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Article de méthode

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

4.1K vues

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DOI :

10.3791/63509

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11 février 2022

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1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Dans cet article

Résumé

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Résumé

Les poissons-zèbres présentent une croissance et des capacités de régénération remarquables tout au long de la vie. Par exemple, les niches de cellules souches spécialisées établies au cours de l’embryogenèse favorisent la croissance continue de l’ensemble du système visuel, à la fois dans l’œil et le cerveau. La croissance coordonnée entre la rétine et le tectum optique assure une cartographie rétinotopique précise à mesure que de nouveaux neurones sont ajoutés dans les yeux et le cerveau. Pour déterminer si les axones rétiniens fournissent des informations cruciales pour réguler les comportements des cellules souches tectales et progénitrices tels que la survie, la prolifération et / ou la différenciation, il est nécessaire de pouvoir comparer les lobes tectaux innervés et dénervés chez le même animal et entre les animaux.

L’ablation chirurgicale d’un œil de poisson-zèbre larvaire vivant suivie de l’observation du tectum optique atteint cet objectif. La vidéo d’accompagnement montre comment anesthésier les larves, aiguiser électrolytiquement les aiguilles de tungstène et les utiliser pour enlever un œil. Il montre ensuite comment disséquer les cerveaux des larves de poisson zèbre fixes. Enfin, la vidéo donne un aperçu du protocole d’immunohistochimie et une démonstration de la façon de monter des embryons colorés dans l’agarose à faible point de fusion pour la microscopie.

Introduction

Le but de cette méthode est d’étudier comment l’entrée rétinienne influence la croissance et le développement du tectum optique, le centre de traitement visuel dans le cerveau du poisson-zèbre. En enlevant un œil, puis en comparant les deux côtés du tectum optique, les changements tectaux au sein du même spécimen peuvent être observés et normalisés, ce qui permet une comparaison entre plusieurs spécimens. Les approches moléculaires modernes combinées à cette technique permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la croissance et au développement du système visuel, ainsi qu’à la dégénérescence et à la régénération axonales.

Les systèmes sensoriels - visuels, auditifs et somatosensoriels - recueillent des informations à partir d’organes externes et transmettent ces informations au système nerveux central, générant des « cartes » du monde extérieur à travers le mésencéphale 1,2. La vision est la modalité sensorielle dominante pour presque tous les vertébrés, y compris de nombreux poissons. La rétine, le tissu neural de l’œil, recueille des informations avec un circuit neuronal composé principalement de photorécepteurs, de cellules bipolaires et de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), les neurones de projection de la rétine. Les RGC ont de longs axones qui se frayent un chemin à travers la surface interne de la rétine jusqu’à la tête du nerf optique, où ils fasciculent et voyagent ensemble à travers le cerveau, se terminant finalement dans le centre de traitement visuel dans le mésencéphale dorsal. Cette structure est appelée tectum optique chez les poissons et autres vertébrés non mammifères et est homologue au colliculus supérieur chez les mammifères3.

Le tectum optique est une structure multicouche à symétrie bilatérale dans le mésencéphale dorsal. Chez le poisson-zèbre et la plupart des autres poissons, chaque lobe du tectum optique reçoit une entrée visuelle provenant uniquement de l’œil controlatéral, de sorte que le nerf optique gauche se termine dans le lobe tectal droit et le nerf optique droit se termine dans le lobe tectal gauche4 (Figure 1). Comme son homologue mammifère, le colliculus supérieur, le tectum optique intègre l’information visuelle à d’autres entrées sensorielles, y compris l’audition et la somatosensation, contrôlant les changements dans l’attention visuelle et les mouvements oculaires tels que les saccades 1,5,6. Cependant, contrairement au colliculus supérieur des mammifères, le tectum optique génère continuellement de nouveaux neurones et glies à partir d’une niche de cellules souches spécialisée près des bords médial et caudal des lobes tectaux appelée zone de prolifération tectale7. Le maintien des progéniteurs prolifératifs dans le tectum optique et d’autres régions du système nerveux central contribue, en partie, à la remarquable capacité de régénération documentée chez le poisson-zèbre8.

Des travaux antérieurs examinant le cerveau de poissons aveugles ou borgnes ont révélé que la taille du tectum optique est directement proportionnelle à la quantité d’innervation rétinienne qu’il reçoit 9,10,11. Chez les poissons des cavernes adultes, dont les yeux dégénèrent au début de l’embryogenèse, le tectum optique est sensiblement plus petit que celui des poissons de surface observésétroitement apparentés 9. La dégénérescence de l’œil de poisson des cavernes peut être bloquée en remplaçant la lentille endogène par une lentille d’un poisson de surface pendant l’embryogenèse. Lorsque ces poissons des cavernes borgnes sont élevés à l’âge adulte, le lobe tectal innervé contient environ 10% plus de cellules que le lobe tectal non innervé9. De même, chez les larves de killifish qui ont été incubées avec des traitements chimiques pour générer des yeux de différentes tailles au sein d’un même individu, le côté du tectum avec plus d’innervation était plus grand et contenait plus de neurones10. Les preuves provenant d’expériences d’écrasement du nerf optique chez des poissons rouges adultes indiquent que l’innervation favorise la prolifération, la prolifération des cellules tectales diminuant lorsque l’innervation est perturbée11.

Confirmant et étendant ces études classiques, plusieurs rapports récents fournissent des données suggérant que la prolifération en réponse à l’innervation est modulée, au moins en partie, par la voie BDNF-TrkB12,13. De nombreuses questions ouvertes sur la croissance et le développement du tectum optique demeurent, notamment comment un système sensoriel en développement fait face aux blessures et à la dégénérescence axonale, quels signaux cellulaires et moléculaires permettent à l’entrée rétinienne de réguler la croissance du tectum optique, quand ces mécanismes deviennent actifs, et si la prolifération et la différenciation liées à l’innervation permettent à la rétine et à son tissu cible de coordonner les taux de croissance et d’assurer une cartographie rétinotopique précise. En outre, il existe des questions beaucoup plus vastes sur le développement dépendant de l’activité qui peuvent être abordées en interrogeant le système visuel du poisson-zèbre avec des approches chirurgicales telles que celle décrite ci-dessous.

Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’activité neuronale, en particulier à partir de l’entrée visuelle, modifie la survie et la prolifération cellulaires, l’approche décrite compare directement les lobes tectaux innervés et dénervés (Figure 1) chez les larves individuelles de poisson zèbre. Cette méthode permet de documenter la dégénérescence des axones RGC dans le tectum optique et de confirmer que le nombre de cellules mitotiques est en corrélation avec l’innervation.

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Figure 1: Croquis de larves de poisson zèbre avant et après ablation unilatérale des yeux. (A) Dessin de 5 larves de dpf vues au microscope à dissection. Chaque larve est incrustée dans l’agarose à point de fusion bas et orientée latéralement avant qu’une aiguille en tungstène avec une pointe pointue et crochue ne soit utilisée pour arracher l’œil tourné vers le haut (œil gauche dans cet exemple). (B) Dessin de la vue dorsale d’une larve de 9 dpf résultant de la chirurgie décrite dans A. Seuls trois axones RGC hautement schématisés de l’œil droit sont montrés en train de défasciculer et de se connecter aux neurones du lobe tectal gauche. Abréviations : dpf = jours après la fécondation ; dps = jours après la chirurgie; RGC = cellules ganglionnaires rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Les méthodes décrites dans le présent document ont été menées conformément aux lignes directrices et à l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Reed College et de l’University College London. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les souches de poisson zèbre utilisées dans cette étude.

1. Préparer le matériel et les outils

  1. Trouvez des solutions.
    1. Fabriquer un milieu embryonnaire (E314) en diluant un bouillon de 60x (300 mM de NaCl, 10,2 mM de KCl, 20 mM de CaCl 2-dihydraté et 20 mM de MgCl2-hexahydraté dans de l’eau désionisée, autoclavé et conservé à température ambiante). Ajouter 160 mL de 60x E3 à 10 L d’eau désionisée. Conserver à température ambiante.
    2. Faire 1% d’agarose à faible point de fusion (LMP) dans e3. Dissoudre 1 g d’agarose LMP dans 100 mL d’E3 en faisant bouillir au micro-ondes pendant 1-2 min à haute puissance. Aliquot agarose fondue dans des tubes de microfuge de 1,7 mL et conserver à 4 °C. Faire bouillir au bain-marie et maintenir dans un bloc chauffant à 40 °C lorsqu’il est prêt à être utilisé pour l’encastrement.
    3. Fabriquer la solution isotonique de Marc’s Modified Ringers (MMR15) en diluant un bouillon 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihydraté, 50 mM HEPES, pH ajusté à 7,5 avec 10 M NaOH, puis autoclavé et conservé à température ambiante). Ajouter 10 mL de 10x MMR à 90 mL d’eau désionisée.
  2. Versez les plaques Sylgard selon les instructions du fabricant, en leur permettant de durcir et de sécher pendant plusieurs jours16.
  3. Aiguisez électrolytiquement les aiguilles en tungstène (protocole modifié à partir de 17).
    1. Tout d’abord, préparez une solution de KOH à 10% (p / v) en ajoutant 200 mL d’eau désionisée à un bocal en verre à large bouche avec un couvercle à vis. Incorporer lentement 20 g de granulés de KOH.
      REMARQUE: Cette solution caustique est hautement exothermique. Portez des gants et une protection oculaire et remuez la solution dans la hotte.
    2. Coupez un fil de tungstène de 2 à 3 cm de long et insérez-le dans le porte-aiguille.
    3. Connectez les fils de cathode et d’anode à l’alimentation. Fixez le clip en alligator à l’extrémité du fil cathodique à un trombone partiellement redressé et insérez le trombone dans la solution KOH, en le fixant sur le côté du pot.
    4. Ensuite, fixez le clip en alligator du fil d’anode au cou du porte-aiguille. Allumez l’alimentation (à ~20 V) et plongez le fil de tungstène dans la solution KOH, en tirant le fil hors de la solution à un angle pour aiguiser électrolytiquement le fil en une pointe fine.
      REMARQUE: Les bulles proviendront du trombone au fur et à mesure que la réaction se poursuit.
    5. Vérifiez la pointe de l’aiguille sous le microscope à dissection pour vous assurer qu’elle est suffisamment nette.
    6. Rincez l’aiguille à l’eau désionisée pour éliminer tous les résidus de KOH. Faites plusieurs aiguilles à l’avance et conservez-les jusqu’aux chirurgies et dissections larvaires.
  4. Fabriquez des lames chambrées pour l’imagerie de spécimens de poissons-zèbres avec un microscope confocal vertical.
    1. Procurez-vous des lames de microscope en verre et de la résine époxy en deux parties (voir le tableau des matériaux). Mélangez l’époxy selon les instructions sur l’emballage et peignez des anneaux épais ou des rectangles sur les lames de verre. Laisser durcir et sécher les glissières dans la hotte pendant au moins 24 heures avant utilisation.

2. Collecte et élevage d’embryons

  1. Couplez des poissons mâles et femelles adultes des génotypes souhaités dans des boîtes de reproduction en fin d’après-midi / début de soirée. Le lendemain matin, après qu’ils aient frayé, collectez les œufs nouvellement fécondés avec une passoire à mailles et transférez-les à l’E3 dans des boîtes de Pétri de 100 mm.
  2. Incuber les embryons à ~27,5 °C avec un cycle de lumière de 14 h/10 h d’obscurité jusqu’au jour de la chirurgie. Changez e3 tous les jours ou si nécessaire.
  3. Nourrissez les larves à l’aide d’un compte-gouttes rempli de rotifères récoltés une fois par jour, en commençant soit 5 jours après la fécondation (dpf), soit un jour après la chirurgie. Une fois que les larves ont plusieurs heures à manger, changez l’E3 pour éliminer les rotifères et les déchets restants.
    REMARQUE: Ne nourrissez pas les larves le jour de la chirurgie.

3. Préparer les larves pour la chirurgie

  1. Le jour de la chirurgie, utilisez une pipette Pasteur en verre à large alésage pour transférer 10 à 15 larves dans une boîte de Petri de 35 mm remplie d’E3 frais.
  2. Anesthésier les larves en ajoutant 3-5 gouttes de solution de tricaïne à 0,4% p/v (0,4 g de Tricaïne dissoute dans 210 mM de Tris, pH 9; solution finale ajustée à un pH de 7,4 si nécessaire18) à la boîte pour une concentration finale d’environ 0,0015% p/v de Tricaïne. Recherchez le manque de réponse au toucher pour déterminer si les larves sont correctement anesthésiées. S’ils sont toujours sensibles au toucher après environ 3 minutes, ajoutez 2-3 gouttes supplémentaires de solution de tricaïne à 0,4% p / v et réévaluez.
    REMARQUE: À ce stade de développement, il est possible de surveiller le flux sanguin et la fréquence cardiaque en plus de la motilité sous le microscope à disséquer.
  3. Immobiliser les larves de poisson zèbre anesthésiées en les intégrant dans 1% d’agarose LMP dissoute dans e3.
    1. Tout d’abord, placez le couvercle d’une boîte de Petri de 35 mm face vers le haut sous le microscope à dissection. Ensuite, emmenez une larve dans une pipette Pasteur en verre à alésage étroit avec seulement une petite quantité d’E3.
    2. Ensuite, aspirer environ 200 μL d’agarose LMP fondue, chaude (~40 °C) 1% dans la pipette avec la larve. Enfin, versez la larve et l’agarose sur le couvercle de la boîte de Petri à l’envers.
    3. Utilisez une aiguille en tungstène terne pour manœuvrer rapidement mais doucement la larve afin qu’elle soit latérale, avec un œil tourné vers le haut. Attendez que l’agarose se fixe (~5 min).
      REMARQUE: Si l’agarose durcit alors que la larve n’est pas latérale, libérez-la de l’agarose (comme décrit à l’étape 5) et retournez-la dans le plat avec E3 et tricaïne.

4. Enlèvement des yeux

  1. Une fois que l’agarose est réglée et que la larve est positionnée latéralement, utilisez la pointe d’une aiguille de tungstène très fine et aiguisée électrolytiquement pour percer la peau autour de l’œil, en suivant le bord de l’orbite oculaire.
  2. Ensuite, faites glisser le bord de l’aiguille (pas la pointe) sous l’œil du côté temporal-ventral de l’œil. Utilisez une pression contrôlée pour libérer l’œil de l’orbite.
  3. Utilisez des pinces chirurgicales très fines pour enlever l’œil en pinçant le nerf optique et en poussant l’œil de médial à latéral. Alternativement, continuez simplement à appuyer sur l’œil dorsalement et antérieurement avec le côté de l’aiguille, pour éventuellement trancher à travers le nerf optique et libérer l’œil.
    REMARQUE: Si des tissus autres que l’œil sont accidentellement poignardés pendant la chirurgie, tuez rapidement et humainement la larve par décapitation rapide.

5. Soins postopératoires jusqu’au critère d’évaluation expérimental

  1. Après un retrait oculaire réussi, couvrez l’agarose avec une solution ROR.
  2. Libérez chaque larve de l’agarose en brossant doucement une aiguille de tungstène autour de leur tête, puis autour de leur corps tout en stabilisant le couvercle de la boîte de Petri avec une pince.
  3. Transférer les larves borgnes dans une boîte de Petri de 35 mm contenant du ROR complété par une dilution 1:100 d’un cocktail pénicilline/streptomycine. Incuber les embryons à ~27,5 °C avec un cycle de lumière de 14 h/10 h d’obscurité.
    REMARQUE: Cette solution isotonique de ROR complétée par des antibiotiques aide initialement à la guérison et à la survie des larves. Chaque plat peut contenir jusqu’à 15 larves en convalescence.
  4. Le lendemain, retournez les larves à E3. À partir de l’après-midi suivant la chirurgie, nourrissez les larves (~ 6 dpf et plus) à l’aide d’un compte-gouttes rempli de rotifères récoltés une fois par jour. Après que les larves ont eu plusieurs heures à manger, changez l’E3 pour enlever les rotifères et les déchets restants.

6. Fixation des larves

  1. Une fois que les larves ont atteint le stade de développement souhaité pour l’analyse, anesthésiez-les avec une dose létale de tricaïne (~ 0,4% de concentration finale) jusqu’à ce que leur cœur se soit arrêté.
  2. Pipette jusqu’à 30 larves par tube de microfuge de 1,5 mL. Enlevez l’excès d’E3, puis ajoutez 0,5 à 1 mL de solution fixatrice (4 % de paraformaldéhyde (PFA) et 4 % de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) pour fixer le tissu. Incuber les larves pendant la nuit à 4 °C.
  3. Lavez les larves avec du PBS le lendemain en enlevant le fixateur et en rinçant les larves 3 à 4 fois avec du PBS. Conserver les larves à 4 °C jusqu’à 7 jours avant la dissection.

7. Disséquer les larves pour révéler les cerveaux (adapté de 15)

  1. Suspendre les larves fixes dans des gouttelettes de PBS sur une plaque de Sylgard sous un microscope à dissection. Fixez-les latéralement en plaçant deux broches en tungstène (généralement de vieilles aiguilles en tungstène de moins de 2 cm) à travers la notochorde, avec une broche juste postérieure à la zone pigmentée couvrant la région aorte-gonade-mésonéphros (AGM) et une autre alignée avec l’extrémité de l’extension du jaune.
    REMARQUE: Positionnez les broches en tungstène en aussi peu de tentatives que possible, car le tissu deviendra plus friable à chaque ponction.
  2. Utilisez une aiguille en tungstène très pointue et une pince pointue pour exposer le cerveau en enlevant, dans cet ordre, le ou les yeux, l’oreille, la mâchoire, le tube digestif et la peau crânienne dorsale.
    1. Tout d’abord, retirez l’œil à l’aide d’une technique similaire à l’ablation chirurgicale des yeux à l’étape 4. Ensuite, détachez la larve et retournez-la du côté opposé, afin que l’autre œil soit accessible et répétez. Alternativement, enfoncez l’aiguille à travers la mâchoire de l’autre côté et retirez l’œil sans détacher.
      REMARQUE: Les yeux peuvent être prélevés à ce stade si l’analyse de ce tissu est souhaitée (similaire à 19).
    2. Ensuite, utilisez l’aiguille en tungstène pour gratter du côté temporal au côté ventral de l’oreille. Dans la même action / mouvement, amenez l’aiguille postérieure à la mâchoire et tirez doucement vers l’avant jusqu’à ce que l’oreille et la mâchoire soient enlevées.
    3. Utilisez des pinces pour retirer les organes ventraux et tout jaune restant.
    4. Enfin, faites une incision peu profonde dans la peau crânienne dorsale près de la jonction entre le cerveau postérieur et la moelle épinière. Soulevez la peau avec la pince et tirez-la vers l’avant et autour du télencéphale. Si cela s’avère trop difficile, commencez par l’incision initiale dans le cerveau postérieur et tirez la peau d’abord latéralement, puis ventralement et antérieurement, en prenant grand soin de ne pas rayer les bords latéraux du tectum.
      REMARQUE: Parce que le mésencéphale est l’objet de l’étude, le cerveau postérieur peut être coupé; cependant, une incision profonde peut entraîner une décapitation.
    5. Retirez tout tissu restant avec une pince. Détachez la larve et transférez-la au PBS dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
      REMARQUE: Laissez la queue attachée au cerveau pour une meilleure visibilité lors de l’exécution de protocoles de montage complet.

8. Déshydratation et stockage du cerveau

  1. Retirez le PBS du cerveau et ajoutez 1 mL de PBS contenant 0,1 % de TritonX-100 (PBST). Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
  2. Retirez le PBST et remplacez-le par une solution 50:50 methanol:PBST. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
  3. Lavez le cerveau avec 100% de méthanol (MeOH) deux fois pendant 5 minutes chacun à température ambiante.
  4. Stocker le cerveau dans du MeOH à 100% à -20 °C pendant au moins 16 h avant d’effectuer une immunohistochimie ou d’autres procédures complètes.
    REMARQUE: Les cerveaux peuvent être stockés dans MeOH jusqu’à 2 ans à -20 ° C.

9. Immunohistochimie

REMARQUE: Les protocoles établis pour de nombreuses techniques de montage complet utiles chez le poisson-zèbre peuvent être trouvés sur ZFIN20. Ce manuscrit fournit des exemples comparant des larves borgnes et bi-oculaires qui ont été immunocolorées avec des anticorps qui reconnaissent soit la protéine fluorescente rouge (RFP), qui est exprimée dans les axones du nerf optique dans la lignée Tg[atoh7: RFP] (Figure 2), soit l’histone phosphorylée H3 (PH3), qui met en évidence les cellules mitotiques (Figure 3). Un protocole d’immunohistochimie standard pour les embryons et les larves en grains entiers est résumé ci-dessous.

  1. Tout d’abord, réhydratez les cerveaux larvaires avec une série graduée de lavages MeOH:PBST à température ambiante en incubant les échantillons dans 50:50 MeOH:PBST pendant 5 min, puis dans 30:70 MeOH:PBST pendant 5 min, et en terminant par 3 lavages de PBST.
  2. Pour perméabiliser les cerveaux, incubez-les dans du PBST supplémenté en protéinase K (PK) à une concentration finale de 20 μg/ml pk pendant 30 min à 37 °C. Conserver les aliquotes de 10 mg/mL pk à -20 °C et les décongeler avant utilisation.
  3. Retirez la solution PK et lavez toute enzyme restante en rinçant le cerveau avec pbST 3 fois sur 15 min.
  4. Refixez les cerveaux perméabilisés en les incubant dans 4% de PFA pendant 20 min à 25 °C (ou température ambiante). Ensuite, retirez le PFA et lavez tout fixateur restant en rinçant le cerveau 3 fois sur 15 min avec pbST.
  5. Remplacer le rinçage PBST final par un tampon immunobloquant (IB) fraîchement préparé (10 % de sérum de chèvre normal et 1 % de DMSO dans le PBST) et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
  6. Diluer les anticorps primaires dans un tampon IB à la concentration appropriée (p. ex., 1:500 pour les anticorps RFP et 1:300 pour les anticorps PH3).
  7. Retirez le tampon IB du cerveau et remplacez-le par la dilution de l’anticorps primaire. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec un léger balancement. Assurez-vous que les tubes reposent solidement sur les côtés.
  8. Le lendemain matin, retirez la solution d’anticorps primaire avec une micropipette, rincez plusieurs fois dans du PBST, puis lavez le cerveau dans du PBST à température ambiante pendant 4 x 30 min.
    REMARQUE: Les dilutions d’anticorps primaires peuvent être réutilisées une fois dans les ~ 7 jours si elles sont stockées à 4 ° C.
  9. Rincer le cerveau dans un tampon IB tout en diluant les anticorps secondaires dans un tampon IB à la concentration appropriée (par exemple, 1:500 pour Alexa-fluor 568 anti-lapin).
  10. Retirez le tampon IB et remplacez-le par la dilution secondaire de l’anticorps. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec un léger balancement des tubes reposant sur les côtés.
  11. Le lendemain matin, retirez la solution d’anticorps secondaire, rincez avec du PBST, puis lavez le cerveau dans du PBST à température ambiante pendant 4 x 30 min.
  12. Contre-tache avec 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou ToPro3 (1:5 000 dans PBST à 4 °C pendant la nuit).
  13. Le lendemain matin, transférez les cerveaux larvaires dans PBS et passez aux étapes de montage et d’imagerie énumérées ci-dessous.

10. Montage et imagerie

  1. Fixez une glissière chambrée dans le couvercle d’une boîte de Petri de 100 mm avec de la graisse sous vide.
  2. Transférez les larves immunocolorées et traitées sur une plaque de puits ou une lame de dépression pour les voir avec un microscope à dissection.
  3. Montez les larves sur la lame chambrée en colonnes d’agarose LMP à 1%.
    1. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, placez une larve sur la lame chambrée, en déposant le moins de PBS possible. Avec la même pipette, couvrez la larve avec de l’agarose LMP fondue à 1% (~40 °C).
    2. Avec une aiguille ou une pince en tungstène émoussée, tirez l’agarose dans une colonne, puis positionnez la larve aussi symétriquement que possible, avec la surface dorsale visible.
    3. Répétez cette procédure pour les larves restantes.
    4. Une fois que l’agarose a gelé, couvrez-la de quelques gouttes de PBS, puis placez-la sur la scène du microscope confocal.
  4. Alignez la lentille de l’objectif avec l’échantillon, focalisez le microscope à l’aide de la lumière transmise et éclairez l’échantillon avec les lasers appropriés.
    REMARQUE: Dans cet exemple, des longueurs d’onde de 405 nm et 568 nm ont été utilisées pour exciter DAPI et RFP, respectivement.
  5. Ajustez le gain, le décalage et la puissance du laser en déplaçant les barres de curseur à un niveau approprié par rapport au signal et au détecteur utilisé. Vérifiez les histogrammes de chaque couche et cliquez sur le bouton Indicateur d’état de saturation au-dessus de l’image pour évaluer le niveau d’exposition, en vous assurant qu’aucun des pixels n’est saturé et que le rapport signal/bruit est élevé. Pour un exemple de paramètres d’imagerie confocale optimaux pour la résolution cellulaire et subcellulaire chez le poisson-zèbre, voir 21.
  6. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile de plans z à l’aide de la molette de défilement de la souris pour trouver le haut et le bas de l’échantillon. Cliquez sur les limites supérieure et inférieure pour l’acquisition d’images, puis déclenchez la capture z-stack en cliquant sur le bouton Exécuter maintenant .
    REMARQUE: Selon la symétrie du cerveau, la profondeur z totale pour un cerveau de poisson z larvaire de 9 dpf sera d’environ 150-200 μm.
  7. Traitez et colorisez les images en tenant compte de l’accessibilité daltonienne (par exemple, utilisez le bleu et l’orange ou le magenta et le vert pour les images bicolores). Définissez des tables de choix dans le logiciel utilisé pour capturer les images ou dans un logiciel de traitement d’image tel que Photoshop d’Adobe.
  8. Dans Photoshop, les photomicrographies brutes couleur enregistrées au format TIFF (Tagged Image File Format) 8 bits (i) convertissent le mode Image en RVB et (ii) accèdent à l’option Courbes sous le | Ajuste les menus, puis (iii) fait glisser les sorties de lumière colorée appropriées à 0 ou 255 niveaux pour obtenir la couleur souhaitée. Par exemple, pour obtenir un signal vert, sélectionnez le canal rouge et faites glisser sa sortie sur 0 ; Ensuite, sélectionnez le canal bleu et faites glisser sa sortie sur 0 aussi. De même, pour obtenir un signal magenta, sélectionnez le canal vert et faites glisser sa sortie sur 0; laissez les canaux rouges et bleus tels quels.
    REMARQUE: Des étapes similaires peuvent être effectuées dans le programme gratuit Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Quantifiez manuellement le nombre de cellules affichant un marqueur spécifique à l’aide du plug-in de compteur de cellules dans ImageJ22, disponible sous Analyser dans le menu Plugins. Des exemples d’utilisation d’ImageJ pour le comptage de cellules peuvent être trouvés dans de nombreux tutoriels, y compris 23.
  10. Générez des représentations graphiques de données dans des logiciels statistiques tels que RStudio (voir les données supplémentaires pour . Rmd).

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Résultats

Pour confirmer si l’ablation des yeux était complète et évaluer comment le tectum optique change, des chirurgies ont été effectuées dans la souche Tg[atoh7:RFP], qui étiquette tous les RGC avec un APPEL d’offres ciblé sur la membrane et, par conséquent, tous les axones qui se projettent à partir de la rétine et forment le nerf optique24. Bien que l’utilisation de cette souche ne soit pas absolument nécessaire, elle permet une observation et une visualisation simples des termini du nerf op...

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Discussion

Les techniques décrites dans cet article illustrent l’une des nombreuses approches pour étudier le développement du système visuel des vertébrés chez le poisson-zèbre. D’autres chercheurs ont publié des méthodes pour disséquer la rétine embryonnaire et effectuer des analyses d’expression génique19 ou visualiser l’activité neuronale dans le tectum optique30. Cet article fournit une approche pour explorer comment l’entrée rétinienne différentielle peut influencer les comporte...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le financement de ce travail a été soutenu principalement par des fonds de démarrage du Reed College à KLC, des fonds de bourses de recherche Helen Stafford à OLH et une bourse de recherche scientifique du Reed College à YK. Ce projet a débuté dans le laboratoire de Steve Wilson en collaboration avec les RH, qui ont été soutenues par une bourse d’études Wellcome Trust (2009-2014). Nous remercions Máté Varga, Steve Wilson et les autres membres du laboratoire Wilson pour les premières discussions sur ce projet, et nous remercions tout particulièrement Florencia Cavodeassi et Kate Edwards, qui ont été les premières à enseigner à KLC comment monter des embryons dans l’agarose et effectuer des dissections cérébrales de poisson-zèbre. Nous remercions également Greta Glover et Jay Ewing pour leur aide dans l’assemblage de notre dispositif d’affûtage d’aiguilles en tungstène.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériel et fournitures :
Boîtes d’élevageAquaneeringZHCT100
Dow Corning, graisse sous vide poussé, Sigma ou fournisseur équivalentZ273554
flacons Erlenmeyer (125 mL)Pour la fabrication de Marc’s Modified Ringers (MMR) avec des antibiotiques pour l’incubation post-opératoire.
Pinces fines - Dumont #5Fine Science Tools (FST)11252-20
Pipettes Pasteur en verreDWK Lifescience63A53 & 63A53WTPour le pipetage d’embryons et de larves.
Lames de verre pour la microscopieVWR ou fournisseur équivalent48311-703lames de microscope en verre standard peuvent être commandées auprès de nombreux fournisseurs de laboratoire différents.
Verrerie comprenant des bouteilles graduées et des cylindres graduésPour la fabrication et le stockage
Résine époxy en 2 partiesMatériel ACE ou autre fournisseur équivalent de Gorilla Glue ou seringue équivalente0,85 ozhttps://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Tube de microcentrifugation (1,7 ml)VWR ou fournisseur équivalent22234-046
nickelé (longueur 17 cm)Outils de sciences fines (FST)26018-17Pour tenir le fil de tungstène pendant l’affûtage et la réalisation de chirurgies/dissections.
Passoire à thé en maille de nylon ou équivalentAli Express ou équivalentPour la récolte des œufs de poisson-zèbre après le frai ; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
TrombonePour dispositif d’affûtage d’aiguille en tungstène.
Boîtes de Pétri 100 mmFischer Scientific ou fournisseur équivalent50-190-0267
Boîtes de Pétri 35 mmFischer Scientific ou fournisseur équivalent08-757-100A
Pompe pipetteSP Bel-Art ou équivalentF37898-0000
Hydroxyde de potassium (KOH)Sigma909122Pour dispositif d’affûtage d’aiguille en tungstène. Préparez une solution à 10 % p/v de KOH dans la hotte en ajoutant des granulés à de l’eau déminéralisée.
Alimentation (tension variable)Pour dispositif d’affûtage d’aiguille en tungstène. N’importe quelle alimentation à tension variable fonctionnera (même celle utilisée pour l’électrophorèse sur gel).
Sylgard 184 Kit élastomèreDow Corning3097358
Fil de tungstène (0,125 mm de diamètre)World Precision Instruments (WPI)TGW0515Affûter pour enlever l’œil et disséquer les larves.
Bloc chauffant à température variableThe Lab Depot ou fournisseur équivalentBSH1001 ou BSH1002Réglé sur 40-42 ° ; C avant les expériences.
Pot en verre à large ouverture avec couvercle (par exemple, pot de confiture ou de salsa propre)Pour dispositif d’affûtage d’aiguille en tungstène.
Fils avec filsPour dispositif d’affûtage d’aiguille en tungstène.
Microscopes Microscopes :
quel type fonctionnera, mais il est préférable d’avoir une lumière transmise réglable sur une base réfléchissante.
d’utiliser un microscopeà haute NA, une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20-25x.
Un logiciel de contrôle de microscope et de capture d’images (NIS-Elements by Nikon) est utilisé ici, mais n’importe quel microscope confocal fonctionnera.
Réactifs pour chirurgies et dissections :
Chlorure de calcium dihydratéSigmaC7902pour les bagues modifiées de Marc (MMR) et le milieu embryonnaire (E3).
HEPESSigmaH7006Pour les Sonneries Modifiées (MMR) de Marc.
Agare à bas point de fusionInvitrogen16520-050Produire 1 % dans un milieu embryonnaire (E3) ou des bagues modifiées de Marc (MMR).
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma1374248Pour milieu embryonnaire (E3).
Sulfatede magnésium SigmaM7506pour les bagues modifiées de Marc (MMR).
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences19210Diluer 8 % (p/v) stock avec 2x PBS concentré (dilué à partir de 10x stock PBS).
Pénicilline/StreptomycineSigmaP4333-20MLDiluée 1:100 dans les bagues modifiées Marc’s.
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Diagnostic BioSystemsDMR E404-01Faire 10x stock dans de l’eau déminéralisée, autoclave et conserver à température ambiante. Diluer à 1x la concentration de travail.
Chlorurede potassium SigmaP3911pour les bagues modifiées de Marc (MMR) et le milieu embryonnaire (E3).
Chlorurede sodium SigmaS9888pour les bagues modifiées de Marc (MMR) et le milieu embryonnaire (E3).
Hydroxyde de sodiumSigmaS5881Faites 10 M et utilisez-le pour ajuster le pH du MMR à 7,4.
SaccharoseSigmaS9378
Tricaïne-SPentair100G #TRS1Recette : https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Réactifs pour l’immunohistochimie :
Alexafluor 568 étiqueté Anticorps secondaire pour détecter les IgG de lapinInvitrogenA-11011Utilisation à une dilution de 1:500 pour le montage entier immunohistochimie.
DAPI ou ToPro3Invitrogen1306 ou T3605Compléter des solutions de 1 mg/mL dans du DMSO ; dilution de 1:5 000 pour la contre-coloration.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD8418Un composant du tampon immunobloc.
Méthanol (MeOH)Sigma34860Le mélange de MeOH avec des solutions aqueuses comme le PBST est exothermique. Préparez les solutions MeOH/PBST au moins plusieurs heures à l’avance ou refroidissez-les sur de la glace avant de les utiliser.
Sérum de chèvre normalThermoFisher Scientific50-062ZUn composant du tampon immunobloc. Peut être aliquote dans des volumes de 1 à 10 mL et stocké à -20 ° ;C.
Anticorps primaire pour détecter la phosphohistone H3Millipore06-570Utilisation à une dilution de 1:300 pour l’immunohistochimie complète.
Anticorps primaire pour détecter la protéine fluorescente rouge (RFP ; détecte les dérivés de dsRed)MBL InternationalPM005Utilisation à une dilution de 1:500 pour l’immunohistochimie complète.
Protéinase K (PK)SigmaP2308-10MGPréparer des solutions mères de 10 mg/mL dans du PBS et utiliser à 10 & micro ; g/mL.
Triton X-100SigmaT8787Utile pour faire une solution mère à 20 % (v/v) dans PBS.
Software pour l’analyse de données
ImageJ (Fiji)Freeware pour l’analyse d’images ; https://imagej.net/software/fiji/
RStudioFreeware pour l’analyse statistique et la visualisation de données ; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop ou GIMPDes logiciels propriétaires de traitement d’images (Adobe Photoshop et Illustrator) sont souvent utilisés pour composer des figures. Une alternative gratuite est Gnu Image Manipulation Program (GIMP ; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. Cette étude a utilisé les souches AB, TU, Tg[atoh7 :RFP].Disponible à partir du  ; Zebrafish International Resource Centers aux États-Unis (https://zebrafish.org/home/guide.php) ou en Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Les souches transgéniques spécialisées qui n’ont pas encore été déposées dans l’un ou l’autre des centres de ressources peuvent être demandées auprès de laboratoires individuels après leur publication.
Les de solutions. de Porte-goupille à pince crocodile Microscope de dissection N’importe Il est recommandé confocal à balayage laser

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