Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

3.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/63484

⸱

1 février 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique d’imagerie puissante, non destructive et sans étiquette. Une application émergente est l’histologie Raman stimulée, où l’imagerie SRS bicolore aux transitions Raman protéique et lipidique est utilisée pour générer des images de pseudo-hématoxyline et d’éosine. Ici, nous démontrons un protocole pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel pour le diagnostic tissulaire.

Résumé

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est devenue une puissante technique d’imagerie optique pour le diagnostic des tissus. Au cours des dernières années, il a été démontré que le SRS bicolore était capable de fournir des images équivalentes à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) qui permettent un diagnostic rapide et fiable du cancer du cerveau. Cette capacité a permis des applications passionnantes de diagnostic peropératoire du cancer. L’imagerie SRS bicolore des tissus peut être effectuée avec une source laser picoseconde ou femtoseconde. Les lasers femtosecondes ont l’avantage de permettre des modes d’imagerie flexibles, y compris l’imagerie hyperspectrale rapide et l’imagerie SRS bicolore en temps réel. Une approche de focalisation spectrale avec des impulsions laser gazouillées est généralement utilisée avec les lasers femtosecondes pour atteindre une résolution spectrale élevée.

L’acquisition SRS bicolore peut être réalisée avec modulation orthogonale et détection de verrouillage. La complexité du gazouillis, de la modulation et de la caractérisation des impulsions est un goulot d’étranglement pour l’adoption généralisée de cette méthode. Cet article fournit un protocole détaillé pour démontrer la mise en œuvre et l’optimisation du SRS à focalisation spectrale et de l’imagerie bicolore en temps réel du tissu cérébral de souris en mode épi. Ce protocole peut être utilisé pour un large éventail d’applications d’imagerie SRS qui tirent parti de la capacité d’imagerie spectroscopique et à haute vitesse de SRS.

Introduction

Les diagnostics tissulaires traditionnels reposent sur des protocoles de coloration suivis d’un examen au microscope optique. Une méthode de coloration courante utilisée par les pathologistes est la coloration H & E: l’hématoxyline colore les noyaux cellulaires d’un bleu violacé, et l’éosine tache la matrice extracellulaire et le cytoplasme en rose. Cette simple coloration reste la référence en pathologie pour de nombreuses tâches de diagnostic tissulaire, en particulier le diagnostic du cancer. Cependant, l’histopathologie H & E, en particulier la technique de sectionnement congelé utilisée dans un cadre peropératoire, a encore des limites. La procédure de coloration est un processus laborieux impliquant l’incorporation, le sectionnement, la fixation et la coloration des tissus1. Le délai d’exécution typique est de 20 minutes ou plus. Effectuer des H & E pendant le sectionnement congelé peut parfois devenir plus difficile lorsque plusieurs sections sont traitées à la fois en raison de la nécessité d’évaluer les caractéristiques cellulaires ou les modèles de croissance en 3D pour l’évaluation des marges. De plus, les techniques histologiques peropératoires nécessitent des techniciens et des cliniciens qualifiés. La limitation du nombre de pathologistes certifiés par le conseil d’administration dans de nombreux hôpitaux est une contrainte pour la consultation peropératoire dans de nombreux cas. Ces limitations peuvent être atténuées avec les intérêts de développement rapide dans la pathologie numérique et le diagnostic basé sur l’intelligence artificielle2. Cependant, les résultats de coloration H&E sont variables, en fonction de l’expérience du technicien, ce qui présente des défis supplémentaires pour le diagnostic informatisé2.

Ces défis peuvent potentiellement être relevés avec des techniques d’imagerie optique sans étiquette. L’une de ces techniques est la microscopie SRS. SRS utilise des lasers pulsés synchronisés – pompe et Stokes – pour exciter les vibrations moléculaires avec un rendement élevé3. Des rapports récents ont démontré que l’imagerie SRS des protéines et des lipides peut générer des images équivalentes H & E (également connues sous le nom d’histologie Raman stimulée ou SRH) avec des tissus frais intacts, ce qui contourne la nécessité de tout traitement tissulaire, raccourcit considérablement le temps nécessaire au diagnostic et a été adapté en peropératoire4. De plus, l’imagerie SRS peut fournir des images 3D, ce qui offre des informations supplémentaires pour le diagnostic lorsque les images 2D sont insuffisantes5. La SSR est impartiale et génère des images numériques qui sont facilement disponibles pour le diagnostic informatisé. Il apparaît rapidement comme une solution possible pour le diagnostic peropératoire du cancer et l’analyse de la marge tumorale, en particulier dans le cancer du cerveau 6,7,8. Plus récemment, l’imagerie SRS des changements chimiques des tissus a également été suggérée pour fournir des informations diagnostiques utiles qui peuvent aider davantage les cliniciens à stratifier différents types de cancer oustades 9.

Malgré son énorme potentiel dans les applications de diagnostic tissulaire, l’imagerie SRS est principalement limitée aux laboratoires universitaires spécialisés en optique en raison de la complexité associée à la plate-forme d’imagerie, qui comprend des lasers ultrarapides, le microscope à balayage laser et une électronique de détection sophistiquée. Ce protocole fournit un flux de travail détaillé pour démontrer l’utilisation d’une source laser femtoseconde commune pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel et la génération d’images pseudo-H & E à partir de tissus cérébraux de souris. Le protocole couvrira les procédures suivantes :

Optimisation de l’alignement et du gazouillis
La plupart des schémas d’imagerie SRS utilisent des lasers picosecondes ou femtosecondes comme source d’excitation. Avec les lasers femtosecondes, la bande passante du laser est beaucoup plus grande que la largeur de ligne Raman. Pour surmonter cette limitation, une approche de focalisation spectrale est utilisée pour gazouiller les lasers femtosecondes à une échelle de temps picoseconde afin d’obtenir une résolution spectrale étroitede 10. La résolution spectrale optimale n’est obtenue que lorsque le gazouillis temporel (également connu sous le nom de dispersion de retard de groupe ou simplement dispersion) est correctement adapté à la pompe et aux lasers Stokes. La procédure d’alignement et les étapes nécessaires pour optimiser la dispersion des faisceaux laser à l’aide de tiges de verre hautement dispersives sont démontrées ici.

Étalonnage de fréquence
Un avantage de la focalisation spectrale SRS est que l’excitation Raman peut être rapidement réglée en modifiant le délai entre la pompe et les lasers Stokes. Un tel réglage permet une imagerie rapide et une acquisition spectrale fiable par rapport au réglage des longueurs d’onde laser. Cependant, la relation linéaire entre la fréquence d’excitation et le délai nécessite un étalonnage externe. Des solvants organiques avec des pics Raman connus sont utilisés pour calibrer la fréquence Raman pour la focalisation spectrale SRS.

Imagerie bicolore en temps réel
Il est important d’augmenter la vitesse d’imagerie dans les applications de diagnostic tissulaire afin de raccourcir le temps nécessaire à l’analyse des échantillons de tissus volumineux. L’imagerie SRS bicolore simultanée des lipides et des protéines évite d’avoir à régler le laser ou le délai, ce qui augmente la vitesse d’imagerie de plus de deux fois. Ceci est réalisé en utilisant une nouvelle technique de modulation orthogonale et une démodulation à double canal avec un amplificateur de verrouillage11. Cet article décrit le protocole de modulation orthogonale et d’acquisition d’images à double canal.

Imagerie SRS en mode épi
La majorité des images SRS montrées à ce jour sont effectuées en mode de transmission. L’imagerie en mode épi détecte les photons rétrodiffusés du tissu12. Pour les applications de pathologie, les échantillons chirurgicaux peuvent être assez grands. Pour l’imagerie en mode de transmission, le sectionnement des tissus est souvent nécessaire, ce qui nécessite trop de temps. En revanche, l’imagerie en mode épi peut fonctionner avec des échantillons chirurgicaux intacts. Étant donné que le même objectif est utilisé pour collecter la lumière rétrodiffusée, il n’est pas non plus nécessaire d’aligner un condensateur à grande ouverture numérique requis pour l’imagerie de transmission. Le mode épi est également la seule option lorsque la section des tissus est difficile, comme avec les os. Auparavant, nous avons démontré que pour les tissus cérébraux, l’imagerie en mode épi offre une qualité d’imagerie supérieure pour l’épaisseur des tissus > 2 mm13. Ce protocole utilise un séparateur de faisceau polarisant (PBS) pour collecter les photons diffusés dépolarisés par les tissus. Il est possible de collecter plus de photons avec un détecteur annulaire au détriment de la complexité de l’assemblage personnalisé du détecteur12. L’approche PBS est plus simple à mettre en œuvre (similaire à la fluorescence), la photodiode standard étant déjà utilisée pour la détection du mode de transmission.

Génération d’images Pseudo-H&E
Une fois les images SRS bicolores collectées, elles peuvent être recolorées pour simuler la coloration H&E. Cet article démontre la procédure de conversion des images SRS lipidiques et protéiques en images SRS pseudo-H&E pour des applications de pathologie. Le protocole expérimental détaille les étapes critiques nécessaires pour générer des images SRS de haute qualité. La procédure présentée ici n’est pas seulement applicable au diagnostic tissulaire, mais peut également être adaptée à de nombreuses autres applications d’imagerie SRS hyperspectrale telles que l’imagerie médicamenteuse et l’imagerie métabolique14,15.

Configuration système générale requise
Le système laser pour ce protocole doit être capable de produire 2 faisceaux laser femtosecondes synchronisés. Les systèmes sont idéalement dotés d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour le réglage de la longueur d’onde de l’un des faisceaux laser. La configuration de ce protocole utilise un système laser commercial Insight DS+ qui produit deux lasers (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable basé sur OPO, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz. Les microscopes à balayage laser, qu’ils proviennent de grands fabricants de microscopes ou fabriqués à la maison, peuvent être utilisés pour l’imagerie SRS. Le microscope utilisé est un microscope à balayage laser vertical construit sur un cadre de microscope vertical commercial. Une paire de miroirs galvo de 5 mm est utilisée pour scanner le faisceau laser. Pour les utilisateurs qui choisissent d’adopter un microscope à balayage laser maison, reportez-vous à un protocole publié précédemment pour la construction d’un microscope à balayage laser16.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été menées avec des cerveaux de souris fixes et sectionnés de 200 μm, conformément au protocole (# 4395-01) approuvé par l’Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Washington. Les souris de type sauvage (souche C57BL/6J) sont euthanasiées au CO2. Ensuite, une craniotomie est effectuée pour extraire leur cerveau pour la fixation dans 4% de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate. Les cerveaux sont incorporés dans un mélange d’agarose à 3% et de gélatine à 0,3% et sectionnés en tranches de 200 μm d’épaisseur par un vibratome.

1. Alignement initial

REMARQUE: Assurez-vous que la taille du faisceau et la divergence des deux bras sont adaptées pour une sensibilité et une résolution optimales. Collotez la pompe et les faisceaux Stokes et ajustez leurs tailles avant qu’ils n’entrent dans le microscope à balayage laser. Pour ce faire, utilisez une paire de lentilles achromatiques pour chaque faisceau avant de les combiner sur le miroir dichroïque. Portez toujours des lunettes laser appropriées pour l’alignement du faisceau.

  1. Collimation de faisceau
    1. Installez une paire de lentilles achromatiques pour le faisceau de la pompe. Comme point de départ, utilisez un objectif de 100 mm et un objectif de 200 mm pour agrandir la taille du faisceau laser de 2 fois. Assurez-vous que la distance des deux objectifs est d’environ 300 mm. Alignez le faisceau de la pompe à travers le centre des deux lentilles.
    2. Placez un miroir après la deuxième lentille pour envoyer le faisceau vers un mur (>1 m). Faites attention lorsque vous envoyez le faisceau sur de longues distances. Tracez le faisceau du miroir au mur avec une carte IR et vérifiez si le faisceau change de taille. Collotez le faisceau si le faisceau change de taille en fonction de la distance.
      1. Si le faisceau converge (diminution de la taille avec la propagation), rapprochez les deux lentilles.
      2. Si le faisceau diverge (augmentant la taille avec la propagation), éloignez les deux lentilles. Ajustez la distance jusqu’à ce que le faisceau soit collimé.
    3. Répétez les étapes 1.1.1 et 1.1.2 pour que le faisceau de Stokes puisse le coller.
  2. Réglage de la taille du faisceau
    1. Si un profileur de faisceau est disponible, mesurez la taille du faisceau collimé pour chaque faisceau. Vous pouvez également estimer la taille du faisceau à l’aide de la carte IR et d’une règle pour obtenir un diamètre de faisceau de 4 à 5 mm.
    2. Si la taille du faisceau est trop petite ou trop grande, modifiez la paire d’objectifs utilisée à l’étape 1.1. Ajustez la paire d’objectifs jusqu’à ce que les deux faisceaux aient un diamètre de 4 à 5 mm.
      REMARQUE: Le grossissement du faisceau est le rapport entre la distance focale du deuxième objectif et le premier objectif (f2/ f1).
  3. Chevauchement spatial
    REMARQUE: L’imagerie SRS nécessite que les deux faisceaux laser soient combinés dans l’espace et le temps pour exciter les vibrations moléculaires. Un schéma de l’imagerie SRS à focalisation spectrale est illustré à la figure 1.
    1. Combinez les deux faisceaux laser en installant un miroir dichroïque avec plusieurs rétroviseurs de direction pour le réglage. Optimisez le chevauchement spatial de la pompe et de Stokes en surveillant les faisceaux après le miroir dichroïque à deux positions différentes éloignées l’une de l’autre (~1 m). Ajustez de manière itérative le rétroviseur avant le miroir dichroïque et le miroir dichroïque pour aligner le faisceau de Stokes avec le faisceau de la pompe.
      REMARQUE: Si les deux poutres se chevauchent spatialement aux deux positions, elles se chevauchent suffisamment.
    2. Assurez-vous que les faisceaux combinés sont envoyés au centre des miroirs de balayage du microscope à balayage laser en ajustant une paire de miroirs de direction lorsque les miroirs de balayage sont en position stationnée. Assurez-vous que les deux faisceaux traversent le centre de l’objectif du microscope et le condenseur.
    3. Après le condenseur, utilisez une autre paire d’objectifs avec des distances focales de 100 mm et 30 mm, respectivement, pour relayer le faisceau transmis sur la photodiode. Assurez-vous que les deux faisceaux sont contenus dans la photodiode et installez deux filtres passe-bas pour bloquer le faisceau Stokes modulé.

2. Détection du signal SRS

  1. Modulation électrooptique (EOM)
    REMARQUE: La MOE de 20 MHz est utilisée pour moduler l’amplitude de Stokes. Comme nous l’avons vu plus loin, la MOE est dérivée du train d’impulsions laser de 80 MHz, qui est nécessaire pour la modulation orthogonale. D’autres fréquences de modulation peuvent être utilisées si seul un SRS monocolore ou hyperspectral est effectué. Dans ce cas, la synchronisation de la fréquence de modulation à la fréquence laser n’est pas nécessaire. Un générateur de fréquence avec un amplificateur de puissance RF peut être utilisé pour piloter la moe. Par conséquent, les étapes 2.1.1 à 2.1.4 peuvent être ignorées.
    1. Placez un échantillonneur de faisceau dans la trajectoire du faisceau de Stokes pour capter 10% du faisceau et l’envoyer à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 80 MHz.
      REMARQUE: Le signal de photodiode est envoyé à un diviseur de fréquence pour générer une sortie TTL de 20 MHz. Cette sortie est ensuite envoyée dans un tampon de sortie pour répliquer la sortie en quatre sorties identiques de 20 MHz. L’une des sorties est utilisée pour déclencher l’oscilloscope.
    2. Prenez l’une des sorties du tampon de sortie et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir une onde sinusoïdale de 20 MHz. Utilisez un atténuateur RF pour ajuster la tension de crête à crête de sortie à ~500 mV.
    3. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage fin de la phase RF avec une source de tension. Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à la moe électronique.
    4. Débloquez le faisceau de Stokes et optimisez la profondeur de modulation de l’EOM1 en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension de la MOE et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation (rapport vallée/crête) apparaisse satisfaisante.
      REMARQUE: À une modulation de 20 MHz (1/4 du taux de répétition laser), deux impulsions sont attendues toutes les 50 ns.
  2. Chevauchement temporel
    REMARQUE: Le chevauchement temporel de la pompe et de Stokes est obtenu en retardant l’un des deux trains d’impulsions laser avec un catadioptre monté sur un étage de retard (la figure 1 montre le Stokes en retard). Le chevauchement grossier est surveillé avec l’oscilloscope et le chevauchement fin est surveillé par le signal SRS. Un chevauchement temporel fin peut également être obtenu avec un autocorrélateur si disponible.
    1. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser. Bloquez d’abord le faisceau de Stokes. Zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope.
    2. Bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau de Stokes. Traduisez l’étage de retard pour faire correspondre temporellement la position de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente. Voir la figure 2 pour un affichage du chevauchement temporel de deux faisceaux.
      1. (FACULTATIF) Si la translation de l’étage de retard est insuffisante pour faire correspondre temporellement les deux faisceaux, déplacez l’étage de retard au milieu de sa plage de mouvement.
      2. Calculez la distance de retard requise pour faire correspondre les deux faisceaux en prenant la différence temporelle entre les deux faisceaux et en multipliant la différence par la vitesse de la lumière pour trouver la distance nécessaire pour faire correspondre les deux faisceaux temporellement.
      3. Allongez la trajectoire de faisceau du faisceau le plus rapide ou raccourcissez le trajet du faisceau le plus lent pour correspondre à peu près au délai temporel en conséquence.
    3. Préparez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et un couvercle.
    4. Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope. Changez le microscope en éclairage en champ lumineux et observez l’échantillon de l’oculaire. Trouvez le foyer de l’échantillon en trouvant d’abord le foyer à la fois sur la couche supérieure et inférieure de bulles d’air à l’interface verre-ruban, puis déplacez le focus pour qu’il se trouve entre les deux couches de ruban.
      REMARQUE: Assurez-vous que les faisceaux laser sont bloqués avant de regarder dans l’oculaire.
    5. Réglez la sortie du faisceau accordable sur 798 nm. En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique à environ 40 mW chacune pour la pompe et les faisceaux de Stokes au foyer de l’objectif.
    6. Ouvrez ScanImage dans MATLAB (ou un autre logiciel de numérisation qui contrôle le microscope) et cliquez sur le bouton INTITULÉ FOCUS pour lancer la numérisation.
      REMARQUE: Les faisceaux laser seront scannés par raster à travers l’échantillon pour générer une image. La sortie du signal basse fréquence de la photodiode (<100 kHz) est directement envoyée dans le canal 1 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CC). La sortie haute fréquence (>100 kHz) de la photodiode est envoyée dans l’amplificateur de verrouillage et la sortie X du signal de l’amplificateur de verrouillage est envoyée dans le canal 2 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CA).
    7. Réglez le rétroviseur avant le scanner galvo pour centrer le signal CC sur l’écran du canal 1. Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près la sortie de verrouillage affichée sur l’écran du canal 2 (c’est-à-dire le canal CA).
      REMARQUE: Lorsque la pompe et Stokes coïncident dans le temps, un signal apparaîtra sur le canal CA. Il est utile d’ajuster l’échelle de couleurs du canal CA pour afficher le petit changement d’intensité.
    8. Maximisez l’intensité du signal CA en ajustant finement le délai. Ajustez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal CA (tout en gardant le canal CC centré). Ajustez la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal. Voir la figure 3 pour un signal satisfaisant.

3. Optimisation de la résolution spectrale

REMARQUE: La pompe et les faisceaux de Stokes atteignant l’échantillon doivent avoir la même quantité de dispersion de retard de groupe (GDD) pour maximiser la résolution spectrale. La dispersion dépend fortement de la configuration expérimentale. La configuration expérimentale décrite ici utilise des impulsions femtosecondes à 1 040 nm et 800 nm comme Stokes et pompe, respectivement. Les tiges de verre silex denses (H-ZF52A) sont utilisées comme milieu d’étirement par impulsions.

  1. Insérez 48 cm d’une tige de verre hautement dispersive (H-ZF52A ou verre à silex dense équivalent) dans le trajet du faisceau de 800 nm. Estimez le GDD à l’aide de Eq (1) :
    figure-protocol-1 (1)
    REMARQUE: GVD de divers matériaux de verre à différentes longueurs d’onde peut être trouvé à partir de la ressource de la base de données d’indice de réfraction. Par exemple, H-ZF52A a un GVD de 220,40 fs2/mm à 800 nm. Le GDD total est de 105792 fs2.
  2. Calculez combien de cm de tige de verre dispersif doit ajouter à la trajectoire du faisceau de 1 040 nm pour correspondre au GDD de la pompe. Insérez la longueur appropriée des tiges de verre dispersives dans la trajectoire du faisceau de 1 040 nm pour correspondre à peu près au GDD du faisceau de 800 nm. Notez que l’ajout de tiges de verre modifiera le chevauchement temporel des deux poutres et qu’un ajustement du délai peut être nécessaire.
  3. Étalonnage de la résolution spectrale
    1. Créez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO. Placez la lame sur le microscope et vérifiez la puissance des faisceaux sortant du condensateur du microscope. Ajustez la puissance en conséquence pour avoir ~ 40 mW chacun au foyer de l’échantillon.
    2. Ouvrez ScanImage à partir de MATLAB. Trouvez le signal SRS maximal en balayant à travers l’étage de retard, ce qui correspond au pic Raman de 2 913 cm-1 du DMSO. Estimer la position de l’étage en fonction de la position de l’étage précédent avec la longueur de chemin optique accrue due à l’insertion de tiges. Réaligner le chevauchement spatial du faisceau en raison de la petite déviation du faisceau lorsque des tiges de verre sont ajoutées.
    3. Enregistrez un scan SRS hyperspectral en prenant séquentiellement une série d’images SRS tout en déplaçant la scène motorisée.
      REMARQUE: La plage de balayage de retard couvre deux pics Raman, correspondant aux pics Raman de 2 913 cm-1 et 2 994 cm-1 de DMSO, respectivement. Ces deux transitions sont observées lors de l’utilisation d’une pompe de 800 nm et d’un laser Stokes de 1 040 nm.
    4. Tracez les spectres SRS de la solution DMSO à l’aide d’ImageJ ou de MATLAB. Ajuster le grand pic DMSO 2 913 cm-1 à une fonction gaussienne ou lorentzienne dans MATLAB pour calculer la pleine largeur à la moitié maximale (FWHM) du pic.
      REMARQUE : Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 4. Si un seul pic large est présent, cela signifie soit que la résolution spectrale est trop faible pour distinguer les deux pics et que plus de tiges de verre sont nécessaires, soit que la plage scannée était trop petite pour détecter le deuxième pic. En règle générale, une résolution spectrale acceptable DMSO est d’environ 20-25 cm-1 lorsque des tiges de verre d’une longueur de >60 cm sont utilisées. Une résolution plus faible est souvent utilisée pour l’imagerie tissulaire afin d’échanger des signaux plus élevés avec des impulsions plus courtes17.
  4. (FACULTATIF) Utilisez un autocorrélateur ou un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) pour déterminer la durée d’impulsion de chaque bras afin de calculer exactement la quantité de GDD et la longueur des tiges nécessaires pour correspondre au GDD entre la pompe et le Stokes.
  5. Répétez les étapes 3.3.2-3.3.4 pour différentes longueurs de tiges sur le faisceau de Stokes pour trouver la résolution spectrale optimale, ce qui signifie que la meilleure correspondance GDD a été trouvée expérimentalement. Utilisez plusieurs ensembles de tiges de verre de longueur différente pour obtenir une résolution spectrale optimale.

4. Caractérisation du signal au bruit (SNR)

  1. Assurez-vous que l’étape 4.2 est effectuée après un alignement spatial et temporel complet.
  2. Acquérir une image SRS correspondant au pic Raman de 2 913 cm-1 du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre. Utilisez la fonction de mesure pour calculer la moyenne et l’écart-type des valeurs dans la zone sélectionnée.
  3. Divisez la valeur moyenne de la zone sélectionnée par l’écart-type pour trouver la valeur SNR, comme dans Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    REMARQUE: Un bon SNR pour le système (avec une constante de temps de verrouillage de 4 μs) utilisant du DMSO à 40 mw / 40 mw au foyer pour les deux bras est >800. Des concentrations plus faibles de DMSO ou une puissance inférieure peuvent être utilisées pour une estimation plus précise du SNR si la carte d’acquisition de données a une profondeur de bits limitée.
  4. Si le SNR est trop faible, réalignez les impulsions laser pour optimiser le chevauchement spatial, le chevauchement temporel, la correspondance taille/collimation du faisceau et/ou la correspondance de dispersion. Pour un objectif avec un collier de correction d’aberration, optimisez le signal en ajustant le collier de correction.

5. Étalonnage de l’axe de fréquence

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour relier la position de l’étape de retard à la transition Raman numérisée. Une sélection minutieuse des solvants est nécessaire pour générer une « règle Raman » appropriée. Le DMSO est un solvant efficace pour les liaisons CH car il a deux pics Raman aigus à 2 913 cm-1 et 2 994 cm-1.

  1. Enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage d’étages de retard couvrant les pics Raman de 2 913 cm-1 et 2 994 cm-1 du DMSO. Enregistrez les positions de scène correspondant au jeu de données hyperspectral.
    REMARQUE: Le pic maximal global du spectre correspond au décalage Raman DMSO 2 913 cm-1 et le deuxième pic maximal correspond au décalage Raman DMSO 2 994 cm-1 .
  2. Effectuer une régression linéaire pour les positions des étages et les décalages Raman à 2 913 cm-1 et 2 994 cm-1. À l’aide de l’équation de régression linéaire reliant la position de l’étage au décalage Raman, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes.

6. Modulation orthogonale et imagerie bicolore

REMARQUE: L’étape de modulation orthogonale n’est nécessaire que lorsque l’imagerie bicolore en temps réel est nécessaire. Un schéma de ce schéma est illustré à la figure 5. La modulation orthogonale utilise une paire d’EOM entraînés à un quart de la fréquence laser (20 MHz pour le laser 80 MHz) avec un déphasage de 90° entre les deux. Cette étape de modulation orthogonale peut être ignorée pour l’imagerie SRS monochrome ou l’imagerie SRS hyperspectrale.

  1. Modulation EOM1
    1. Installez un PBS (PBS2), une plaque quart d’onde (QWP2) et une deuxième MOE (EOM2) dans le chemin de faisceau de Stokes après la première MOE. Débranchez l’entrée du signal dans EOM2. Branchez l’entrée du signal sur EOM1 et allumez-la.
    2. Moduler le faisceau de Stokes (fixé à 1 040 nm) à 20 MHz (f0/4) en envoyant le faisceau à travers la première MOE. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM1 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
    3. Surveillez la profondeur de modulation en observant les deux polarisations sortant de PBS1 avec deux photodiodes et en affichant la modulation sur un oscilloscope.
    4. Ajustez la tension QWP1, EOM1 et la phase de l’entrée 20 MHz (à l’aide d’un déphaseur) pour optimiser la profondeur de modulation du faisceau transmis à près de 100%. Voir la figure 2B pour une illustration de la bonne profondeur de modulation.
  2. Modulation EOM2
    1. Débranchez EOM1 et branchez EOM2.
    2. Envoyer la sortie haute tension du deuxième amplificateur à 20 MHz à EOM2. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM2 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
    3. Encore une fois, surveillez la profondeur de modulation en regardant les deux polarisations sortant de PBS2 avec un oscilloscope. Ajustez la tension QWP2, EOM2 et le déphaseur selon vos besoins pour obtenir une modulation proche de 100 % pour les deux polarisations.
    4. Assurez-vous que la modulation du train d’impulsions a un déphasage de 90° par rapport à la première modulation.
      REMARQUE: Si les deux trains d’impulsions de la pompe ne sont pas orthogonaux à 90 °, la diaphonie entre les deux canaux sera un problème.
    5. Testez l’orthogonalité de la modulation en allumant et en branchant à la fois EOM1 et EOM2. Surveillez les deux polarisations divisées par PBS2 avec un oscilloscope. Réoptimisez EOM1 et EOM2 individuellement si le train d’impulsions après le deuxième PBS ne ressemble pas à la figure 2C.
    6. Installez un cristal de quartz biréfringent (BRC) de 20 mm et un HWP en aval de l’EOM2. Branchez les deux EOM à la fois et surveillez le train d’impulsions de manière à ce qu’il ressemble à la Figure 2D.
      REMARQUE: Pour le gazouillis utilisé dans cette expérience, un BRC de 20 mm induit un délai qui correspond à un décalage Raman de 80 cm-1 . Une longueur de BRC différente peut être nécessaire si un gazouillis différent est utilisé.
  3. Étalonnage
    1. Calibrez le système à l’aide de DMSO en détectant les signaux de la sortie des canaux X et Y de l’amplificateur de verrouillage (envoyés aux canaux 2 et 3 de la carte d’acquisition de données).
    2. Vérifiez si les signaux générés par le pic de 2 913 cm-1 de la polarisation plus rapide et ceux de la polarisation plus lente sont déphasés à près de 90° sur l’amplificateur de verrouillage. Si ce n’est pas le cas, ajustez l’alignement de la MOE jusqu’à ce que les deux signaux soient déphasés à près de 90°.
    3. Une fois l’étalonnage terminé, trouvez la position de retard qui sonde la transition protéique à 2 930 cm-1 pour l’un des faisceaux orthogonaux. Assurez-vous que l’autre polarisation sonde la transition lipidique de 2 850 cm-1.

7. Imagerie SRS en mode épi

REMARQUE: Dans le schéma d’imagerie en mode de transmission, l’objectif concentre le laser dans l’échantillon, puis une lentille de condensateur dirige le faisceau transmis vers une photodiode pour la détection de verrouillage. Dans le schéma d’imagerie en mode épi, la lumière rétrodiffusée et dépolarisée par l’échantillon est recueillie par l’objectif de focalisation et isolée à l’aide d’un séparateur de faisceau polarisant. Les photons isolés et rétrodiffusés sont envoyés à une photodiode à travers une paire de lentilles relais pour la détection de verrouillage. La figure 6 illustre le schéma d’imagerie en mode épi.

  1. Installez un HWP avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un PBS au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchissant dépolarisé d’atteindre le détecteur.
  2. Utilisez une paire de lentilles composée d’une lentille achromate de 75 mm et d’une lentille asphérique de 30 mm pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif au photodétecteur. Montez le détecteur pour recueillir la lumière rétrodiffusée dirigée par le PBS. Installez un filtre pour empêcher le faisceau modulé d’entrer dans le détecteur.
  3. Placer l’échantillon de tissu sous l’objectif. Comme le condenseur n’est pas nécessaire pour l’imagerie en mode épi, retirez-le si plus d’espace est nécessaire.
  4. Imagerie
    1. Bloquez le faisceau avec un obturateur; faire briller une source de lumière blanche sur l’échantillon de côté; et utiliser le champ lumineux pour trouver une concentration objective.
    2. Débloquez les deux faisceaux et utilisez les positions de retard préétalonnées pour acquérir des images SRS lipidiques et protéiques à partir de tissus à partir des deux sorties de l’amplificateur de verrouillage.
    3. Ajustez le gain de verrouillage et le facteur de bac de pixels pour acquérir des images de bonne qualité.

8. Coloration aux fausses couleurs

  1. Ouvrez la pile d’images avec ImageJ.
  2. Retirez les deux images qui correspondent aux espèces lipidique (2 850 cm-1) et protéique (2 930 cm-1) en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image et en cliquant sur Dupliquer.
  3. Renommez l’image lipidique en lipides et l’image protéique en protéines.
  4. Aller à processus | La calculatrice d’images et les protéines effectuées soustraient les lipides.
  5. Combinez les images en accédant à Image | | de couleur Fusionner les canaux, en mettant les lipides au vert et les protéines au bleu. Ouvrez l’outil Couches d’image (Image | | de couleur Canaux) et ajustez la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste).
  6. Ajustez la luminosité et le contraste de chaque couche à l’aide de l’outil Couches . Pour le canal lipidique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent sombres. Pour le canal protéique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent bleues. Convertissez l’image verte/bleue du canal fusionné en image RVB en accédant à Image | Type | Couleur RVB. Exporter cette image par fichier | Enregistrer sous | Tiff.
    REMARQUE: Pour les fausses colorations H & E, la palette de couleurs montre un cytoplasme rose, tandis que les noyaux sont bleu-violet foncé.
  7. Téléchargez le script HE.m MATLAB à partir de la fausse ressource de script de coloration H&E dans la table des matériaux.
  8. Exécutez le script HE.m dans MATLAB. Sélectionnez l’image RVB exportée de l’étape précédente pour générer une image colorée artificiellement H&E.
  9. (FACULTATIF) Normalisez l’intensité de l’image pour l’imagerie à grand champ de vision, car l’image apparaît plus sombre à la périphérie qu’au centre.
    1. Pour effectuer la normalisation de champ des images, faites la moyenne du plus grand nombre d’images possible. Ensuite, supprimez les fonctions d’intensité avec ImageJ (Process | Filtres | Flou gaussien | Rayon = 50).
    2. Mesurez l’intensité maximale de l’image floue (Ctrl+M). Divisez l’image floue par l’intensité maximale (Process | | mathématiques Diviser). Divisez l’image SRS brute par l’image floue (Process | | de l’image Calculatrice).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Optimisation de la résolution spectrale :
La dispersion à travers un matériau est affectée par le milieu dispersif (longueur et matériau) et la longueur d’onde. La modification de la longueur de la tige de dispersion affecte la résolution spectrale et la taille du signal. Il s’agit d’une relation donnant-donnant qui peut être pesée différemment selon l’application. Les tiges étirent l’impulsion du faisceau d’être large en fréquence et étroite dans le temps à être étroite en fréquence et large dans le ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le schéma d’imagerie SRS bicolore présenté dans ce protocole repose sur la mise en œuvre correcte de l’imagerie SRS monochrome. Dans l’imagerie SRS monochrome, les étapes critiques sont l’alignement spatial, l’alignement temporel, la profondeur de modulation et le déphasage. La combinaison spatiale des deux faisceaux est réalisée par un miroir dichroïque. Plusieurs rétroviseurs de direction sont utilisés pour un réglage fin lors de l’envoi des faisceaux au miroir dichroïque. Une fois les faisceaux combinés avec le miroir...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par NIH R35 GM133435 à D.F.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lentille achromatique 100 mmTHORLABSAC254-100-BLarge bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de l’objectif achromatique, 100 mm
Filtre passe-bande 20 MHzMinicircuitsBBP-21.4+Filtre passe-bande LC regroupé, 19,2 - 23,6 MHz, 50 & Omega ;
Lentille achromatique 200 mmTHORLABSAC254-200-BLarge bande, 650 - 1 050 nm, distance focale de la lentille achromatique, 200 mm
Demi-plaque d’onde achromatiqueOpticWPA2210-650-1100-M25.4 Demi-plaqued’onde large bande
Quart d’onde achromatiqueOpticWPA4210-650-1100-M25.4Échantillonneur de faisceau quart d’onde large bande
THORLABSBSN1110:90
Miroir dichroïqueTHORLABSDMSP1000D’autres dichroïques avec une longueur d’onde centrale d’environ 1 000 nm peuvent être utilisés.
DMSO (Dimethyl sulfoxyde)Sigma Aldrich472301Solvant pour l’étalonnage du décalage Raman. D’autres solvants avec des pics Raman connus peuvent être utilisés.
Modulateur d’amplitude électro-optiqueTHORLABSEO-AM-NR-C1Deux EOM sont nécessaires pour la modulation orthogonale et l’imagerie à double canal. La version résonante est recommandée afin d’utiliser une tension d’entraînement plus faible.
Faux H& E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research LabBuffer 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, pour générer la fréquence d’entraînement EOM et la référence à la
photodiode rapideDétecteur THORLABSDET10A2Si, 1 ns
Rise Time Frequency DividerPRL-220APulse Research LabDiviseur TTL Freq. (f/2, f/4, f/8, f/16), pour générer 20 MHz à partir de la sortie laser.
Tiges de verre hautement dispersives UnionOpticCYLROD01Haute dispersion H-ZF52A Lentille à tige 120 mm, SF11 Lentille à tige 100 mm
Insight DS+NewportSystème laser capable de produire deux lasers pulsés synchronisés (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz.
Amplificateur Lock-In Liquid InstrumentsMoku LabAmplificateur Lock-in pour extraire le signal SRS de la photodiode. Un instrument Zurich Instrument HF2LI ou un instrument similaire peut également être utilisé.
MiroirsTHORLABSBB05-E03-10Miroir diélectrique à large bande, 750 - 1 100 nm. Des miroirs argentés peuvent également être utilisés.
Ecran de retard motoriséZaberX-DMQ12P-DE52Ecran de retard pour le contrôle précis du chevauchement temporel de la pompe et des lasers Stokes. Toute autre scène motorisée devrait fonctionner.
Condenseur à immersion dans l’huileNikonCSC10031.4 NA. D’autres condenseurs avec NA>1.2 peuvent être utilisés.
OscilloscopeTektronixTDS7054Tout autre oscilloscope avec une bande passante de 400 MHz ou plus devrait fonctionner.
DéphaseurSigaTekSF50A2Pour le déphasage de la fréquence de modulation
PhotodiodeHamamatsu CorpS3994-01Diode PIN en silicium de grande surface (10 x 10 cm2). D’autres diodes de grande surface et de faible capacité peuvent être utilisées.
Séparateur de faisceau polarisantOpticPBS9025-620-1000Base
de donnéesd’indices
réflecteurEdmund Optics34-408BBAR Prisme à angle droit. D’autres prismes ou rétroréflecteurs peuvent être utilisés.
Minicircuitsd’amplificateur de puissance RFZHL-1-2W+Bloc de gain, 5 - 500 MHz, 50 & Omega ;
Miroirs à balayageCambridge Technologies6215HNous avons utilisé un ensemble de miroirs de 5 mm avec revêtement argenté
ScanImageVidrioScanImage BasicLaser Logiciel de contrôle de microscope à balayage
Filtre passe-courtTHORLABSFESH100025,0 mm Filtre passe-court premium, longueur d’onde de coupure : 1 000 nm. Pour une suppression efficace des Stokes, deux filtres peuvent être nécessaires.
Microscope droitNikonEclipse FN1N’importe quel autre cadre de microscope peut être utilisé. Si un microscope à balayage laser est disponible, il peut être utilisé directement. Sinon, il fallait ajouter un scanner galvo et un objectif de balayage au microscope.
Objectif d’immersion dans l’eauOlympusXLPLN25XWMP2L’objectif multiphoton 25X a une NA de 1,05. D’autres objectifs similaires peuvent être utilisés.
Union Union verrouillable Union de réfaction refractiveindex.info

Références

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

SRS bicolorefocalisation spectraleimagerie du cerveau de sourisimagerie en temps r elSRS en mode piimagerie des pics Ramanmicroscopie pompe sondequivalent h matoxyline osine
Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.