Isolement et caractérisation des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris micro-disséqués

Résumé

Cette étude utilise la cytométrie en flux et deux stratégies de contrôle différentes sur des plexus choroïdes cérébraux perfusés isolés; ce protocole identifie les principaux sous-ensembles de cellules immunitaires qui peuplent cette structure cérébrale.

Résumé

Le cerveau n’est plus considéré comme un organe fonctionnant isolément; L’accumulation de preuves suggère que les changements dans le système immunitaire périphérique peuvent indirectement façonner le fonctionnement du cerveau. À l’interface entre le cerveau et la circulation systémique, les plexus choroïdes (PC), qui constituent la barrière hémato-céphalo-rachidienne, ont été mis en évidence comme un site clé de la communication périphérique-cerveau. La PC produit le liquide céphalo-rachidien, les facteurs neurotrophiques et les molécules de signalisation qui peuvent façonner l’homéostasie cérébrale. La PC est également un créneau immunologique actif. Contrairement au parenchyme cérébral, qui est peuplé principalement de microglies dans des conditions physiologiques, l’hétérogénéité des cellules immunitaires CP récapitule la diversité trouvée dans d’autres organes périphériques. La diversité et l’activité des cellules immunitaires CP changent avec le vieillissement, le stress et la maladie et modulent l’activité de l’épithélium CP, façonnant ainsi indirectement la fonction cérébrale. L’objectif de ce protocole est d’isoler la PC murine et d’identifier environ 90% des principaux sous-ensembles immunitaires qui les peuplent. Cette méthode est un outil pour caractériser les cellules immunitaires CP et comprendre leur fonction dans l’orchestration de la communication périphérique-cerveau. Le protocole proposé peut aider à déchiffrer comment les cellules immunitaires CP modulent indirectement le fonctionnement du cerveau dans la santé et dans diverses maladies.

Introduction

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du ^19ème siècle, le cerveau a été considéré comme pratiquement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l’émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal et les cellules et signaux immunitaires ^{systémiques1,2,3,4}. En parallèle, d’autres frontières cérébrales telles que les méninges et les plexus choroïdes (PC)....

Protocole

Toutes les procédures ont été convenues avec les lignes directrices de la Commission européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire, directive 86/609/CEE. Ils ont été approuvés par les comités d’éthique n° 59, par le CETEA/CEEA n° 089, sous le numéro dap210067 et aPAFIS n° 32382-2021070917055505 v1.

1. Préparation du matériel

1. Conserver tous les anticorps (Table des matières) à 4 °C, à l’abri de l’exposition à la lumière.
2. Solution mère DAPI (1 mg/mL) : Remettre la poudre en suspension dans pbS^-/- (Table des matériaux), aliquote, et conserver à -20 °....

Résultats

Les analyses de cytométrie en flux présentées ici ont révélé avec succès les principaux sous-ensembles de cellules myéloïdes et T (figure 1 et figure 2, respectivement), ainsi que leur nombre total relatif par souris d’une manière hautement reproductible (figure 3).

L’analyse par cytométrie en flux des cellules myéloïdes a montré que les CP sont peuplées de CD11b⁺ _CX3CR1⁺ .......

Discussion

Les études visant à comprendre les contributions immunologiques à l’homéostasie et à la maladie cérébrales se sont principalement concentrées sur les cellules résidant dans le parenchyme cérébral, négligeant les frontières cérébrales telles que la PC, qui sont néanmoins des contributeurs cruciaux au fonctionnement du ^cerveau2,3. L’analyse des populations de cellules immunitaires au CP est difficile en raison de la petite taille de la CP, du faible nombre de cellu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anti-souris CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Anticorps de cytométrie en flux
Albumine bovine	MP Biomedicals	160069	Réactif bloquant
APC anti-souris CX3CR1	BioLegend	149008	Anticorps de cytométrie
en flux APC anti-souris TCRb	BioLegend	109212	Anticorps de cytométrie en flux
APC-Cy7 anti-souris CD4	Anticorps		de cytométrie en flux
Anticorps anti-souris APC-Cy7 IA-IE	BioLegend	107628	Anticorps de cytométrie en flux
BD FACSymphony A5 Analyseur de cellules	BD Biosciences		Analyseur de cytométrie en flux
BV711 anti-souris Ly6C	BioLegend	128037	Anticorps de cytométrie en flux
Collagénase IV	Gibco	17104-019	Enzyme à dissocier le tissu CP
DAPI	Thermo Scientific	62248	Marqueur vivant/mort
EDTA			Chélateur d’ions
ciseaux fins	FST	14058-11	Outil de dissection
FITC anti-souris CD45	BioLegend	103108	Cytométrie en flux
Anticorps Contrôleur de débit insert de perfusion	CareFusion	RG-3-C	Perfusion sanguine encart
Logiciel FlowJo	BD Biosciences		Logiciel d’analyse
	Pince FST	11018-12	Outil de dissection
Héparine	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Anticoagulant
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Kétamine, anesthésique
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	Billes de contrôle à réaliser compensation
PBS-/-	Gibco	14190-094	Tampon
PBS+/+	Gibco	14040-091	Tampon
PE anti-souris CD8a	BioLegend	100708	Cytométrie en flux
anticorps PE anti-souris F4/80	BioLegend	123110	Anticorps de cytométrie
en flux PE-Dazzle 594 anti-souris CD11b	BioLegend	101256	Cytométrie en flux anticorps
Rompun	Bayer		Xylazine, anesthésique
pince fine	Dumoxel Biologie	11242-40	Outil de dissection
Vetergesic	Ceva		Buprénorphine, analgésique

BioLegend 100414