neuroinflammatoires, ajoutant au stress oxydatif et à la phase de progression tardive dans le mécanisme autonome non cellulaire de la SLA16,17. Néanmoins, les données avec les IgG de la SLA ont indiqué que ces cellules peuvent ne pas être aussi réactives que les astrocytes à ces facteurs humoraux de l’inflammation de la SLA. Plusieurs études ont été menées avec des astrocytes primaires à partir de modèles murins de SLA, non seulement chez les petits mais aussi chez les animaux symptomatiques, soit sur le cerveau, soit sur la moelle épinière 18,19,20,21. Cela est également vrai pour les cultures primaires microgliales, bien que dans une moindre mesure que les astrocytes et principalement à partir de régions du cerveau au stade embryonnaire22,23,24.

Nous utilisons l’imagerie vidéo accélérée de Ca2+ sur des cellules en culture principalement comme moyen de suivre les transitoires intracellulaires de cet ion en tant que marqueur physiologique de l’excitotoxicité. Ainsi, par la caractérisation biophysique de ces transitoires (amplitude, aire sous transitoire, temps de montée, fréquence) le chercheur peut obtenir des paramètres diagnostiques expérimentaux à partir de divers modèles cellulaires de neurodégénérescence. Cette technique offre donc l’avantage d’une évaluation physiologique quantitative des IgG en tant que biomarqueurs de la maladie. Il existe une abondante littérature sur le rôle des IgG et du Ca2+ dans l’induction de la SLA. La plupart de ces études ont été réalisées en induisant la SLA en injectant des IgG à des patients 25,26,27,28,29, qui ont ensuite montré une élévation intracellulaire du Ca 2+ et des dépôts d’IgG. Une série d’études a exploré l’effet des IgG de la SLA sur la synapse motrice in vitro30,31,32. Dans le contexte ci-dessus, la technique présentée ici met l’accent sur les cellules gliales en tant qu’acteurs importants du mécanisme autonome non cellulaire de la SLA et quantifie leur réponse excitotoxique potentielle aux IgG en tant que facteurs humoraux de la neuroinflammation. Cette approche peut avoir une application plus large dans le test d’autres facteurs humoraux tels que les sérums entiers, le LCR ou les cytokines dans différents systèmes de culture cellulaire et dans des modèles cellulaires d’inflammation générale.

Cet article décrit comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser davantage ces cellules pour étudier la physiopathologie de la SLA avec des IgG dérivées de sérums de patients. Les protocoles sont détaillés pour le chargement de colorant des cellules en culture (Figure 1) et les enregistrements des changements de Ca2+ dans les expériences d’imagerie vidéo accélérée. Des exemples d’enregistrements vidéo montreront comment les cellules gliales réagissent aux IgG de la SLA par rapport à l’ATP, ce dernier activant les récepteurs de la membrane purinergique. Pour la première fois, on montre un exemple sur la façon dont les astrocytes isolés du cerveau de rat hSOD1G93A de la SLA réagissent avec une réponse Ca 2+ plus prononcée aux IgG de la SLA par rapport aux témoins non transgéniques et comment relier ce processus aux différences dans le fonctionnement du magasin Ca2+. On montre également un exemple d’imagerie calcique dans les cellules microgliales fortement défiées par les IgG SLA, avec seulement une réponse modeste du calcium intracellulaire.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives de l’UE sur la protection des animaux à des fins scientifiques et avec l’autorisation de la Commission éthique de la Faculté de biologie de l’Université de Belgrade (numéro d’approbation EK-BF-2016/08). En ce qui concerne le matériel du patient (sérum pour les IgG), il a été recueilli pour un examen clinique de routine avec le consentement éclairé du patient conformément au Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki) pour les expériences impliquant des humains. Le protocole a été approuvé par le comité d’éthique du Centre clinique de Serbie (n ° 850/6).

1. Préparation de la culture cellulaire primaire

  1. Isolement des tissus cérébraux
    REMARQUE : L’isolement doit être effectué sur de la glace, en utilisant des solutions glacées.
    1. Utilisez des nouveau-nés âgés de 1 à 3 jours pour la culture cellulaire néonatale primaire33.
      NOTE: Pour l’étude présentée ici, Sprague Dawley hSOD1G93A et des rats non transgéniques ont été utilisés. Pour le génotypage, les queues de rats ont été utilisées pour l’extraction ultérieure de l’ADN et la PCR.
    2. Saupoudrez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70% et décapitez-le immédiatement rapidement à l’aide de ciseaux.
    3. Coupez la peau à l’aide de ciseaux à petit angle pour exposer le crâne. Ouvrez le crâne en faisant une coupe du foramen magnum vers les orbites. Ensuite, faites une coupe perpendiculaire de la ligne médiane. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Petri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Nettoyez les outils entre les petits pour éviter la contamination croisée entre les chiots transgéniques et non transgéniques. L’isolement des cortex du reste du cerveau doit être fait sous un stéréomicroscope.
    4. À l’aide de la pointe de la pince, déchirez les connexions entre les deux hémisphères. Ensuite, séparez les hémisphères avec des pinces incurvées en poussant doucement un hémisphère du centre vers le côté.
    5. Retirez les méninges en les déchirant soigneusement avec des pinces droites et incurvées.
    6. Retirez l’hippocampe en le pinçant avec une pince incurvée. Jetez l’hippocampe ou utilisez-le pour une autre préparation de culture cellulaire.
      REMARQUE: D’autres étapes doivent être effectuées sous la hotte à flux laminaire pour assurer des conditions stériles.
  2. Homogénéisation et dissociation tissulaires
    1. Transférer un cortex dans un tube de 15 mL rempli de 3 mL de PBS froid. Pipeter la suspension de haut en bas avec un embout de 1 mL, en effectuant 10-15 coups jusqu’à ce que la suspension devienne homogène.
      REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.
    2. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de PBS froid en la pipetant de haut en bas avec un embout de 1 mL. Répétez l’étape de centrifugation.
      NOTA: Toutes les solutions utilisées à partir de ce point doivent être préchauffées à 37 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Transférer l’homogénat dans un tube de 2 mL.
    4. Passer l’homogénat à travers des aiguilles de 21 G et 23 G (trois fois chacune) pour faire une suspension de cellules individuelles.
      REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.
  3. Verser la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Petri de 60 mm de diamètre ou une fiole T25 (avec la surface prétraitée avec un revêtement polypeptidique pour la croissance des cellules adhérentes) contenant 3 mL de DMEM complet. Secouez légèrement la boîte de Petri afin que la suspension soit uniformément répartie.
  4. Cultiver les cellules dans l’incubateur dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2/95% d’air à 37 °C.
  5. Changez le milieu 48 h après l’isolement et remplacez le milieu tous les 3 jours.
  6. Pour favoriser la croissance des astrocytes, lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, lavez-les avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS dans le milieu.
    1. Trypsiniser la couche sous-jacente des astrocytes en ajoutant 1 mL de solution de trypsine préchauffée (0,25% trypsine, 0,02% EDTA dans PBS, filtrée stérile).
    2. Placer le plat dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-5 min.
    3. Vérifiez les cellules au microscope. Lorsqu’ils commencent à se détacher, ajoutez 4 mL de DMEM complet.
    4. Prélever la suspension cellulaire et la transférer dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    6. Replaquer les cellules à une densité de 104 cellules/cm2 dans 5 mL de DMEM complet frais.
  7. Changez le milieu tous les 3 jours. Pour minimiser la présence d’autres types de cellules gliales, après que les astrocytes atteignent 50% de confluence et avant chaque remplacement de milieu, laver les cellules avec DMEM complet.
    1. Aspirer le milieu surnageant avec une pipette de 1 mL et le distribuer doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous que toute la surface de la couche cellulaire est couverte pendant cette étape de lavage.
  8. Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence (généralement après 14 jours), répétez la trypsinisation et la collecte des astrocytes comme décrit à l’étape 1.6.
  9. Semence 5 × 103 d’astrocytes sur une lamelle circulaire de verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h.
  10. Pour favoriser la microglie, après l’étape 1.7, permettre aux cellules gliales d’atteindre une couche confluente34. Lorsque des cellules microgliales apparaissent au-dessus de la couche astrocytaire (après 10-15 jours, reconnues par leurs corps plus petits et plus ovales et leurs processus plus courts), agitez la boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant 2 h à 220 tr / min.
  11. Dispersion et ensemencement des cellules microgliales
    1. Lavez légèrement les cellules détachées et lâchement attachées en aspirant le milieu surnageant avec un embout de pipette de 1 ml et distribuez-le doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous de couvrir toute la surface de la couche cellulaire pendant cette étape de lavage, de recueillir le fluide avec les cellules détachées et de le transférer dans un tube de 15 mL.
    2. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu.
    3. Passez la suspension cellulaire à travers une aiguille de 21 G pour obtenir une suspension unicellulaire.
      NOTE: La plupart des méthodes publiées utilisent la trypsine ou la papaïne pour dissocier le tissu; Cependant, les aiguilles de 21 G ont l’avantage d’empêcher la surdigestion des cellules, permettant une dissociation plus douce.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Semer 5 × 103 cellules microgliales sur une enveloppe circulaire en verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h.
      NOTE: Il est difficile d’obtenir une culture microgliale pure par agitation, car les cellules précurseurs des oligodendrocytes et les astrocytes peuvent encore être présents en nombre variable selon l’expérience de l’expérimentateur. Le protocole immunocytochimique utilisé pour estimer la présence de différentes populations cellulaires dans les cultures gliales a été décrit ailleurs35.

2. Immunocytochimie

  1. Rincer les cellules plaquées sur des lamelles de couverture dans PBS, 2 x 1 min.
  2. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante (RT).
  3. Laver en PBS 3 x 5 min.
  4. Incuber dans une solution de blocage contenant 10 % de sérum d’âne normal (NDS)/1 % d’albumine sérique bovine (BSA)/0,1 % de Triton X-100 pendant 45 min à TA.
    1. Ajouter 50 μL d’une solution de blocage par lamelle de couverture de 10 mm de diamètre.
  5. Préparer les anticorps primaires dans 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 dans les dilutions suivantes : souris anti-GFAP 1:300, chèvre anti-Iba1 1:500. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant une nuit à +4 °C.
  6. Rincer dans PBS, 3 x 10 min.
  7. Incuber avec les anticorps secondaires conjugués à un fluorophore : âne anti-souris (excitation 488 nm [1:200)) ou âne anti-chèvre (excité à 647 nm [1:200)). Incuber les cellules pendant 2 h à RT dans l’obscurité.
  8. Lavage au PBS, 7 x 5 min.
  9. Incuber les cellules avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:4 000) pendant 10 min à TA.
  10. Laver en PBS 5 x 5 min.
  11. Monter les lames de couverture sur des lames de microscope à l’aide d’une solution de montage; Utilisez une goutte de celui-ci par feuillet de couverture.
    REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent varier selon le producteur. Les utilisateurs doivent déterminer les dilutions optimales pour leurs expériences.

3. Imagerie vidéo accélérée

REMARQUE: Les solutions contenant le colorant fluorescent doivent être protégées de la lumière directe. Avant de commencer l’expérience d’imagerie, assurez-vous que la lamelle de couverture en verre ne bouge pas lorsque vous allumez la perfusion.

  1. Préparation des solutions et des cellules
    1. Préparer la solution extracellulaire (SEC) pour l’imagerie : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose et 10 mM HEPES. Ajustez le pH à 7,4. S’assurer que l’osmolarité est de 280-300 mOsm/kg et préparer le SEC sans Ca2+ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES, et 0,1 mM EGTA.
    2. Préparer les solutions d’essai : 100 μM d’ATP dissous dans ECS, 1 μM Thg dans ECS sans Ca2+ et 0,1 mg/mL d’ALS IgG dans ECS8.
    3. Transférer une housse dans un plat avec ECS pour laver le DMEM complet. Préparer la solution de chargement de colorant en diluant 1 mM de solution mère de Fluo-4 AM avec ECS à la concentration finale de 5 μM de Fluo-4 AM.
      1. Placer la lamelle de couverture avec les cellules dans la solution de chargement de colorant pendant 30 min à TA dans l’obscurité. Lavez les cellules dans ECS pendant 20 min.
    4. Si les cellules ne sont pas suffisamment chargées (c.-à-d. si le niveau de fluorescence de base est trop faible - <5 % de la plage dynamique de la caméra avec un temps d’exposition supérieur à 400 ms), augmenter le temps de chargement jusqu’à 45 min à 1 h à 37 °C. Vous pouvez également mélanger la solution mère de Fluo-4 AM avec un volume égal de détergent à 20% (p / v) (Pluronic) dans du DMSO avant de diluer dans l’ECS, ce qui rend la concentration finale de Pluronic ~ 0,02%.
      NOTE: Les exemples expérimentaux de cette étude ont été réalisés avec des IgG humaines isolées à partir de sérums sanguins de patients SLA comme décrit précédemment 4,5,11. Chaque expérience a été réalisée avec des échantillons d’IgG d’un seul patient.
  2. Imagerie vidéo
    REMARQUE: Dans ce protocole, le système d’imagerie vidéo a été combiné avec une lampe à arc court au xénon, un système de polychromateur et un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau, la glycérine et l’huile. L’imagerie timelapse a été réalisée à l’aide d’un système d’appareil photo numérique.
    1. Allumez les composants de la configuration d’imagerie 15 min avant l’expérience pour permettre au système d’atteindre la température de fonctionnement.
    2. Placez la lamelle de recouvrement dans la chambre d’enregistrement avec 1 mL de solution de travail (ECS ou ECS sans Ca2+).
    3. Pour choisir le protocole d’imagerie approprié, ouvrez le logiciel d’imagerie et, dans le panneau Acquisition, choisissez les paires de filtres pour Fluo4-AM avec une longueur d’onde d’excitation à 480 nm, un miroir dichroïque à 505 nm et une longueur d’onde d’émission à 535 nm.
    4. Choisissez le champ de vision en prenant soin d’avoir un nombre constant de cellules tout au long de l’expérience. Régler le temps d’exposition et le gain du détecteur de manière appropriée, de manière à ce que le signal ne soit pas saturé. Choisissez le mode pseudocolor pour l’acquisition. Pour des instructions plus détaillées, reportez-vous au manuel fourni par le fabricant.
    5. Ajustez la fréquence d’échantillonnage à 1 Hz (1 image par seconde).
    6. Commencez l’imagerie en acquérant le niveau de fluorescence de base pendant 3-5 minutes pour la détermination de la ligne de base (F0). Assurer un flux constant de la solution de travail.
    7. Arrêtez le flux de la solution de travail et passez à la solution d’essai pendant la durée souhaitée (voir également les barres de temps dans les exemples de la Figure 2 et de la Figure 3). Entre chaque solution d’essai, laver les cellules avec un débit constant de la solution de travail pendant 3-5 min.
    8. Maintenir le volume de la solution dans la chambre d’enregistrement à ~1 mL en organisant une aspiration constante à partir du haut de la solution (voir Figure 2E).
      REMARQUE : Pour appliquer le traitement directement aux cellules imagées, un système d’administration personnalisé constitué d’une pipette en verre (0,8 mm de diamètre intérieur) a été placé à ~350 μm de distance et ~1 mm au-dessus des cellules, à un angle de 45° combiné avec le système d’échange de solution contenant des vannes à pincement et un contrôleur électronique de vanne (voir Figure 2E).

4. Analyse des données

  1. Définissez une région d’intérêt (ROI) qui correspond à la cellule individuelle.
    1. Choisissez l’image avec l’intensité du signal la plus élevée (c’est-à-dire à partir de l’application de l’ATP) et encerclez une cellule à l’aide de l’outil polygonal d’application. Répétez l’opération pour toutes les cellules du champ acquis. Choisissez cinq ROI en arrière-plan à l’aide de l’outil Cercle.
    2. Pour mesurer l’intensité moyenne du signal d’une seule cellule et l’arrière-plan pour chaque période, sélectionnez tous les ROI et utilisez la commande Multi Measure dans ROI Manager dans ImageJ ou toute commande équivalente dans les logiciels commerciaux (voir le Tableau des matériaux).
  2. Exportez les valeurs d’intensité du signal moyen des ROI sous forme de feuille de calcul.
  3. Faites la moyenne de cinq ROI d’arrière-plan et soustrayez l’arrière-plan moyen de chaque image de l’intensité moyenne de ROI de l’image acquise en même temps.
  4. Pour normaliser les données obtenues par rapport au signal de base, utilisez l’équation (1) :
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    où F est l’intensité du signal de chaque période après la soustraction de fond, et F0 est la fluorescence Fluo-4 de base.
    REMARQUE : Un code sur mesure a été utilisé dans cette étude.
  5. Pour analyser l’activité calcique, déterminer plusieurs paramètres4 : l’amplitude du pic calcique (ΔF/F 0), le changement intégré (intégrale temporelle, surface sous l’enregistrement de la réponse) du calcium transitoire (ΔF/F 0 × s), le temps jusqu’au pic-temps écoulé entre le début de la stimulation et le maximum de transitoire(s) calcique(s), le temps d’élévation écoulé depuis le début de la stimulation jusqu’à la valeur de ΔF/F0 qui atteint 50%-80% de l’amplitude maximale (s), demi-largeur-pleine largeur d’un transitoire à demi-amplitude maximale (s), fréquence des réponses si elles sont répétitives (Hz).

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Résultats

Caractérisation de différents types de cellules gliales en culture
Il faut généralement 15 à 21 jours pour produire des astrocytes pour les expériences, tandis que les cellules microgliales prennent 10 à 15 jours pour se développer. Une immunocoloration a été effectuée pour évaluer la pureté cellulaire de la culture. La figure 1 montre l’expression du double marquage du marqueur astrocytaire GFAP et du marqueur microglial Iba1 dans les cultures respectives.

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Discussion

Cet article présente la méthode de culture cellulaire primaire comme un outil rapide et « sur le budget » pour étudier différents aspects de la (physionomie) cellulaire tels que la SLA dans le modèle hSOD1G93A du rat. La technique convient donc à des études au niveau unicellulaire qui peuvent être extrapolées et étudiées plus avant à un niveau d’organisation plus élevé (c.-à-d. dans des tranches de tissu ou chez un animal vivant). La culture cellulaire en tant que technique, cependant, a quelques mises en gard...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le contrat n ° 451-03-9/2021-14 / 200178 du ministère de l’Éducation, des Sciences et du Développement technologique de la République de Serbie, le projet FENS - NENS Education and Training Cluster « Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation » et la subvention EC H2020 MSCA RISE #778405. Nous remercions Marija Adžić et Mina Perić pour avoir fourni les images immunohistochimiques et Danijela Bataveljić pour leur aide dans la rédaction de documents.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 15 mLSarstedt, Allemagne62 554 502
Tube de 2 mLSarstedt, Allemagne72.691
Aiguille 21 GNipro, JaponHN-2138-ET
Aiguille 23 GNipro, JaponHN-2338-ET
Seringue de 5 mLNipro, JaponSY3-5SC-EC
Lamelle en verre circulaire de 6 mmMenzel Glasser, Allemagne630-2113
Boîte de Pétri de 60 mmThermoFisher Sientific, États-Unis130181
ATPSigma-Aldrich, AllemagneA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Allemagne
Albumine sérique bovineSigma-Aldrich, AllemagneB6917
Chlorure de calciumSigma-Aldrich, Allemagne2110
CentrifugeuseEppendorf, Allemagne
DAPISigma-Aldrich, Allemagne10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Allemagne158968
DMEMSigma-Aldrich, AllemagneD5648
Âne-anti chèvre AlexaFluor 647 IgGanticorps Invitrogen, USAA-21447
Âne-anti souris AlexaFluor 488 IgGanticorps Invitrogen,États-Unis A-21202
EDTASigma-Aldrich, AllemagneEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, AllemagneE4378
" evolve"-EM 512 Système d’appareil photo numériquePhotométrie, États-Unis
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, États-Unis10500064
Fidji Logiciel ImageJOpen source sous la licence
FITC jeu de filtresChroma Technology Inc., États-Unis
Sondes moléculaires Fluo-4 AM, États-UnisF14201
Anti-Iba1 pour chèvresFujifilm Wako Chemicals, États-Unis011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
Système d’échange de solutions à grande vitesseALA Scientific Instruments, États-Unis
IncubateurMemmert GmbH + Co. KG, Allemagne
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich, AllemagneM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Souris anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Allemagne324590
Sérum d’âne normalSigma-Aldrich, AllemagneD9663
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich, Allemagne158127
Pénicilline et StreptomycineThermoFisher Sientific, États-Unis15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, AllemagneP5899
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich, AllemagneP5405
Dihydrogénophosphate de potassiumCarlo Erba Reagents, Espagne471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, États-Unis
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich, AllemagneS3817
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich, AllemagneS5886
Phosphate dibasique heptahydratéCarl ROTH GmbHX987.2
Pyruvate de sodiumSigma-Aldrich, AllemagneP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, Royaume-Uni1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, AllemagneT8787
TrypsinSigma-Aldrich, AllemagneT4799
Osmomètre à pression de vapeur Vapro 5520Wescor, ELITechGroup Inc., États-Unis
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Allemagne
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Allemagne
Configuration haute performance VisiViewVisitron System Gmbh, Allemagne
Lampe à arc court au xénonUshio, Japon
publique générale GNU

Références

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957(2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6(2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710(2021).
  7. Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619(2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355(2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209(2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880(2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121(2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573(2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100(2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198(2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

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Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique
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